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1、第4章植物组织和细胞培养第一节 植物组织和细胞培养基础知识为什么进行植物组织和细胞培养？植物是各种药物、色素、香精和酶的主 要来源； 已知的30000中天然化合物中，80%来源于植物。世界每年植物来源的香料销售额超过20亿一、植物细胞培养应用前景 植物细胞培养在工业上主要应用于:1. 获得细胞或次级代谢物；2. 进行生物转化，将外源底物转化为所需的产物；3. 在农业上主要应用于种质保存；4. 人工种子的制备；5. 植株的大规模快速繁殖。 （一）次级代谢物的生产1.植物细胞培养生产各种天然产物，具有如下显著特点。1）提高产率 使用优良的植物细胞培养生产天然产物可以明显提高天然产物的产率。例
2、如，日本三井石油化学工业公司于1983年在世界上首次成功地采用紫草细胞培养生产紫草宁，他们用750 L的反应器，培养23d，细胞中紫草宁的含量达到细胞干重的14，比紫草根中紫草宁的含量高10倍。其后的许多研究表明：采用植物细胞培养生产木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、人参皂苷、迷迭香酸、黄连素、胡萝卜素、维生素E、花青素、超氧化物歧化酶、蒽醌等物质，其产率均达到或者超过完整植株的产率。2）提高效率植物细胞生长一般生产周期1530d，与完整植物的生长周期比较，却是大大地缩短了生产周期。一般植物从发芽、生长到收获，短则几个月，长则数年甚至更长时间。例如，木瓜的生长周期一般为8个月，紫草为5年，野山参则更
3、长。3）易于管理，减轻劳动强度植物细胞培养在人工控制条件的生物反应器中进行生产，不受地理环境和气候条件等的影响。易于操作管理，大大减轻劳动强度，改善劳动条件。（二）进行生物转化，将外源底物转化为所需的产物1.生物转化即通过植物细胞内生成和积累的各种酶的催化作用，将外源底物转化为药物、食品添加剂等具有较高应用价值的产物2.植物细胞生物转化具有：转化率高、选择性强、副产物少等显著特点.（三）在农业上主要应用于种质保存1.传统上植物保存是利用植物种子进行长期保存的，由于自然灾害、生物竞争等因素，使不少植物品种已经或正在消失；对于无性繁殖的植物，由于没有可供保存的种子，很难保存。 2.采用植物细胞培养
4、或者冷冻保存的方法进行种质保存，简单方便，可以使植物的遗传特性得以长期稳定地保存，对于稀有植物品种、优良植物品种和新型植物品种的种质保存具有重要的意义。（四）人工种子的制备 人工种子的制备与植物常规种子的生产相比，具有不占用耕地，不受地理、气候等条件的影响，可以快速、大量地进行工业化生产，生产效率高，种质长期稳定等显著特点。人工种子胚状体（五）植株的大规模快速繁殖1.传统的植物繁殖是在田间或在温室中进行有性繁殖或无性繁殖，效率低，时间长。2.采用植物细胞培养技术，可以快速、高效地进行植物的繁殖，并且不受地理环境和气候条件的影响二 植物细胞和组织培养的概念1.植物细胞和组织培养（plant ce
5、ll and tissue culture, PCTC）将植物的器官、组织、细胞或细胞器进行离体、无菌培养，并重新再生成细胞或植株的过程为植物细胞和组织培养植物细胞和组织培养主要包括：植物器官培养：包括离体的器官如根尖、茎尖、叶原基、花器官和果实等在适当条件下进行无菌培养，以及从各种器官增殖而形成愈伤组织的培养。离体胚胎培养：包括成熟或未成熟的胚胎离体培养，通常使用相应的培养基使离体胚正常的萌发生殖，以供研究和操作使用。菊花植物细胞培养：是指在无菌条件下，将植物细胞从机体内分离出来，在营养培养基上使其生存和生长的一种方法。将植物细胞微生物化，在一定容积的反应器中得到大量的植物细胞。植物细胞培养
6、主要依据“细胞的全能性”。原生质体培养：将植物细胞去除细胞壁形成原生质体后进行培养，它是利用原生质体进行操作的基础。外植体（explant）：植物组织培养中,作为离体培养材料的器官或组织的片断统称为外植体。愈伤组织（callus）:是由母体外植体组织的增生细胞产生的一团不定型的疏松排列的薄壁细胞。一般愈伤组织在培养中没有明显的组织或器官的分化。 细胞全能性：（cell totipotency）: 是指植物体的每个细胞在离体条件下都具有诱导生长分化形成完整植株的潜在能力， 这是由于每个细胞都有一套完整的基因组而实现的。分生组织三 培养基的组成和类型（一）培养基的成分和作用通常植物组织和细胞培养所
7、用培养基包括以下六大类成分，即矿质营养、有机成分、植物生长调节剂、碳源、琼脂以及其他附加物等。培养基的主要指标是营养成分及植物生长调节物质的浓度。矿质营养：矿质营养又称无机营养，是指植物生长发育所需要的各种化学元素。根据植物对元素的吸收量，可以将矿质元素分为大量元素和微量元素。国际植物生理学会建议将植物所需浓度大于0.5 mmol/l的的元素称为大量元素。低于0.5mmol/l的元素称为微量元素。根据此规则大量元素种类包括:N、P、K、Ca、Mg、S。六种为矿质元素，分别占植物干重的百分数为0.3%、0.07、0.3%、0.3 、0.07%、0.05。微量元素包括:Fe、B、Mn、Zn、Mo、
8、Cu、Co、Cl等。有机成分：主要包括各种维生素和氨基酸，如硫胺素（VB1）、烟酸（VB3）、吡哆醇（VB6）、泛酸钙（VB5）、生物素、钴胺素（VB12）、叶酸等以及甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰氨、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰氨、丙氨酸等。此外肌醇是另外一种重要的有机成分，又叫环己六醇，在糖类的转化中起重要作用，此外还参与磷脂代谢及维持离子平衡等生理作用。植物生长调节物质：植物激素是植物新称代谢中产生的天然化合物，它能以极微小的用量直接影响植物细胞的分化、分裂以及发育，影响植物的形态建成、开花、结实、成熟、衰老脱落、休眠、萌发等生理活动。在植物组织培养中，主要通过植物激素及生长调节物质对离体的组织、器
9、官的形态发生进行调控。包括诱导细胞分裂、愈伤组织的生长、根芽的分化以及体细胞胚胎发生等。常用的植物激素及生长调节物涉及五大类：1、生长素类：2、细胞分裂素类：3、赤霉素类：4、脱落酸：5、乙烯：1）生长素类：主要促进细胞伸长生长和细胞分裂，诱导形成愈伤组织，促进生根。调节植物生长，尤其能刺激茎内细胞纵向生长并抑制根内细胞纵向生长的一类激素。它可影响茎的向光性和背地性生长。在细胞分裂和分化、果实发育、插条时根的形成和落叶过程中也发挥了作用。研究发现，生长素的作用表现为两重性：既能促进生长，也能抑制生长；既能促进发芽，也能抑制发芽；既能防止落花落果，又能疏花疏果。这与生长素的浓度对植物不同部位的敏
10、感度有关。一般来说植物根的敏感度大于芽大于茎。双子叶植物的敏感度大于单子叶植物。所以用2-4D这样的生长素类似物可以做除草剂。它的特点是双面性，既能促进生长，也能抑制生长，甚至杀死植物。经常使用的植物生长素有：吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、2.4-二氯苯氧乙酸（2.4-D）等。具有诱导细胞分裂的作用。2）细胞分裂素类：促进细胞分裂和扩大，促进植物茎增粗，抑制茎伸长；诱导芽的分化、促进侧芽萌发；延缓衰老。细胞分裂素 对芽的诱导有重要作用。 常用的浓度范围为0.011mg/L。 主要有激动素（N6- 呋喃甲基腺嘌呤，KT）、 6-苄基腺嘌呤(BA)和玉米素（N6-异戊烯腺 嘌呤,ZT）等。
11、3）赤霉素类：主要具有诱导茎的细胞伸长，对根无效；与生长素协同作用；可以诱导离体成花；打破休眠等功能。常用GA3、GA4等。4）脱落酸（ABA）促进休眠、衰老和脱落。组织培养中较少使用，主要用于调节激素平衡，促进形态建成。5）乙烯：主要促进衰老和脱落，高浓度易形态变化。碳源：碳源主要为细胞提供合成新化合物的骨架，为细胞的呼吸代谢提供底物与能源，此外还能维持一定的渗透压。常用的碳源主要是蔗糖，使用浓度在25，此外果糖、葡萄糖、麦芽糖、山梨糖、甘露糖及可溶性淀粉等也常用于植物组织培养。糖浓度高低直接影响形态建成。琼脂：琼脂作为固化剂用于组织培养中，起支持植物的作用，不提供营养，为海藻中提取的一种高
12、分子化合物，仅溶于热水（90 oC以上），成为凝胶，冷却后（40 oC以下）即凝固为凝胶。琼脂的用量通常在410g/L.琼脂是组织培养培养基中主要的成本支出，约占80。有机附加物：1）椰子汁：用量为100200g/L。2）香蕉泥：使用量为150200g/L。3）苹果汁、番茄汁等。其他成分：1）活性炭：使用量为0 .2-1%。2）抗生素：常用青霉素、链霉素、庆大霉素等，用量在520mg/L。3）抑制酚类物质形成的物质：（1）抗坏血酸：可以加入培养基或浸泡处理外植体。（2）聚乙烯吡咯烷酮（PVP）：加入培养基中。（二）培养基的类型：1、高盐浓度培养基：MS、B5、SH等。适用于多数营养需求量较大的
13、植物。2、低盐培养基：WPM、 White、 Nitsh等。适用于木本植物的培养。应用最广的培养基：Murashing和Skoog的Ms Linsmaier和Skoog的Ls培养基。 Ms和Ls特别适用于植株再生。表1MS培养基的组成配方组成成分NH4NO3KNO3CaCl22H2OMgSO47H2OKH2PO4KIH3BO3MnSO44H2OZnSO47H2ONa2MoO42H2O数量(mg/l)165019004403701700.836.222.38.60.250.025组成成分Na2-EDTAFeSO47H2OCuSO45H2O蔗糖pH肌醇烟酸盐酸吡哆醇甘氨酸盐酸硫铵等数量(mg/l)
14、37.327.80.025305.8100.00.50.52.00.4CoCl26H2OGamborg等的B5培养基（1968）及衍生出来的其他培养基适用于植物细胞及原生质体的培养；E1培养基是Phillip和Colins 为了培养苜蓿植物而改进的Ls培养基，特别适合大豆培养，还可用于胚胎形成和原生质体的培养；表2B5培养基的组成和配方组成成分KNO3CaCl22H2OMgSO47H2O(NH4)2SO4KIH3BO4MnSO44H2OZnSO47H2ONa2MoO42H2ONa2-EDTA数量(mg/l）25001502501340.753.0102.00.250.02537.3组成成分Fe
15、SO47H2OCuSO45H2O蔗糖pH肌醇烟酸盐酸吡哆醇激动素2,4D盐酸硫铵数量(mg/l)27.80.025405.51001.01.00.10.11.010CoCl26H2O N6培养基是我国朱至清（1978）为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的。其特点是硝酸盐、铵盐浓度较低，适合于禾本植物的组织培养；表3 N6培养基的组成和配方组成成分KNO3CaCl22H2OMgSO47H2OKH2PO4(NH4)2SO4KIH3BO3MnSO44H2OZnSO47H2O数量(mg/l)2.31661854004630.81.64.41.5组成成分Na2EDTAFeSO47H2O蔗糖pH烟酸盐酸吡哆
16、醇甘氨酸盐酸硫铵(mg/l)37.327.8505.80.50.52.01.0（三）培养基的配制和灭菌培养基及母液的配制：1）量取母液：营养元素和激素。2）称量蔗糖、琼脂，放入600ml左右蒸馏水的锅内，电路上加热，使琼脂溶化。3）加入母液，混合均匀，调整pH值。4）分装入瓶，每瓶4050ml。5）封口：用46层称量纸封口，之后灭菌备用。、培养基的灭菌：1）加热：灭菌前检查灭菌锅内水量是否充足，然后将培养基放于灭菌锅内，改好盖，关闭放气阀，打开电源，加热升温。2）排气：当温度升至0.5kg/cm时，打开放气阀彻底排出锅内冷空气。然后关闭放气阀，促使压力继续上升。3）温度控制：当锅内压力升至1.
17、1kg/cm2（）时，计时20分钟，计时结束后，关闭电源。4）出锅：当灭菌锅自然冷却后，取出培养基，放置于接种室备用。（四）培养基的保存：1、防尘：防治灰尘污染。2、避光：吲哚乙酸等易于分解，要注意遮光。3、恒温：4 oC可保存36周，室温下两周内用完。4。定期更新：不易长期保存。四 植物组织培养中的消毒、灭菌及环境控制（一）消毒和灭菌的概念：消毒 是指应用消毒剂等方法杀灭物体表面和内部的病原菌营养体的方法。灭菌 是指用物理和化学方法杀死物体表面和内部的所有微生物（包括芽胞），使之呈无菌状态。经过灭菌的物品称“无菌物品”。消毒与灭菌是两个不同的概念。灭菌可包括消毒，而消毒却不能代替灭菌。（二）
18、消毒和灭菌方法：消毒方法：1）化学药剂消毒：采用化学消毒剂杀灭或抑制病原微生物的方法。2）煮沸消毒：在热水中煮沸杀灭病原微生物的方法。3）射线消毒：利用紫外线或r射线对接种室等处的病原微生物进行杀灭或抑制。灭菌方法：1）物理法灭菌：（1）干热灭菌法：a、干热空气灭菌法：即把待灭菌的物品均匀地放入烘箱中，升温至160C，恒温1小时即可。此法适用于玻璃皿、金属用具等的灭菌。b、灼烧灭菌法：利用火焰直接把微生物烧死。此法彻底可靠，灭菌迅速，但易焚毁物品，所以使用范围有限，只适合于接种针、环、试管口及不能用的污染物品或实验动物的尸体等的灭菌。湿热灭菌法：在同样的温度下，湿热灭菌的效果比干热灭菌好，这是
19、因为一方面细胞内蛋白质含水量高，容易变性。另一方面高温水蒸汽对蛋白质有高度的穿透力，从而加速蛋白质变性而迅速死亡。a 高温高压蒸汽灭菌法：它适用于各种耐热、体积大的培养基的灭菌，也适用于玻璃器皿、工作服等物品的灭菌。b.巴氏消毒法：有些食物会因高温破坏营养成分或影响质量，如牛奶、酱油、啤酒等，所以只能用较低的温度来杀死其中的病原微生物，这样既保持食物的营养和风味，又进行了消毒，保证了食品卫生。该法一般在62C，30分钟既可达到消毒目的。此法为法国微生物学家巴斯德首创，故名为巴氏消毒法。c.煮沸消毒法：直接将要消毒的物品放入清水中，煮沸15分钟，即可杀死细菌的全部营养和部分芽孢。若在清水中加入1
20、%碳酸钠或2%的石炭酸，则效果更好。此法适用于注射器、毛巾及解剖用具的消毒。d.间歇灭菌法：上述两种方法在常压下，只能起到消毒作用，而很难做到完全无菌。若采用间歇灭菌的方法，就能杀灭物品中所有的微生物。具体做法是：将待灭菌的物品加热至100C，1530分钟，杀死其中的营养体。然后冷却，放入37C恒温箱中过夜，让残留的芽孢萌发成营养体。第2天再重复上述步骤，三次左右，就可达到灭菌的目的。此法不需加压灭菌锅，适于推广，但操作麻烦，所需时间长。影响湿热灭菌的因素a.不同的微生物或同种微生物的不同菌龄对高温的敏感性不同。多数微生物的营养体和病毒在5065C，10分钟就会被杀死；但各种孢子、特别是芽孢最
21、能抗热。对同种微生物来讲，幼龄菌比老龄菌对热更敏感。b.微生物的数量多少显然会影响灭菌的效果，数量越多，热死时间越长。c.培养基的成分与组成也会影响灭菌效果。一般地讲，蛋白质、糖或脂肪存在，则提高抗热性，pH在7附近，抗热性最强，偏向两极，则抗热能力下降，而不同的盐类可能对灭菌产生不同的影响；固体培养基要比液体培养基灭菌时间长。（3）过滤灭菌：采用机械方法，设计一种滤孔比细菌还小的筛子，做成各种过滤器。通过过滤，只让液体培养基从筛子中流下，而把各种微生物菌体留在筛子上面，从而达到除菌的目的。这种灭菌方法适用于一些对热不稳定的体积小的液体培养基的灭菌以及气体的灭菌。它的最大优点是不破坏培养基中各
22、种物质的化学成分。但是比细菌还小的病毒仍然能留在液体培养基内，有时会给实验带来一定的麻烦。（二）无菌室的消毒：接种室与培养室通常采用药剂熏蒸以及紫外灯照射进行消毒。化学药剂：75乙醇喷雾、甲醛和高锰酸钾熏蒸。紫外灯照射：2030分钟。 30W或40W。消毒时，室内每10m2 安装30W紫外线灯管1支，有效距离不超过2m。照射时间为3060分钟，照射前清扫尘埃，照射时关闭门窗，停止人员走动。（三）培养基及试验器具的灭菌：高温高压灭菌：培养基通常采用高温高压蒸汽灭菌，排放冷气后，维持1.1kg/cm2 15-20min.灭菌效果较好。灭菌锅有各种规格18L、30L、50L。手提式或自动控制。接种器具以玻璃器皿可采用干热灭菌和灼烧灭菌，但干热灭菌能耗较高。灼烧灭菌结合95乙醇效果好。不耐高温 的激素等试剂采用过滤灭菌。采用0. 45um的滤膜。（四）外植体的灭菌：采用75乙醇和升汞（HgCl）等多种杀菌剂进行外植体灭菌。75具有润湿和杀菌的双重作用，浸渍不超过30秒；升汞使用浓度为0.1%-0.2%，处理510分钟（幼嫩材料）。次氯酸钠210，时间1530分钟，对植物无害。植物细胞培养反应器植物细胞培养反应器