魏江平-中药药理学.doc

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1、老年痴呆动物模型研究进展摘要：老年痴呆症是一种神经退行性疾病，其主要病理特征是大脑及海马区细胞外-淀粉样蛋白沉淀(Amyloid beta,A)、堆积形成老年斑(Senile plaques,SP)，脑神经细胞内tau蛋白异常聚集而出现纤维缠结(Neurofibrillary tangles,NFTs)等。近年来相继提出了淀粉样蛋白级联假说、胆碱能假说、氧化应激假说、炎症免疫假说、基因突变假说、铝中毒假说等一系列学说，也因此而创建了与之相对应的动物模型，本文就对近些年来的比较流行的、常用的老年痴呆动物模型进行简要评述。关键词：老年痴呆症；动物模型；进入21世纪以来，全球逐渐步入人口老年化时代，

2、老年性疾病的发生率也逐步攀升。据阿尔茨海默氏症国际联合会报告显示，据估计2010年全世界老年痴呆病人就有3600多万，预计到了2030将增加到6600万，到2050年，全球将有1.15亿人将受到这种疾病的困扰1。老年痴呆症不仅使患者生活质量下降，也给家庭、社会带来沉重负担。因此，对老年痴呆的防治研究对老年人的身体健康及生活质量的提高有着重要意义。近些年，作为瓶颈环节的老年痴呆动物模型研究已经取得了一定的突破，现将其分述如下。1 “胆碱能假说”动物模型 20世纪六七十年代人类才发现阿尔茨海默病患者大脑皮层的乙酰胆碱酶数量降低2，随后Drachman 和Leavitt通过向青年健康志愿者注射东莨菪

3、碱发现其表现的精神状态与老年人一致3。后续的研究发现老年痴呆患者的基底前脑区神经细胞丢失，从基底节到皮层，乙酰胆碱限速酶（ChAT）和乙酰胆碱酯酶（AchE)活性显著下降，导致Ach的合成、储存及释放量降低，皮层乙酰胆碱受体数目下降4。因而认为老年痴呆患者学习记忆减退和认知障碍与胆碱能神经元缺失有关。目前，基于胆碱能假说的痴呆动物模型主要有中枢抑制药（如东莨菪碱、樟柳碱、戊巴比妥钠等）及兴奋性氨基酸（如鹅膏蕈氨酸、海人酸、使君子酸等）等所致模型。1.1 “东莨菪碱”模型 东莨菪碱模型具有操作简单易行，经济有效的优点，目前主要有腹腔注射和皮下注射两种造模途径，腹腔注射东莨菪碱有2mg/kg-1、

4、3mg/kg-1和5mg/kg-1三个常用剂量，为更好的替学习记忆行为研究及益智药物筛选提供方便，陈铃铃等5和高莉6等先后选取不同用药剂量复制模型展开研究，最后一致认为3mg/kg-1对大鼠学习记忆获得及巩固有显著影响。该模型能够模拟老年痴呆患者学习记忆及认知能力下降等特点，可作为常用药物筛选模型，不足之处在于它不能反映出痴呆患者脑内A沉淀形成的SP及NFTs等显著病理特征。1.2 “鹅膏蕈氨酸”模型 鹅膏药覃氨酸（ Ibotenic acid, IBO ）于上世纪八十年代开始被用于制作痴呆动物模型7，郭德玉等8对SD大鼠基底前脑区 Maymert 基核微量注射IBO成功复制该模型。该模型主要

5、造成神经细胞内Ca2超载而导致神经细胞损伤9，实验结果显示其大脑皮层和海马区乙酰胆碱受体数目下降，ChAT和AchE活性下降10，进而形成记忆功能损伤。同样该模型也无SP及NFTs等痴呆特征性病理产物，而且鹅膏蕈氨酸对胆碱能神经细胞的选择性较差，对非胆碱能神经细胞也有一定的影响。2 “铝中毒学说”动物模型“铝中毒假说”源于上世纪六七十年代Klatzo等11发现给予实验动物铝后，其脑内出现与阿尔茨海默症（AD）患者一致的神经纤维退化及缠结结构，随后又有AD患者脑内铝元素水平升高12及饮水中铝元素较高地区AD发病率较高的报道13，然而九十年代又有人发现铝所致NFTs同AD-NFTs不同14等而质疑

6、铝中毒假说。但是经免疫组化研究发现沉积在铝中毒动物脑内的NFTs可被抗tau蛋白抗体染色15及基于铝中毒培养的神经细胞中出现tau蛋白聚集16，Crowther17则在发现部分AD患者存在与铝中毒所致的线型纤维。因此，铝致痴呆的作用机制及铝与tau蛋白之间的作用关系还在继续探究中。当下铝中毒动物模型的造模方法主要有硝酸铝或氯化铝溶液灌胃、腹腔注射18、皮下注射19、侧脑室注射20和饲料饮水中拌服21五种途径，所用药物剂量因受试动物品种、体重、使用药物不同及给药方式不同而不同。其中饲料饮水拌服途径无法确保每只动物的药物用量平衡，故不建议采用，其他四种途径目前还没有平行比较来评价那种途径优劣，但都

7、能检测到动物脑内铝元素含量升高，胆碱能神经功能降低、学习记忆减退及神经纤维缠结特征，只是这些造模方法的周期相对较长。3 “淀粉样蛋白级联假说”动物模型 “淀粉样蛋白级联假说”认为不溶性纤维状淀粉样蛋白A是AD发病机制的核心22，进一步的研究发现淀粉样前体蛋白（APP）基因位于第21号染色体上，病理条件下才主要由、-分泌酶分解形成A23，聚集形成毒性原纤维，进而导致SP的形成。近期研究表明A毒性同Tau蛋白磷酸化去磷酸化具有相互促进的作用24-25，这与糖原合成激酶-3( glycogen synthase kinase-3，GSK-3)26的作用密切相关，但对于Tau蛋白的过磷酸化与A沉淀的时

8、间顺序以及两者与GSK-3的具体关系还有待继续深究。 A动物模型主要以海马CA1或CA327为注射靶点，单侧或双侧微量注射A25-35或A1-4028或A1-4229或A1-43和A1-40联合注射30，不同的品种的实验动物其注射的位置及深度各有不同。以上几者所致痴呆模型可见海马等区域神经元缺失、退变，出现SP，胶质细胞反应等变化，但未见到典型的NFTs31。A1-42和A1-40是AD患者脑内主要A产物，其中A1-42在人脑内呈年龄依赖性累积32，且其结构差异使其集聚能力较强33，即其神经毒性较强；正常人脑内A1-40分泌量远大于A1-42，且A1-40与神经突触损伤和神经元丢失有着密切关系

9、34。因此不能从单方面评价两者所造模型优劣，如果把两者结合起来在药物筛选和AD发病机制的研究上或许更具参考价值。4 “基因突变假说”动物模型 “基因突变假说”认为与老年痴呆有关的基因发生突变或其他因素诱导使其产生病变。目前人类已确定了四种与老年痴呆密切相关的基因即APP基因35、早老素-1基因（presenlih-1，PS-1）36、早老素-2基因(presenilin-1，PS-2)37和 ApoE基因38，此外还有A2M基因39、MAPT基因25以及PICALM, BIN1, ABCA7, MS4A4/MS4A6E 、EPHA1等基因位点41。在此基础上，采用基因敲出（knock -out

10、）技术培养出APP、Tau蛋白及多转基因鼠。4.1 APP转基因模型4.1.1 PDAPP鼠PDAPP鼠是最早报道的实用AD转基因鼠42，其APP表达10倍于内源性APP，其病理特征与AD非常相似，可见细胞内外神经斑块、萎靡的神经突触、胶质增生、突触密度降解43，6-8月龄可看SP自海马到皮层及其边缘进行性产生，老龄阶段（18月龄）可见斑块周围伴有小胶质细胞、磷酸化的神经纤维丝及Tau蛋白44-45，记忆学习功能损伤46。但在其老龄时期仍观察不到在AD中常见的在内嗅皮质、CAI及纹带（cingulate）皮质区域的球形神经丢失等47特征。4.1.2 Tg2576鼠 Tg2576鼠是紧接PDAP

11、P鼠报道后的又一例AD模型动物，其APP表达略低于PDAPP鼠，约为内源性APP表达的5.5倍。在其9-11月龄在海马、皮质、小脑下脚及小脑可见与AD和PDAPP鼠相似的神经斑块，其斑块也伴有神经元萎缩及胶质增生，8月龄开始其记忆随年龄增长而渐渐损伤48，但同样没在其CA1看到球形神经丢失等表现49。4.2 Tau转基因模型 在现有的Tau转基因鼠中，P30IL鼠是一个相对比较可用的模型，在其8月龄时可见NFTs存在于脑干、脊髓、皮层区域，还伴随有星形胶质细胞增生50及进行性神经元丢失、不溶性 tau、神经原性肌萎缩症以及严重的进展至死亡的运动缺损等。4.3 多转基因模型 App/ps1双转基

12、因鼠和3xTg-AD三转基因鼠是多转基因鼠中杰出品种，前者可见同AD一样的A沉积，Tau蛋白过度磷酸化、认知功能损害以及神经元变性、缺失，突触及神经递质合成释放异常，此外还有胶质细胞活化及炎症因子表达、血浆成分异常及骨质疏松的外周体现51；后者包含PS1 M146V ，APP Swe和tau P301L三者基因，可见A沉积，胶质细胞增多，突触损伤，6月龄之后神经元内、外先后出现A沉淀和NFTs ，两者出现的时间及空间位置有所差异52。除上述提到的常用转基因模型外，还有很多转基因品种因模型，所有的转基因模型都能够表达其目的基因，多转基因模型相对更能模拟老年痴呆的部分病理特征，能在老年痴呆的发病机

13、理、药物筛选研究中发挥一定的作用，与此同时也应看到转基因动物存在难复制、外源性基因表达不稳定、繁殖力低、抗病力弱、成本高等问题，此外转基因模型在模拟老年痴呆患者正常衰老及精神行为等方面还有待深入研究、完善。5 “炎症免疫学说”动物模型“炎症免疫学说”认为 AD患者神经元的损害多因机体对病原体的炎症反应，而非因病原体本身所致。参与炎症反应的胶质细胞被激活的早期阶段可对A进行清除，但大量激活后可释放多种细胞因子、趋化因子、补体及其激活物53，随者这些炎症因子的增加，导致非特异性炎细胞浸润，进而产生慢性炎症，而炎症反应又可以促进APP代谢为A，从而加重炎性反应，形成恶性循环54。加拿大学者Saki等

14、55采用MRL鼠通过免疫手段建立了MRL-lpr小鼠AD模型。该模型鼠空间学习记忆能力降低，可在一定程度上模拟老年痴呆的认知障碍，但由于炎性反应与A密切相关，因此单纯的炎性免疫AD模型研究比较少，多在A动物模型中可见神经胶质细胞大量存在。6 “氧化应激假说”动物模型 “氧化应激假说”认为随着年龄的增加，人体内的氧化还原平衡失调，进而产生过多（如超氧阴离子(O2-)、羟自由基(OH-)、过氧化氢(H2O2)、单线态氧、NO自由基等）的活性氧化物质（ROS）56,这些物质聚集到一定程度就会引起蛋白质变性及脂质过氧化，继而对人体产生氧化损伤，危害机体。6.1 D-半乳糖动物模型该模型由我国学者最早提

15、出57，主要有腹腔注射和皮下注射两种途径，现已在多个物种复制成功，其中SD大鼠以60mg/d,1天1次为宜58。D-半乳糖注射主要形成脑老化和神经元衰亡现象，同亚硝酸钠联合使用引起认知下降等59，此外D-半乳糖同铝、东莨菪碱、A等联合造模在药物筛选和老年痴呆发病机制研究也有一定的意义。6.2 SAM动物模型SAM小白鼠是由Takeda T60培育出来的衰老模型鼠，现至少有SAMP/SAMR两个系统共十几个品系，在这两个品系中SAMP1、SAMP8及SAMP10的氧化硝化水平不仅要高于SAMR161，而且SAMP10的超氧化水平62、nNOS水平63以及IL-1 、IL-6、IFN- mRNA6

16、2 都显著高于SAMR1，此外在SAMP8海马、下丘脑及大脑皮层的IL-1、TNF- 、IL-6也显著高于SAMR164。 SAMP10除了有较高的炎性表达外，在其脑内海马区还存在A沉积、脑萎缩、神经DNA损伤病理改变以及认知障碍和增龄性昼夜节律紊乱等行为学特点，因此它是研究免疫炎性反应与老年痴呆相关性的较理想模型。 多年来为阐述清楚老年痴呆症的发病机制还提出了许多的研究学说（譬如：离子通道假说、能量代谢假说、钙平衡失调假说、内分泌失调假说、金属内稳态等假说）和建立了除上述提到的痴呆模型外的许多单一、复合模型（包括多转基因模型），其中复合模型多以两三种学说为建立基础，相对从多方面模拟了老年痴呆

17、的发病机制，然而它们却存在造模周期长、操作性弱、动物生存率低等问题。但从发展来看新的多转基因动物的选育或者复合模型创建乃是未来研究必然趋势，老年痴呆的病机病因也必然在它们贡献下越趋明朗。参考文献1KeesBlankman,MichaelEllenbogen,NoriGraham,et.AlzheimersDisease international World Alzheimer Report 2012 R.2Pope A, Hess H H, Lewin E. Microchemical pathology of the cerebral cortex in pre-senile dement

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