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1、高效液相色谱法应用基础教案（本科生用）赵文惠新疆医科大学中心实验室第一章 高效液相色谱法应用基础一 色谱法的历史与发展100多年前，俄国植物学家Tswett分离植物色素时采用的实验方法。一植物色素的石油醚溶液从一根主要装有碳酸钙吸附剂的玻璃管上端加入，沿管滤下，后用是石油醚淋洗，结果按照不同色素的吸附顺序在管内观察到它们相应的色带，就象光谱一样。Tswett把这些色带称为“色谱图”(Chromatogram)，相应的方法叫做“色谱法”(Chromatographic method)。这就是最初的液相色谱，这就是经典的柱色谱。至今为止，这种方法仍然几乎在每一个植物化学试验室均可见到，它被用于从植
2、物提取物中大量制备各种单体，以供药理筛选或结构鉴定或作为制药原料（如雷公藤抗生育有效成分的筛选及雷公藤多甙片的生产）。 图1-4 以CaCO3为固定相、石油醚为流动相的玻璃柱分离系统分离色素的示意图30年代 茨维特分离绿叶色素，产生固液吸附色谱40年代 液液分配色谱法 、TLC、纸色谱50年代 GC出现使色谱具备分离和在线分析功能60年代 推出了色谱质谱联用技术（GC-MS） 70年代 HPLC出现使色谱分析范围进一步扩大80年代 出现了超临界流体色谱法、毛细管电泳法 90年代 崛起的电色谱法，兼有毛细管电泳法与微 微填充柱色谱法的优点 21世纪 色谱科学将在生命科学等的前沿发挥他不可替代的重
3、要作用 二 高效液相色谱原理试样固定相 色谱分析法（chromatography）简称色谱法或层析法，该法是一种物理或物理化学的分离分析方法，主要用于分析多组分样品。该法利用某一特定的色谱系统（如TLC，HPLC或GC系统等），该系统一般包含二相（一为固定相，一为流动相）。利用多组分样品中各组分在不同的两相之间具有不同的分配系数，当两相相对运动时，这些组分在两相的分配反复多次进行，使分配系数有微小差别图 1-2 色谱系统示意图 的组分得到分离。分配系数大的组分保留时间长，较慢地被从色谱柱中被洗脱出来。分配系数小的组分保留时间短，较快地被从色谱柱中被洗脱出来。图 1-2 色谱分离示意图色谱分析法
4、与光谱法、化学分析法的主要不同在于色谱法具有分离及分析两种功能，而光谱法及化学分析法不具备分离功能。色谱法是先将混合物中各组分分离，而后逐个分析，因此它是分析混合物最有效的方法。色谱分析法是利用物质的物理化学性质建立的分离、分析方法。实质：分离方法。目的：定性分析或定量分析三 色谱法分类1、按流动相的物态分:气相色谱(Gas Chromatography, GC)用气体作为流动相(载气)液相色谱(Liquid Chromatography, LC)用液体作为流动相(又叫洗脱剂)2、按固定相的形态分:平面色谱 纸色谱 薄层色谱柱色谱 3、按流动相和固定相的相对极性分:正相色谱(Normal Ph
5、ase Chromatography)固定相的极性大于流动相反相色谱(Reversed Phase Chromatography)固定相的极性小于流动相有机化合物的极性分子间作用力(静电引力,偶极力,色散力,氢键力)综合表现的一种描述注意:此分类法仅适用于液相色谱4、按分离过程的机理分:吸附色谱(Absorption Chromatography)根据样品组分对活性固定相表面吸附亲和力的不同实现分离分配色谱(Partition Chromatography)分离基于样品组分在固定相和流动相中的溶解度(分配系数)不同离子交换色谱(Ion ExchangeChromatography)根据样品组份
6、离子交换亲和力的差异分离,简称离子色谱(IC)体积排除色谱(Size Exclusion Chromatography)GPC(Gel PermeationChromatography)固定相是疏水性凝胶,流动相是有机溶剂iltration CGFC(Gel Fhromatography)固定相是亲水性凝胶,流动相是水溶液四 高效液相色谱法应用领域高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，简称HPLC），是一种在经典液相色谱基础上发展起来的实用、快速，高效及高灵敏度的分离分析方法。广泛应用于各个领域:医药,环保,石化,生命科学,食品工业,农业
7、。第二章 色谱法的基本参数及理论一、保留值(定性参数)1. 保留时间与保留体积保留时间（tR）：从进样到柱后出现浓度最大值所需的时间。保留体积（VR）：从进样到柱后出现浓度最大值所需消耗流动相的体积。VR = tRFc (Fc为流动相的流速)，实验中Fc值的求法：HPLC直接从仪器读取2. 死时间（tM）和死体积（VM）t M：不保留物质从进样开始到柱后出现浓度最大值所需时间。VM：不保留物质从进样开始到柱后出现浓度最大值所需消耗流动相的体积。在以甲醇-水系统为流动相的反相HPLC中，甲醇峰的保留时间可近似看作死时间。HPLC中tM的测法：将流动相中溶剂峰峰的保留时间可近似看作死时间。3. 调
8、整保留时间（tR）和调整保留体积（VR）tR为扣除死时间的保留值tR = tR - tM VR = VR VM k = tR/ tM二、塔板理论（plate theory）为了研究色谱峰形状及评价柱效，建立了塔板理论。将色谱柱假想成由许多塔板所组成，在每个塔板上，组分在两相间达成一次平衡。 经多次分配平衡后，各组分由于分配系数不同而彼此分离。当塔板数足够多时，色谱流出曲线可用高斯（Gaussian）分布表示：C = e 式中C为时间t时组分的浓度，W为被分离组分的重量，tR为对应于浓度极大点时的时间（即保留时间），为标准偏差。此方程的图形如下所示：（一）峰高及峰宽度峰高h为浓度极大值，即图中的
9、AB。峰宽度可用以下三种方法表示：标准偏差：即图曲线拐点处宽度的一半，即EF的一半。半高峰宽Wh/2：（半峰宽，半宽度）即峰高一半处的宽度，如图中的GH，符号，Wh/2 = 2.354。峰宽Wb：从峰两边的拐点作切线与基线相交部分的宽度（I J），又称基线宽度。Wb = 4。（二）理论板数与板高柱效可用理论板数来表示，计算公式如下：n = 柱效通常用单位柱长的理论板数来表达，即每米的理论板数（n/L）。柱效也可以用相当于一个理论塔板的高度表示，即： H = L/n该式的意义是一个理论板所占据的柱长，以毫米（mm）为单位。三、分离度及其影响因素1、分离度（Resolution）分离度(R)用以衡
10、量相邻峰的分离情况，由下式计算R = （注：W = 4）式中tR1及tR2分别为组分1、2的保留时间，W1及W2分别为组分1、2的峰宽。12W1W212tR1tR2对于两个等面积峰，R = 1.5，称基线分离，两组分达99.7%的分离。又称6分离） R = 1，称基本分离，两组分达98%的分离。（又称4分离） R = 1.25，达99.2%的分离。实际工作中，中华人民共和国药典要求“除另有规定，分离度应大于1.5”。影响分离度的因素由上式可知，分离度不仅取决于两组分的保留时间，也取决于其对应色谱峰的宽度。四、 拖尾因子（tailing factor）为保证测量精度，特别当采用峰高法测量时，应检
11、查待测物峰的拖尾因子（T）是否符合该品种项下的规定，或不同浓度进样的校正因子误差是否符合要求。 计算公式：T = 式中，W0.05 为0.05峰高处的峰宽，d1为峰高极大至峰前沿之间的距离。除另有规定，T应在0.95 1.05之间。对称峰T = 1，拖尾峰T 1，前沿峰T 1。五、系统适应性试验（System suitability test）用规定的对照品对仪器进行试验和调整，应达到规定的要求；或规定分析状态下色谱柱的最小理论塔板数、分离度、重复性和拖尾因子。1色谱柱的理论塔板数（n）在选定的条件下，用对照品或内标计算色谱柱的理论塔板数，n = 5.54（2，若达不到规定的理论塔板数，则需更
12、换色谱柱。1、 分离度定量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较好的分离度。计算公式 R = ，除另有规定，R应大于1.5。2、 拖尾因子（tailing factor）（见上页内容）3、 重复性取各品种项下的对照品溶液，连续进样5次，除另有规定外，其峰面积测量值的相对标准偏差应不大于2.0%。也可按各品种校正因子测定项下，配制80%，100%和120%的对照品溶液，加入规定量的内标溶液，配成3种不同浓度的溶液，分别进样3次，计算平均校正因子，其相对标准偏差不应大于2.0%。六、测定法定量测定时，可根据具体情况采用峰面积法或峰高法。测定杂质含量时，须采用峰面积法。1、内标法
13、加校正因子测定含量按各品种项下规定，配成含内标的校正因子测定用对照溶液，进样分析，计算校正因子：校正因子f = 式中：AS为内标的峰面积或峰高，AR为对照品的峰面积或峰高。CS为内标的浓度，CR为对照品的浓度。再取各品种项下，含有内标的供试品溶液进样分析。计算含量：含量（Cx）= f式中，AX为供试品（或杂质）峰面积或峰高；Cx为供试品（或杂质）的浓度。f、AS、CS的意义同上。2、外标法测定含量按各品种项下配制对照品溶液和供试品溶液，进样分析，计算含量：Cx = CR， 式中符号意义同上。3、标准曲线法采用5个以上浓度点制备随行标准曲线，将待测样品的响应值代入标准曲线，计算含量。该方法主要用于各样品中待测物浓度相差很大时采用，如生物样品中待测物的高浓度样品与低浓度样品可能相差几十倍几百倍。标准曲线不一定过零点附： 高效液相色谱仪的结构图10