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1、实验三 植物总DNA的提取一、 原理细胞中DNA主要存在于细胞核内，称为核DNA或染色体DNA，也有人称之为基因组DNA(genomic DNA)，严格地讲，基因组DNA是指单倍体细胞核DNA。细胞质中含有少量的DNA，称为核外DNA或核外基因。主要分布在线粒体及叶绿体内，分别称为线粒体DNA(mtDNA)及叶绿体DNA(ctDNA)。细胞内各种DNA总称为总DNA(total DNA)。根据实验需要可分别提取不同的DNA。植物核DNA的提取主要用于基因文库构建、PCR分析及Southern杂交，也可以提取总DNA进行Southern杂交。核DNA分子呈极不对称的线状结构，一条染色体为一个DN
2、A分子。高等植物核DNA的分子量为1012左右，约含有109bp，就其长度与直径的比例而言，是一个极不对称的分子。如此细长的分子对任何机械力的作用都十分敏感，虽然现在已能够成功地测定出它的一级结构，但到目前为止，仍无法分离纯化出它的完整分子。在分离纯化过程中，DNA分子的降解是很难避免的。因而分离纯化所得到的只不过是植物核DNA分子的片段。采用不同的分离方法，所得的片段大小有所不同。用于Southern杂交的植物DNA样品在长度上应不小于50Kb。线粒体DNA及叶绿体DNA的分子要小得多，分子量约为107，而且为环状结构，因此完整的线粒体DNA及叶绿体DNA的分离并不十分困难，现已有许多报道。
3、核DNA、线粒体DNA、叶绿体DNA的提取一般是先分离出细胞核及细胞器，然后再提取DNA。总DNA的提取不必分离细胞核及细胞器，用温和的方法使细胞破碎后，核蛋白体自然释放出来。（一） 方法概述植物DNA的制备与动物DNA制备原理大致相同，为获得高质量DNA应选取幼嫩组织或组织培养物为材料，由于植物材料中DNase水平低，蛋白质含量较少，其操作要点主要是克服植物次生代谢物如多酚、类黄酮和植物多糖对DNA制备的影响。关于植物总DNA的提取方法有关文献报道很多，但从提取原理上看主要有两种：CTAB法和SDS法。1. CTAB法：CTAB(cetyltrimethylammonium bromide)
4、十六烷基三甲基溴化铵是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中(0.7molL NaCl)是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度(0.3molL NaCl)时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同蛋白质、多糖类物质分开，然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇随之被除去。 CTAB提取缓冲液的经典配方中各试剂的作用：CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；Tris-HCl (pH8.0) 提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；NaCl 提供一个高盐环境，使CTAB与核酸形成的复合物充分溶解，存在于液相
5、中；EDTA螯合Mg2+ 或Mn2+ 离子，抑制DNase活性；- 巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，PVP-K30（聚乙烯吡喏烷酮）可以降低酚化合物的离子化，使酚容易去除。操作的主要程序是植物材料冷冻研磨成粉后，加入高盐提取缓冲液，于56保温若干时间，使细胞破碎，核蛋白体解析，蛋白质变性。提取液中含有- 巯基乙醇可防止材料中的多酚类物质氧化。然后用氯仿异戊醇抽提，去除蛋白类物质。若一次抽提效果不理想，可补加少量高盐、高浓度CTAB溶液，继续用氯仿异戊醇抽提。抽提后的水相，加入不含盐的CTAB沉淀缓冲液，降低溶液的盐浓度使核酸与CTAB形成的复合物沉淀，离心收集沉淀后再将沉淀
6、溶于高盐溶液，然后根据后继实验对DNA纯度的要求，或者通过CsClEB密度梯度离心纯化，去除所有的蛋白质、多糖、RNA、寡核苷酸等不纯物，得到高纯度的DNA样品；或者向溶液中加入RNase，水解去除RNA，然后用氯仿抽提，最后用乙醇沉淀、经洗涤得到不十分纯的DNA样品。这两种处理所得的DNA样品均可直接用于限制性酶切及Southern杂交。只是样品纯度不同，杂交效果有所差异。 CTAB法提取DNA最初用于冷冻干燥的材料。其程序及试剂比例经适当调整也适用于新鲜植物组织及细胞器DNA的提取。用冷冻干燥材料提取时，使用1CTAB提取缓冲液。用新鲜材料提取时使用2CTAB提取缓冲液。实验需要注意的问题
7、是CTAB溶液在15以下会发生沉淀，所以含CTAB的溶液不能在低温下离心。另外CTAB在氯仿溶液中有少量的溶解，因而在用氯仿抽提后须用含0.7molL NaCl、10CTAB的溶液进行补充，以维持体系中的CTAB浓度在正确水平上。加入沉淀缓冲液后如果不发生沉淀，则表明盐浓度较高，可用沉淀缓冲液稀释。CTAB与核酸的复合物发生沉淀时，多糖、色素、多酚类化合物不应发生沉淀，所以得到的DNA沉淀应为白色或灰白色。有时提取的产物带有颜色，限制性内切酶酶切困难，这是因为材料中含有较多的多酚类物质，该类化合物氧化后易与DNA共价结合呈现褐色并抑制酶切反应，遇到这种情况时可以提高提取缓冲液中巯基乙醇的含量(
8、提至25)，并尽可能选用幼嫩的材料。另外离心收集CTAB与核酸形成的复合物沉淀时注意不要过度离心，否则所得的沉淀再溶解困难。 与下面介绍的SDS法相比，CTAB法的最大优点是能很好地去除糖类杂质，对于含糖较高的材料可优先采用。该法去多糖的原理：CTAB具有从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，在这种条件下，蛋白质和中性多聚糖留在溶液中。在高离子浓度下，CTAB与蛋白质和除大多数酸性多聚糖以外的多聚糖形成复合物，但不能沉淀核酸。在一定的盐浓度下，DNA、蛋白质与多糖在CTAB溶液中溶解度不一样而达到去多糖的目的。该方法另一个特点是在提取的前期能同时得到高含量的DNA及RNA，如果后继实
9、验对二者都需要，则可分别进行纯化，如只需要DNA则可用RNase水解掉RNA。2. SDS法：SDS（sodium dodecyl sulfate）十二烷基硫酸钠是一种阴离子去污剂，能在较高温度(55-65)条件下裂解细胞，使染色体离析，蛋白质变性，释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的作法使蛋白质及多糖杂质沉淀(最常用的是加入5molL的KAC于冰上保温，在低温条件下KAC与蛋白质及多糖结合成不溶物)，离心除去沉淀后，上清液中的DNA用酚氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。 在使用上述方法的过程中，一些实验者根据从不同植物材料提取DNA时所遇到的问题，对具体方法进行了各种改进，
10、最典型的是对于细胞破碎较困难的植物材料在使用SDS时辅以蛋白酶K，使SDS与蛋白酶K在EDTA存在下共同破碎细胞。蛋白酶K是从霉菌中制备的，它具有很强的水解蛋白质的能力，作用范围也很广，在SDS及EDTA溶液中仍具有活性，这是该酶的一大特点，故可以将其与SDS合用，有人将这种方法称为SDS-蛋白酶K法。再如对于含多酚类物质较多的植物，如马铃薯、番茄等，在提取液中加入6的PVP(聚乙烯吡咯烷酮)，PVP可与多酚类物质结合形成复合物，再经离心而被除去，还有的在提取缓冲液中加入8molL的尿素代替SDS等。 SDS法操作简单，温和，也可提取到分子量较高的DNA，但所得产物含糖类杂质较多。该方法所得的
11、DNA样品也可直接用于Southern杂交，但在限制性内切酶消化时需加大酶用量，并适当延长反应时间。最后需说明的是，用该法提取的DNA如果因后继实验在纯度上的要求，必须用氯化铯密度梯度离心纯化的话，那么提取时应用Sarkosyl(十二烷基肌氨酸钠)代替SDS。因为Sarkosyl能溶解在低浓度的氯化铯溶液中。 植物细胞具有细胞壁，植物总DNA提取时如何在使植物细胞壁有效破碎的同时尽量保持DNA的完整，是提取的重要一环。许多细胞破碎的方法都会引起DNA严重的机械断裂，因而植物DNA提取时很难在产品的质量(长度)及产量之间都达到满意的结果。国外文献中多用冷冻干燥的材料进行提取，因冷冻干燥的材料很容
12、易粉碎，研磨时组织破碎效率高，而且在冷冻干燥状态下，DNase活力极低，研磨时不会引起DNA降解。同时，冷冻干燥又是保存植物材料的最好方法，冷冻干燥的材料在脱水的状态下贮存几年，DNA都不会有明显的变化，可以在植物各个生理状态下分别取材，经冷冻干燥后保存到需要的时候一同提取DNA。但由于制备冷冻干燥的材料需要冻干机，使这种方法在一般实验室使用受到限制。1976年国外报道了将植物材料小块置液氮中冷冻，并在冷冻状态下研磨成粉，然后再加入去污剂、蛋白酶等试剂，使细胞充分破碎的方法，效果比较理想。很快，这种植物细胞破碎的方法被广泛采用。采用这种方法时，操作中应注意以下几个问题：当植物材料表面或内部含有
13、较多水分时，液氮冷冻会形成冰晶而妨碍研磨。所以，在液氮冷冻前，植物材料表面的水分一定要用滤纸吸干。对于含水量大的新鲜植物材料，如某些植物叶片、疏松的愈伤组织，冷冻前用乙醇擦拭，使之部分脱水。研磨使用的器皿(包括角匙)要在液氮中预冷，研磨的全过程均应在冷冻状态下进行，不允许材料在研磨过程中融化，为保持材料的冷冻状态。研磨过程中可断续向研钵内加入液氮，但这种操作常会因添加液氮过猛而使材料被冲散出容器，很难再收集，尤其是在研磨后期很容易发生，所以要注意轻缓地操作。另外，在液氮中的材料不好研磨，只有在液氮蒸发殆尽时，才好研磨，所以建议采用将研钵置液氮浴中，断续向研钵外添加液氮的作法，可以克服上述问题。
14、样品研磨成粉后，在加入提取缓冲液前必须保持其冷冻状态，如果融化，内源DNase会引起DNA降解，严重影响提取效果。DNA降解主要来自提取过程中的物理因素及DNase活性，因此防止DNA降解要从这两方面出发。物理因素主要是机械剪切力，溶液在震荡、搅拌、转移、反复冻融、渗透压骤变及细胞急剧破裂内容物外泄时都会产生强的机械剪切力，因而提取时的各种操作均应温和地进行，避免剧烈振荡，转移DNA溶液的枪头要剪去尖部，扩宽管口，吸取过程中避免产生气泡，尽量避免用反复吸打的方法助溶DNA沉淀等。为防止DNase的降解作用，提取时使用的器具、研钵、离心管、溶液等要经过高压灭菌。由于DNase以Mg2+、Ca2+
15、二价离子为激活剂，所以在提取液中需加入二价离子螯合剂EDTA来消除外源及内源的酶活性。（二） 植物总DNA提取的实验设计1. 提取方法选定 植物总DNA提取的方法很多，实验前要根据植物材料的情况及选用的检测方法来确定。如果采用PCR扩增鉴定转化体，或先经PCR扩增，然后再进行Southern杂交检测时，可选用快速微量的SDS法，因PCR技术对DNA样品量及纯度的要求均不高，甚至可以直接用组织匀浆进行扩增，同时又因PCR具很高的灵敏性，为防止试剂交叉污染，应尽量减少提取步骤。如果直接采用Southern杂交来鉴定转化体，由于Southern杂交对DNA样品的数量及质量要求都较高，需要的样品量在5
16、15g，而且要较纯，所以对于含酚类物质及糖类物质较高的植物材料，采用CTAB法是比较理想的。CTAB法可以不通过氯化铯密度梯度离心使DNA与绝大部分多糖类物质分离，并能获得大于50Kb的较纯的DNA分子。同时该方法对材料数量的要求也不苛刻，单个胚、胚珠，或是毫克量的干燥植物材料都能通过CTAB法提取出供杂交使用的DNA，所得的DNA样品可以在几小时内被限制性内切酶消化。2. 实验材料准备 检测外源基因是否整合及分析整合情况时，均需有严格的对照。因而实验前不仅要准备好经转化处理的待测材料，而且还要准备好未经转化处理的阴性对照材料。两种材料的生理状态及取材部位要相同，并应以同样的方法提取。3. 植
17、物材料量及DNA样品量 DNA提取前首先要考虑的问题是DNA的提取量，即提取多少DNA样品够检测时使用，而提取这些DNA又需要多少植物材料。这是实验设计中的重要一环。检测时所需植物DNA的样品量是由检测方法的最小检出量及被检基因在基因组中的含量决定，而所需的植物材料的量则由所需的DNA样品量及所用的提取方法对该种植物材料的DNA产率决定。 表2-1中列出了一些植物材料的DNA提取产量及细胞基因组的大小,供实验参考,表中产量表示每毫克鲜重的植物材料可获得的DNA ng 量。胚、子叶指单个的胚及子叶。另外腊叶植物叶片的DNA产量为1090ng/mg。（三） 植物DNA样品纯度及浓度的检测 用于So
18、uthern杂交的植物DNA样品在纯度、长度及浓度上均应达到一定的要求。纯度上应无蛋白质、RNA、多糖及抑制限制性酶切的杂质，如酚类物质、丹宁、类萜、色素等，并无提取时所用的试剂如酚及盐离子的残留。在长度上不应低于50kb，浓度应在051g/l之间，所以提取的DNA在用于酶切前必须检测其纯度及浓度。目前主要采用琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度法进行检测。1. 琼脂糖凝胶电泳检测制备0.8的微型琼脂糖凝胶，取适量的被检DNA样品及分子量标准DNA同时电泳，电泳后于紫外光下检测，所提植物DNA应呈现出一条分子量较大的清晰条带，其迁移率应小于分子量标准样品DNAHindIII 中23kb条带的迁移率。如
19、果所提DNA样品出现长带状弥散荧光，则表明提取过程中DNA已严重降解，出现此现象时应从下列几方面查找原因。所用的器皿及应灭菌的试剂是否已灭菌。材料收集后是否立即冷冻，研磨过程中或研磨后进入提取液前是否发生融化。操作中是否出现剧烈振动，吸管口过窄，产生气泡，反复吸打及冻融等问题。如果在溴酚兰处出现明亮的荧光区，则表明样品中含有较多的RNA这时可用RNase消化，消化后用氯仿抽提，乙醇沉淀的方法纯化。如果在样品槽内有荧光出现，可能样品中DNA未完全溶解或浓度过高，或样品不纯，有大量带正电荷的杂质与DNA样品结合。 至于样品浓度，对于清晰的条带，可通过与标准DNA样品的荧光亮度相比较来估计，例如使用
20、单一分子量标准DNA的浓度为0.5g/l，点样量为2l，则DNA量为1g。亮度与其相同的条带，DNA量大致相同。2. 紫外分光光度法测定纯净的DNA溶液是透明的，用紫外分光光度计测定其260nm及280nm的吸收值比应为1.8。260nm及230nm的吸收值比应大于2.0。若OD260OD280大于1.8，表明样品中含有较多的RNA，这时应该用RNA酶重新处理样品，若比值小于1.6，则说明样品中蛋白质杂质较多或混杂有提取时所用的酚试剂。这时需要用氯仿重新抽提样品进一步去除蛋白质杂质及酚。氯仿抽提后，一定要用水饱和的乙醚再抽提一次。这样可以除去残留的氯仿，由于乙醚比水轻，含DNA样品的水相在下层
21、，将含DNA的水相吸出，置68水浴中数分钟，可使残留的乙醚蒸发，最后用乙醇沉淀DNA。OD260OD230小于2.0时，表明溶液中有残存的小分子及盐类杂质。可增加70 乙醇洗涤DNA沉淀的次数。这样处理12次后可得到比值在1.8左右的纯净DNA样品，得到较纯的DNA样品后，应根据其在260nm的吸收值，确定样品的DNA浓度。50g/l 的双链DNA对260nm紫外光的吸收值为1.0。凡是浓度大于0.25gm1的纯净DNA样品均可按此关系，由其OD260值求出其浓度。测定时需要注意：光源使用是否正确。必须使用石英比色杯。以dH2O或TE为空白溶液。表1 新鲜植物组织中的DNA产量组织种基因组大小
22、（pg）DNA产量（ng/mg）叶片烟草（幼嫩）3.938碧冬茄属杂交种（幼嫩）2.014夏小麦（萎垂）15.745夏小麦（幼嫩）15.752蚕豆（幼嫩）13.240葡萄（开始衰老的）0.4玉米（成熟）4.040玉米（苗）4.049全苗南芥菜属0.088.0悬浮培养烟草（NT-1）3.910全种子/谷粒洋葱16.555西瓜1.11.0大豆0.95.5大麦5.59.6菜豆182.2豌豆5.018夏小麦15.722玉米4.018胚胎和胚轴西瓜1.142甜瓜1.013南瓜1.314大豆0.955大麦5.524菜豆1.833豌豆5.058夏小麦15.715蚕豆13.277玉米4.033子叶西瓜1.10
23、.3豌豆5.043蚕豆13.241胚乳大麦5.54.6夏小麦15.74.2玉米4.01.0花粉雪松20蚕豆13.2200玉米4.02.5产量以每毫克初始组织含ng DNA形式给出。所有的组织以鲜重称量。*本表译自Plant Molecular Biology Manual A6:1-10(1988)测定时因比色杯最小的容积为0.5mL，微量制备的样品总体积不过2050l，因此应从所制备的样品中取出少量稀释后进行测定，根据稀释样品的吸收值及稀释倍数计算出原样品的DNA浓度。若样品中含有较多RNA及核酸降解物杂质时，是不能用紫外吸收法测定其浓度的。因为此时测定的OD值并不完全由DNA产生。这时样品
24、DNA的含量应该用二苯胺法测定。（四） 植物DNA样品的保存根据所测的样品DNA浓度，用无菌ddH2O将样品稀释或浓缩成0.51.0mgmL的浓度。高分子量的DNA溶液在4条件下可贮存数周，所以近期使用时不必进行低温冷冻，需要长期贮存时，可置-20冷冻，但冷冻样品从冰箱中取出时必须立即置碎冰上，令其缓慢解冻，以防止DNA分子断裂。为防止溶液融化时引起的DNA断裂，也可以将DNA样品以乙醇沉淀的形式保存在-20。二、实验方法（一） 从动物组织提取基因组DNA1. 材料哺乳动物新鲜组织。2. 器材研钵、液氮、带盖离心管、移液管、高速冷冻离心机、台式离心机、水浴锅。3. 试剂 (1) 分离缓冲液：1
25、0mmolL TrisC1(pH7.4)，10mmolL NaCl，25mmolL EDTA。 (2) 其他试剂：10SDS、蛋白酶K(20mgmL或粉剂)、乙醚、无水乙醇、70乙醇、酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)、5molL NaCl、3molL NaAc、TE。4. 操作步骤(1) 切取组织5g左右，剔除结缔组织，用吸水纸吸干血液，剪碎放入研钵(越细越好)。(2) 倒入液氮，磨成粉末，加10mL分离缓冲液。 (3 ) 加l mL 10SDS，混匀，此时样品变得很粘稠。 (4) 加50L或l mg蛋白酶K，37保温12小时，直到组织完全解体。(5) 加l mL 5mol/L NaCl，混
26、匀，10000rpm离心数秒钟。 (6) 取上清液于新离心管，用等体积酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)抽提。待分层后，10000rpm离心5分钟。 (7) 取上层水相至干净离心管，加两倍体积乙醚抽提(在通风情况下操作)。 (8) 移去上层乙醚，保留下层水相。 (9) 加1/10体积3mol/L NaAc及两倍体积无水乙醇，颠倒混合沉淀DNA。室温下静置10-20分钟，DNA沉淀形成白色絮状物。 (10) 用玻璃棒钩出DNA沉淀，于70乙醇中漂洗后在吸水纸上吸干，溶解于1mLTE或ddH2O中，-20保存。 (11) 如果DNA溶液中有不溶解颗粒，可在5000rpm短暂离心，取上清；如要除去其
27、中的RNA，可加5u1 RNaseA(10g/1)，37保温30分钟，用酚抽提后，按步骤(9)(10)重沉淀DNA。（二） 细菌基因组DNA制备1. 材料细菌培养物。2. 器材研钵、液氮、带盖离心管、移液管、高速冷冻离心机、台式离心机、水浴锅。3. 试剂(1) CTABNaCl溶液 4.1g NaCl溶解于80mL H2O中，缓慢加入10gCTAB，加水至100mL。(2) 其他试剂 氯仿：异戊醇(24：1)，酚：氯仿：异戍醇(25 ： 24：1)，异丙醇，70乙醇，TE，10SDS，蛋白酶K(20mgL1或粉剂)，5molL NaCl。4. 操作步骤(1) 100mL细菌过夜培养液，6000
28、rpm离心2分钟，去上清液。(2) 加9.5mL TE悬浮沉淀，并加0.5mL 10SDS，50L20mgmL(或lmg干粉)蛋白酶K，混匀，37保温1小时。(3) 加1.5mL5molL NaCl，混匀。(4) 加1.5mLCTABNaCl溶液，混匀，65保温20分钟。(5) 用等体积酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)抽提，5000rpm离心10分钟，将上清液移至干净离心管。(6) 用等体积氯仿：异戊醇(24：1)抽提，取上清液移至干净管中。(7) 加等体积异丙醇，颠倒混合，室温下静置10分钟，沉淀DNA。(8) 玻璃棒捞出DNA沉淀，用70乙醇漂洗后吸干，溶解于lmL TE中，20保存。如
29、DNA沉淀无法捞出，可5000rpm离心，使DNA沉淀。(9) 如要除去其中的RNA，可以按本章第三节中操作步骤处理。(三） 植物总DNA提取(CTAB法)1. 材料植物的根、茎、叶、愈伤组织、悬浮细胞、原生质体等新鲜组织或冷冻干燥的材料。2. 器材研钵、液氮、带盖离心管、移液管、高速冷冻离心机、台式离心机、水浴锅。3. 试剂(1) CTAB提取液： 100mmol/L Tris-HCL(pH8.0)1.4mol/L NaCL20mmol/L EDTA2% CTAB(2) PVP-K30(聚乙烯吡咯烷酮)。(3) 其他试剂：酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，无水乙醇及70乙醇，异丙醇，TE缓
30、冲液，3mol/L NaAc溶液。4. 操作步骤(1) 50mL离心管中加入10mL提取缓冲液，65预热。(2) 取12g新鲜幼嫩叶片，去除叶脉，于液氮中迅速研磨成粉，研钵中预先加入 0.1gPVP及少许石英砂。(3) 将冻粉迅速转入提取缓冲液中涡旋震荡混匀，于65保温30分钟，期间振荡23次。(4) 取出离心管，冷却至室温，加入等体积的氯仿/异戊醇，轻缓颠倒混匀，10000r/min离心10分钟。(5) 转移上清液于另一50mL离心管，加入等体积异丙醇，轻轻颠倒，12000r/min离心10分钟。(6) 70乙醇洗涤2次，每次2mL，室温下微干，溶于0.5mLTE缓冲液中，转移到1.5mL离
31、心管中。(7) 加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），颠倒离心管数次，12000r/min离心5分钟。(8) 小心地用移液器将上层溶液转移到另一离心管，加等体积的苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），颠倒混匀，12000r/min离心5分钟。(9) 将上清移入干净离心管，加入1/10体积的3mol/LNaAc溶液，再加2倍体积冷无水乙醇，混合后室温放置10分钟。(10) 12000r/min离心10分钟，沉淀用70乙醇洗3次，将离心管倒置滤纸上干燥。(11) 用适量TE缓冲液回溶DNA。如要除去其中的RNA，可加5u1 RnaseA (10g/L)，37保温30分钟，用酚抽提后，按
32、步骤(8)(10)重沉淀DNA。思考题：1. 选择DNA纯化策略时，需要考虑的关键问题有哪些？2. 怎样提高DNA纯化的质量？3. 如何最大限度地延长纯化DNA的储存寿命？实验十 PCR 基因扩增一、原理 1985美国PE-Cetus公司的Mullis等人建立了一种大量快速扩增特异DNA片段的系统，称之为聚合酶链式反应（PCR, polymerase chain reaction）。由于这一技术在分子生物学以至整个生命科学领域的广泛应用，Mullis获得了1993年诺贝尔化学奖。它的实质就是一个体外酶促DNA复制反应体系，包括模板DNA、引物（对）、热稳定DNA聚合酶、dNTP和反应缓冲液。一
33、般PCR反应可扩增1005000bp的目的DNA片段。一个PCR反应包括了三个步骤：变性（denature）、退火（annealing）和延伸（extention）。在94下模板热变性而双链解开；继而将反应体系降低温度使DNA复性，若模板DNA和引物有足够长度互补序列，则引物链可以和互补的模板链特定区域结合形成杂交分子；在72保温一定时间，在DNA聚合酶的催化下，从引物3不断合成模板链的互补链。经过连续的重复反应过程，就可以对模板DNA上与双引物结合序列之间的片段进行指数式扩增。退火变性延伸944065723035 cycles第一个循环第二个循环第n个循环 （一）、PCR 基本成分PCR 标
34、准反应条件：模板 1pg-1g引物 0.5-1MDNA 聚合酶 15 单位Mg2 1.5-3mMdNTPs 200MKCl 50 mM1、模板模板是PCR 的关键，模板的质量是PCR 成功的先决条件。可以是DNA，也可以是cDNA；可以是双链DNA，也可以是单链DNA；可以是线性DNA，也可以是环状DNA。最佳模板量取决于基因组的大小，100ng 到1g 的人类基因组DNA，相当于3104 到3105 个分子。所以对于单拷贝基因，这需要0.1g 的人基因组DNA，10ng的酵母DNA，1ng 的大肠杆菌DNA.扩增多拷贝序列时，用量更少。灵敏的PCR 可从一个细胞，一根头发，一个孢子或一个精子
35、提取的DNA中分析目的序列。模板量过多则可能增加非特异性产物。DNA中的杂质则会影响PCR的效率。2、引物引物一般成对（5引物/上游引物/有义引物和3引物/下游引物/无义引物），也可以是一条引物（RAPD）或多对引物（AFLP）。根据引物与模板的互补关系可以分为专一引物（specific primer）、简并引物（degenerate primer）和随机引物（radom primer）。专一引物长度一般不少于15nt，要求和模板完全互补，设计时应考虑：G-C含量4060%；长度一般为1630nt；碱基尽可能随机分布，不要有长重复区；引物的二级结构不能过多；3端最后几个碱基不要富含A/T；5端
36、一般有保护碱基和酶切位点；两引物3端不要互补。简并引物是有一个或几个碱基差异且编码相同的混合引物，由于同一个氨基酸可以有多个密码（简并性），设计引物时考虑各种可能的专一引物混合。简并引物的设计既要考虑序列的保守性，又要考虑简并性，既保证扩增产物的特异性，又尽量减少引物种类，引物3端几个碱基尽量不要简并。引物以干粉形式运输。最好用TE 重溶引物，使其最终浓度为100M。TE 比去离子水好，因为水的pH 经常偏酸，会引起寡核苷的水解。当然，如果担心TE 对于PCR 的影响，不妨用ddH2O。引物的稳定性依赖于储存条件，应将干粉和溶解的引物储存在-20。注意：溶解之前先离心一下，防止一开盖就飞了。引
37、物的浓度会影响特异性。最佳的引物浓度一般在0.1 到0.5M。较高的引物浓度会导致非特异性产物扩增。3、DNA聚合酶的选择。Taq DNA聚合酶被看做是低保真度的聚合酶，因为其缺少3到5外切核酸酶（校正）活性。使用带有3 到5 外切核酸酶活性的热稳定聚合酶可以提高保真度。但是这些聚合酶的产量比Taq DNA聚合酶低。在很多公司的手册中有对各种酶特性的描述。4、Mg2浓度镁离子影响PCR的多个方面，如DNA聚合酶的活性，这会影响产量；再如引物退火，这会影响特异性。dNTP和模板同镁离子结合，降低了酶活性所需要的游离镁离子的量。最佳的镁离子浓度对于不同的引物对和模板都不同，但是包含200M dNT
38、P的典型PCR起始浓度是1.5mM（注意：对实时定量PCR，使用3到5mM带有荧光探针的镁离子溶液）。在多数情况下，较高的游离镁离子浓度可以增加产量，但也会增加非特异性扩增，降低忠实性。为了确定最佳浓度, 可以用0.1-5mmol/L的递增浓度的Mg2+ 进行预备实验，选出最适的Mg2+浓度。在PCR反应混合物中, 应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团, 例如磷酸基团或EDTA等可能影响Mg2+ 浓度的物质，以保证最适Mg2+ 浓度。5、dNTPs高浓度的dNTPs会对扩增反应起抑制作用。将每种dNTP的浓度从200M降低到25-50M可以使扩增产物获得满意的产率。6、KCl标准浓度为50 mm
39、ol/L, 对于较短片段可将其提高到70-100 mmol/L.（二）、PCR 反应参数1、变性： 94预变性5-10min 非常重要，它可使模板DNA 完全解链，变性不完全，DNA双链会很快复性，减少PCR 产量。一般变性温度与时间为94 1min。在变性温度下，双链DNA 解链只需几秒钟即可完全，所耗时间主要是为使反应体系完全达到适当的温度。对于富含GC 的序列，可适当提高变性温度。但变性温度过高或时间过长都会导致酶活性的损失。2、退火：这是PCR 的一个关键参数。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55到70。退
40、火温度一般设定比引物的Tm 低5, 当产物中包含有影响实验的非可异性扩增带时，以2为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。如果两个引物Tm 不同，将退火温度设定为比最低的Tm 低5。或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm 设计的退火温度先进行5 个循环，然后再根据较低Tm 设计的退火温度进行剩余的循环。这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。退火温度越高，所得产物的特异性越高。有些反应甚至可将退火与延伸两步合并，只用两种温度(例如用60和94)完成整个扩增循环, 既省时间又提高了特异性。退火一般仅需数秒钟即可完成，反应中所需时间主要是为使整个反
41、应体系达到合适的温度。3、延伸：延伸反应通常为72，接近于Taq DNA 聚合酶的最适反应温度75。实际上，引物延伸在退火时即已开始，因为Taq DNA 聚合酶的作用温度范围可从20-85。延伸反应时间的长短取决于目的序列的长度和浓度。在一般反应体系中，Taq DNA聚合酶每分钟约可合成1kb 长的DNA。延伸时间过长会导致产物非特异性增加。但对很低浓度的目的序列, 则可适当增加延伸反应的时间。一般在扩增反应完成后，都需要一步较长时间(5-30min)的后延伸反应，以获得尽可能完整的产物, 这对以后进行克隆或测序反应尤为重要。4、循环次数： 当其它参数确定之后, 循环次数主要取决于DNA 浓度
42、。一般而言25-30轮循环已经足够。循环次数过多，会使PCR 产物中非特异性产物大量增加。通常经25-30 轮循环扩增后, 反应中Taq DNA 聚合酶已经不足, 如果此时产物量仍不够, 需要进一步扩增，可将扩增的DNA 样品稀释103-105倍作为模板, 重新加入各种反应底物进行扩增, 这样经60 轮循环后, 扩增水平可达109-1010。二、材料、仪器和试剂1材料 基因组DNA，目的片段1Kb。2仪器PCR热循环仪，台式高速离心机，微量可调加样器，反应管（0.2mL或0.5mL），电泳仪。3试剂Taq聚合酶（Sangon公司），dNTP（2.5mM/each或10mM/each），10XP
43、CR buffer（Mg free），25mM MgCl2 ，0.82%琼脂糖（1 X TAE），Loadding buffer（6 X或10X），电泳缓冲液（1XTAE），10mg/mL溴化乙锭（EB）。三、操作步骤1在无菌的离心管中按下列操作程序加样：反应物加样顺序25l反应体系（l）50l反应体系（l）dd H2O116.031.010 x Taq Buffer（Mg-） 22.55.02.5mM/each dNTP 32.04.025mM MgCl241.53.010pM引物151.03.010pM引物261.03.0模板711TaqDNA聚合酶80.150.32用微量可调加样器和一次
44、性吸头向每一管中加50l矿物油（具有热盖的PCR仪也可不加）。每加一管换一次吸头。3振荡每支管，然后短暂离心。4将管放到预热的热循环仪中，按下列程序开始循环： 预变性 94 5min循环30次 变性 94 50sec 退火 50-65 50sec延伸 72 1min 终延伸 72 5min 1次保存 45将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。6紫外分析仪检查电泳结果四、PCR结果分析及对策1假阴性，不出现扩增条带PCR 反应的关键环节有：模板核酸的制备；引物的质量与特异性；酶的质量；PCR循环条件。（1）模板：模板中含有Taq聚合酶抑制剂；制备模板时丢失过多，或混入酚；核酸变性不彻底。在酶和引物
45、质量好时，不出现扩增带，有可能是模板核酸有问题，可使用阳性对照DNA模板配合检查模板质量。 （2）酶失活：需要换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否酶的活性丧失，或不够而导致假阴性。 （3）引物：引物的质量、引物的浓度、 两条引物的浓度是否合适，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成有问题，两条引物有一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：（i）选定一个好的引物合成单位。（ii）引物的浓度不仅要看OD值，更要注意引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。（iii）引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏，导致引物变质降解失效。引物设计不合理。如引物长度不够、引物之间形成二聚体等。 （4）Mg2+浓度：Mg2+浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增不出DNA带。 （5）反应体积的改变：通常进行PCR的反应体系为20L、30L、50L、100L，应用多大体积进行PCR应根据扩增产物需