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1、Nanjing TorontoStanford 保密 Strictly Private 10(8):472-84. 没有组织怎么办？ Copyright 2016. GENESEEQ Technology Inc. All rights reserved. 初始诊断性活检是通过组织 病理学、免疫组化和分子学 特征描绘进行评估的，根据 结果制订治疗方案 在获得性耐药时进行再活检 ，并采用同样的方法重新分 析以发现耐药时收集的标本 与治疗前标本的差异 该过程在各治疗阶段时重复 进行 应形成可能的细胞株和患者 衍生的移植瘤模型以促进耐 药机制和治疗作用的功能性 研究 Politi K, et al.
2、 Clin Cancer Res. 2015 May 15;21(10):2213-20. 分子学特征和再活检与癌症治疗的整合 27 检测全面克服肿瘤异质性 肿瘤具有复杂的时空异质性 不同位置具有不同病灶肿瘤亚克隆 Andriy Marusyk, et al. Nature Review Cancer. 2012. Almendro V, et al. Annual review of pathology 2013. 由于组织检测只取样于肿瘤的某一部位， 无法衡量肿瘤组织的异质性，导致检测信息 不全面。 ctDNA： 由于ctDNA来源于患者体内不同位置的肿 瘤细胞，同时经过人体天然血液循环系
3、统 混匀，其携带的肿瘤基因信息更全面，规 避了肿瘤组织的异质性。 灵敏度高准确度高假阳性率低 Zheng et al. Sci Rep 6: 20913 (2016). Thierry et al. Nat Med. 2014; 20 (4):319-449. 为什么要进行ctDNA基因检测 现有的基于血清蛋白生物标记物（例如CA-125和PSA）的无创检测方法 存在一定数量的假阳性与假阴性结果，并不能对肿瘤的进展做出准确判断 ctDNA可从血液中较易分离 （liquid biopsy），并携带肿瘤特异性的体细 胞突变，因此极为适合作为肿瘤无创诊断及监测的生物标记物 对ctDNA进行基因检测还
4、可以及时发现肿瘤复发后产生的抗药性突变，而 及时对治疗方案进行调整 尽管肿瘤本身是肿瘤DNA的最直接来源，但是通过活检或手术获取肿瘤组 织是侵入性的，具有一定风险的。而且有些癌症病人不宜进行手术，无法 获得肿瘤组织进行基因检测，以帮助制定治疗方案 30 ctDNA检测中遇到的问题及挑战 ctDNA总量取决于： 样品提供人的健康状态 取血及保存运输血液/血浆样品的条件 血浆的制备方法 DNA的提取方法以及DNA的定量方法 31Copyright 2015. GENESEEQ Technology Inc. All rights reserved. 世和基因的技术优势： 大幅提高ctDNA回收率
5、从微量ctDNA建立测序文库 ctDNA在血液中含量极少 ，片段较小，提取方法及其重要1 建库及富集的产量2 事实上，ctDNA检测的核心在于 前期准备以确保ctDNA文库的多样性 ，保证被检测样本有代表性是下游 测序及分析的基石 32 那么多公司，为什么选择我们？ 世和的优势 世和的优势来自于步步优化，精益求精 33 样本收 集 DNA提取 样本建库 靶向富集 上样测序 数据分析 报告生成 世和的优势来自于步步优化，精益求精 34 样本收 集 DNA提取 样本建库 靶向富集 上样测序 数据分析 报告生成 优势在于每步优化！ QC步骤 样本收集两小时之内分离血浆 35 样本收集 DNA提 取
6、样本建 库 靶向 富集 上样 测序 数据分 析 报告生 成 收到血样后2小时内分离血浆 血浆多种运输条件实验室模拟 不能输在起跑线上！ 运输全血至总部再分离血浆 季节地域温差大，影响质量 直接影响检出率 世和基因其他公司 Sci Transl Med. Aug 26, 2015; 7(302): 302ra133 2小时内收集血浆是 临床试验、高分论文金标准！ 分离全血收集血浆，时间精至分钟！ DNA提取I血浆ctDNA富集小片段ctDNA，去除干扰 36 样本收 集 DNA提 取 样本建 库 靶向富 集 上样测 序 数据分 析 报告生 成 DNA提取 小片段含肿瘤特异突变 大片段不含肿瘤特异
7、突变 血浆DNA经过大小片段分离 有效富集小片段ctDNA！ 更丰富的起始原料 世和基因数据 DNA提取II石蜡组织自主研发基于qPCR的样本质控 37 样本收 集 DNA提 取 样本建 库 靶向富 集 上样测 序 数据分 析 报告生 成 DNA提取 0.5 率先使用荧光定量PCR法用于FFPE样本质控 自主设计引物，经过8个参数计算模型， 确保通过QC样本测序质量 避免交联过于严重的石蜡样本进入流程 测序质量好 测序质量差 世和基因数据，基于100例临床病人石蜡样本测序结果 样本建库不计成本的大量进口试剂优化 38 样本收 集 DNA提 取 靶向富 集 上样测 序 数据分 析 报告生 成 样
8、本建库 上百种进口试剂反复搭配优化 极大提升建库效率 39 靶向富集 样本收 集 DNA提 取 样本建 库 上样测 序 数据分 析 报告生 成 靶向富集I基因捕获探针Mass spec质控单独合成 基因靶向富集15000余个探针 探针库反复优化14次，历时3年， 保证每个基因每个外显子覆盖 探针单个合成，Mass Spec保证质量 7项核心专利 探针单独合成 质谱分析纯化 世和探针库 剪切 探针库芯片大规模合成 芯片合成探针的缺点： 大规模一次合成多个探针统一剪切 探针的完整性等品质无任何保证 大部分探针都不完整，导致基因捕 获效率大大降低 芯片合成探针的缺点 反复15000次 40 靶向富集
9、 样本收 集 DNA提 取 样本建 库 上样测 序 数据分 析 报告生 成 靶向富集II为什么一定要“好”探针？ 什么是探针的均一性（Uniformity）？ 探针覆盖不均一 探针覆盖均一 ALK19内含子 测序数据的重要参数，除了测序深度，还有探针均一程度 换句话说，如果EGFR覆盖3000X，而ALK只覆盖300X，将会严重影响检测敏感性 检测灵敏度是由覆盖最低的基因决定的 如不均一，等于没测！ 41 样本 收集 DNA提 取 样本 建库 靶向 富集 数据 分析 报告 生成 上样测序 世和基因 Illumina Hiseq4000/Miseq 其他测序公司 Illumina Nextseq
10、500 四色荧光判别ATCG四种碱基 激光超高分辨率照相机 Miseq为首个FDA批准临床 的 高通量测序仪 国际NGS高分文章，绝大多 数使用Hiseq平台 二色荧光判别ATCG LED照相机 准确率和灵敏度较差 主要用于产前检测 上样测序Illumina Hiseq4000/Miseq与国际接轨 42 数据分析报告生成I生信分析和突变分析的完美结合 样本收 集 DNA提 取 样本建 库 靶向富 集 上样测 序 数据分析 报告生成 生信分析各类型突变 反复研讨 数据库比对 最终突变列表 ABC 报告止于”一键生成”？ 报告初稿 审核 报告终稿 终审/打印/发送 协助医生 进行临床 突变研判
11、基本信息 突变解读 突变初筛A突变初筛B突变初筛C 近40人临床突变分析团队 43 数据分析报告生成II为什么不能“一键出报告”？ 样本收 集 DNA提 取 样本建 库 靶向富 集 上样测 序 数据分析 报告生成 临床测序数据涉及到病人用药方案 需要人工排除假突变 需要人工验证真突变 除常见突变外需要查找文献 MD Anderson、Foundation Medicine等国际领先 的中心机构，突变全部需要人工核查！ “假突变”： RB1基因16内含子重复区域 低丰度突变： 1%的EGFR T790M PTEN基因5外显子C124S突变， 是PTEN磷酸酶催化结构域内的 活性位点，在脱磷酸化过
12、程中 ，C124位点在攻击底物的磷酸 基团，并形成一个硫代磷酸酯 中间体。有研究表明，PTEN C124SA突变可导致PTEN蛋白 的脂质磷酸酶和蛋白磷酸酶的 双失活，进而可能激活PI3K/AKT 信号通路 罕见失活突变： PTEN C124S 44 数据分析报告生成III突变研判，分层报道 样本收 集 DNA提 取 样本建 库 靶向富 集 上样测 序 数据分析 报告生成 NCCN/FDA/CFDA涵盖基因突变 能够直接指导用药或提供预后信息 在其他癌种已获NCCN/FDA/CFDA批准 及 本癌种II/III期临床试验中相关突变 临床前研究数据中涵盖基因突变 不能直接用来指导用药和预后 Class I 目前突变意义不明 Class II Class III Class IV 45Copyright 2016. GENESEEQ Technology Inc. All rights reserved. 谢谢！