《脂类的测定》PPT课件.ppt

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1、第四节 脂类的测定,4.1 概述 4.2 脂类的测定方法 4.2.1 索氏提取法 4.2.2 酸水解法 4.2.3 氯仿-甲醇提取法 4.2.4 罗紫-哥特里法 4.2.5 巴布科克法,概述,食品中的脂类主要包括脂肪（甘油三酯）和一些类脂质。食品中脂肪有游离态存在形式的，如动物性脂肪及植物性油脂；也有结合态的，如天然存在的磷脂、糖脂、脂蛋白及某些加工品（如焙烤食品及麦乳精等）中的脂肪，与蛋白质或碳水化合物形成结合态。对大多数食品来说，游离态脂肪是主要的，结合态脂肪含量较少。,脂肪在食品中的作用,脂肪是食品中重要的营养成分之一。 脂肪可为人体提供必需脂肪酸。 脂肪是一种富含热能营养素，是人体热能

2、的主要来源。 脂肪是脂溶性维生素的良好溶剂，有助于脂溶性维生素的吸收。 脂肪与蛋白质结合生成脂蛋白，在调节人体生理机能和完成体内生化反应方面都起着十分重要的作用。,脂肪在食品加工中的作用,在食品加工过程中，原料、半成品、成品的脂类含量对产品的风味、组织结构、品质、外观、口感等都有直接的影响。 蔬菜本身的脂肪含量较底，在生产蔬菜罐头时，添加适量的脂肪可以改善产品的风味，对于食品面包之类焙烤食品，脂肪含量特别是卵磷脂组分，对于面包心的柔软度、面包的体积及其结构都有影响。 因此，在含脂肪的食品中，其含量都有一定的规定，是食品质量管理中的一项重要指标。测定食品的脂肪含量，可以用来评价食品的品质，衡量食

3、品的营养价值，而且对实行工艺监督，生产过程的质量管理，研究食品的储藏方式是否恰当等方面都有重要的意义。,脂类的测定方法,常用的测定脂肪的方法有：索氏提取法、酸分解法、氯仿甲醇提取法、罗兹-哥特里法、等。 酸水解法能对包括结合态脂类在内的全部脂类进行定量。 罗兹-哥特里法和巴布科克氏法主要用于乳及乳制品中脂类的测定。,4.2.1 索氏提取法,原理：将经前处理而分散且干燥的样品用无水乙醚或石油醚等溶剂回流提取，使样品中的脂肪进入溶剂中，回收溶剂后所得到的残留物，即为脂肪（或粗脂肪）。 一般食品用有机溶剂浸提，有机溶剂挥发后得到的重量主要是游离脂肪，此外，还含有磷脂、色素、树脂、蜡状物、挥发油、糖脂

4、等物质，所以用索氏提取法测得的脂肪，也称粗脂肪。,适用范围与特点,此法适用于脂类含量较高，结合态的脂类含量较少，能烘干磨细，不易吸湿结块的样品的测定。 索氏提取法测得的只是游离态脂肪，而结合态脂肪测不出来。,仪器设备,索氏提取器,测定方法,将滤纸裁成8cm15cm大小，以直径位2.0cm的大试管为模型，将滤纸紧靠试管壁卷成圆筒型，把底端封口，内放一小片脱脂棉，用白细线扎好定型，在100105烘箱中烘至恒量（准确至0.0002g）。, 滤纸筒的制备, 样品制备 样品于100105烘箱中烘干并磨碎，或用测定水分后的试样。准确称取25g试样于滤纸筒内，封好上口。,索氏抽提取器的准备 索氏抽提取器是由

5、回流冷凝管、提脂管、提脂烧瓶三部分所组成，抽提脂肪之前应将各部分洗涤干净并干燥，提脂烧瓶需烘干并称至恒量,倒入乙醚，满至使虹吸管发生虹吸作用，乙醚全部流入烧瓶。此时，烧瓶中乙醚量约为烧瓶体积2/3。接上回流冷凝器，在恒温水浴中抽提，控制每分钟滴下乙醚80滴左右（夏天约控制650C，冬天约控制800C），抽提34h至抽提完全（视含油量高低，或812h，甚至24h）。, 抽提,回收溶剂,取出滤纸筒，用抽提器回收乙醚，当乙醚在提脂管内将虹吸时立即取下提脂管，将其下口放到盛乙醚的试剂瓶口，使之倾斜，使液面超过虹吸管，乙醚即经虹吸管流入瓶内。按同法继续回收，将乙醚完全蒸出后，取下提脂烧瓶，于水浴上蒸去残

6、留乙醚。用纱布擦净烧瓶外部，于1001050C烘箱中烘至恒量并准确称量。,结果计算,式中X-脂肪含量，g/100g； m1-烧瓶与样品所含脂肪质量，g; m0-烧瓶质量，g; m2-试样质量，g;,4.2.2 酸水解法,某些食品中，脂肪被包含在食品组织内部，或与食品成分结合而成结合态脂类，如，谷物等淀粉颗粒中的脂类，面条、焙烤食品等组织中包含的脂类，用索氏提取法不能完全提取出来。这种情况下，必须要用强酸将淀粉、蛋白质、纤维素水解，使脂类游离出来，再用有机溶剂提取。 此法适用于各类食品总脂肪的测定，特别对于易吸潮，结块，难以干燥的食品应用本法测定效果较好，但此法不宜用高糖类食品，因糖类食品遇强酸

7、易炭化而影响测定效果。 应用此法，脂类中的磷脂，在水解条件下将几乎完全分解为脂肪酸及碱，当用于测定含大量磷脂的食品时，测定值将偏低。故对于含较多磷脂的蛋及其制品，鱼类及其制品，不适宜用此法。,原理：酸分解法的原理是利用强酸在加热的条件下将试样成分水解，使结合或包藏在组织内的脂肪游离出来，再用有机溶剂提取，经回收溶剂并干燥后，称量提取物质量即为试样中所含脂类。 仪器 恒温水浴锅 100ml具塞量筒。 干燥器,操作方法,1水解： 准确称取固体样品2g于50ml大试管中，加入8mL水，用玻璃棒充分混合，加10ml盐酸。 或称取液体样品10g于50mL大试管中，加10mL盐酸。 混匀后于70800C的

8、水浴中，每隔510min用玻璃棒搅拌一次至脂肪游离为止，约须4050min，取出静置，冷却。,取出试管加入10mL乙醇，混合。冷却后将混合物移入100mL具塞量筒中，用25mL乙醚分次冲洗试管，洗液一并倒入具塞量筒内。 加塞振摇1min,将塞子慢慢转动放出气体，再塞好，静置15min，小心开塞，用石油醚-乙醚等量混合液冲洗塞及筒口附着的脂肪。,2 提取,静置10-20min,待上部液体清晰，吸出上层清夜于已恒重的锥形瓶内，再加入5ml乙醚于具塞量筒内振摇，静置后仍将上层乙醚吸出，放入原锥形瓶内。 将锥形瓶于水浴上蒸干，置95-105烘箱中干燥2h，取出放干燥器中冷却30min后称量。,X-脂肪

9、含量，g/100g； m1-锥形瓶与样品所含脂肪质量，g; m0-锥形瓶质量，g; m2-试样质量，g;,(5) 结果计算,4.2.3 氯仿-甲醇提取法,原理：将试样分散于氯仿甲醇混合液中，在水浴中轻微沸腾，氯仿、甲醇和试样中的水分形成三种成分的溶剂，可把包括结合态脂类在内的全部脂类提取出来。经过滤除去非脂成分，回收溶剂，残留的脂类用石油醚提取，蒸馏除去石油醚后定量。,适用范围与特点,本法适合于结合态脂类，特别是磷脂含量高的样品，如鱼、贝类，肉、禽、蛋及其制品，大豆及其制品（发酵大豆类制品出外）等。对这类样品，用索氏提取法测定时，脂蛋白、磷脂等结合态脂类不能被完全提取出来；用酸水解法测定时，又

10、会使磷脂分解而损失。但在有一定水分存在下，用极性的甲醇和非极性的氯仿混合液（简称CM混合液）却能有效的提取出结合态脂类。本法对高水分试样的测定更为有效，对于干燥试样，可先在试样中加入一定量的水，使组织膨润，再用CM混合液提取。,4.2.4 罗紫-哥特里法,此法为国际标准化组织（ISO），联合国粮农组织/世界卫生组织（FAO/WHO）等采用，为乳、炼乳、奶粉、奶油等脂类定量的国际标准法。 它适用于各种液状乳（生乳、加工乳、部分脱脂乳、脱脂乳等）、各种炼乳、奶粉、奶油 及冰淇淋。除乳制品外，也适用于豆乳或加工成乳状的食品。,罗紫哥特里法的原理是利用氨-乙醇溶液，破坏乳的胶体性状及脂肪球膜，使非脂成

11、分溶解于氨-乙醇溶液中而脂肪游离出来，再用乙醚-石油醚提取出脂肪，蒸馏去除溶剂后，残留物即为乳脂。,4.2.5 巴布科克法,原理：用浓硫酸溶解乳中的乳糖和蛋白质等非脂成分，将牛奶中的酪蛋白钙盐转变成可溶性的重硫酸酪蛋白，使脂肪球膜被破坏，脂肪游离出来，再利用加热离心，使脂肪完全迅速分离，直接读取脂肪层的数值，便可知被测乳的含脂率。 适应范围与特点：适用于鲜乳及乳制品脂肪的测定。对含糖多的乳品（如甜炼乳、加糖乳粉等），采用此方法时糖易焦化，使结果误差较大，故不适宜。此法操作简便，迅速。对大多数样品来说测定精度可满足要求，但不如重量法准确。,仪器设备,巴布科克氏乳脂瓶 颈部刻度有0.08.0，0.

12、010.0两种，最小刻度值为0.1，如右图,第五节 碳水化合物的测定,5.1 概述 5.2 还原糖的测定 5.3 蔗糖的测定 5.4 总糖的测定 5.5 淀粉的测定 5.6 纤维素的测定,5.1 概述,碳水化合物,分类,5.2 还原糖的测定,（一）直接滴定法 （二）高锰酸钾法,（一）直接滴定法,原理：将一定量的碱性酒石酸铜甲（硫酸铜、亚甲基蓝）、乙液（酒石酸钾钠、氢氧化钠）等量混合，立即生成天蓝色的氢氧化铜沉淀，这种沉淀很快与酒石酸钾钠反应，生成深蓝色的可溶性酒石酸钾钠铜络合物。在加热条件下，以次甲基蓝作为指示剂，用样液滴定，样液中的还原糖与酒石酸钾钠铜反应，生成红色的氧化亚铜沉淀，待二价铜全

13、部被还原后，稍过量的还原糖把次甲基蓝还原，溶液由蓝色变为无色，即为滴定终点。根据样液消耗量可计算还原糖含量。,适用范围及特点,本法又称快速法，其特点是试剂用量少，操作和计算都比较简便、快速，滴定终点明显。 适用于各类食品中还原糖的测定。但测定酱油、深色果汁等样品时，因色素干扰，滴定终点常常模糊不清，影响准确性。 本法是国家标准分析方法。,操作方法,样品处理 （1）乳类、乳制品及含蛋白质的冷食类,取约2.505.00g固体样品（吸 取25.0050.00ml液体样品）,250ml容量瓶,50ml水,摇匀,5ml乙酸锌 5ml铁氰化钾溶液,加水 定容,混匀，沉淀 静置30min,过滤,滤液,吸取1

14、00ml样品,蒸发皿,1mol/L氢氧 化钠溶液中和,水浴上蒸发至 原体积的 14,250ml容量瓶,水定容,(2)含酒精饮料,（3）含多量淀粉的食品,1020g样品,200ml水,45水浴 中加热 1h,250ml容量瓶,水定容,时时振摇,混匀，静 置，沉淀,过滤,滤液,5ml乙酸锌 5ml铁氰化钾溶液,（4）汽水等含有CO2的饮料,吸取100ml样品,蒸发皿,水浴上除去CO2,250ml容量瓶,水定容,2）碱性酒石酸铜溶液的标定,碱性酒石酸铜甲液和乙液各5ml，水10ml 玻璃珠2粒 加9ml葡萄糖标准溶液 加热使其在2min内沸腾，沸腾30s 葡萄糖标液以1d/2s的速度滴至蓝色褪去,A

15、-10ml碱性酒石酸铜溶液相当于还原糖的质量，mg； V-平均消耗还原糖标准液的总体积，ml； m1mL还原糖标准液相当于还原糖的质量，mg；,A=Vm,碱性酒石酸铜溶液浓度,3）样品溶液预测,碱性酒石酸铜甲液和乙液各5ml，水10ml 玻璃珠2粒 加热使其在2min内沸腾，沸腾30s 以先快后慢的速度滴加样品溶液，并保持溶液呈沸腾状态 ，待颜色变浅时，以1d/2s的速度滴至蓝色褪去,4）样品溶液测定,碱性酒石酸铜甲液和乙液各5ml，水10ml 玻璃珠2粒 加入比预测时少1ml的样品液 加热使其在2min内沸腾，沸腾30s 样品液以1d/2s的速度滴至蓝色褪去,样品中还原糖的计算,式中 X试样

16、中还原糖的含量，%； m样品质量，g； A10ml碱性酒石酸铜溶液相当于葡萄糖 （以葡萄糖汁）的质量，mg； V测定时平均消耗样品溶液的体积， ml； 250样品溶液的总体积，ml。,6、说明与讨论 碱性酒石酸铜甲液和乙液应分别贮存，用时才混合。 滴定必须在沸腾条件下进行 样品必须预测 影响测定结果的主要操作因素：反应液碱度、热源强度、煮沸时间、滴定速度,（二）高锰酸钾滴定,Cu2O ,原理,适用范围及特点,特点：准确度高，重视性好，但操作复杂、费时。 适用范围：本法是国家标准分析方法，适用于各类食品还原糖的测定，尤其是有色样液。,说明与讨论 此法不能用乙酸锌和亚铁氰化钾作为澄清剂，使用的澄清

17、剂为10ml碱性酒石酸铜甲液+ 4ml 40g/L的氢氧化钠溶液 此法所用碱性酒石酸铜溶液是过量的，煮沸后的反应液应呈蓝色(酒石酸钾钠铜络离子)。如不呈蓝色，说明样液含糖浓度过高，应调整样液浓度。 在过滤及洗涤氧化亚铜沉淀的整个过程中，应使沉淀始终在液面以下，避免氧化亚铜暴露于空气中而被氧化。,5.3 蔗糖的测定,（一）蔗糖测定意义 1、蔗糖的含量可以判断食品加工原料的成熟度 2、可以鉴别白糖、蜂蜜等食品原料的品质 3、可作为控制果糖、果脯、加糖乳制品等产品的质量指标,原理:样品脱脂后，用水或乙醇提取，提取液经澄清处理以除去蛋白质等杂质，再用盐酸进行水解，使蔗糖转化为还原糖。然后按还原糖测定方

18、法分别测定水解前后样品液中还原糖含量，两者差值即为由蔗糖水解产生的还原糖量，乘以一个换算系数即为蔗糖含量。,操作方法,样品,预处理,样品处理液,样液50ml,样液50ml,还原 糖测定,5ml6mol/L 盐酸,6870水浴15min,20%NaOH中和,定容至100ml,还原 糖测定,结果计算,式中 w-蔗糖的质量分数，%； m1-未经水解的样品中还原糖量，mg； m2-经过水解的样品中还原糖量，mg； m-样品质量，g； V1 -样品处理液的总体积，ml； V2 -测定样品还原糖取用的样品处理液体积，ml； 0.95-还原糖换算为蔗糖的系数。,5.4 总糖的测定,（一）概念 食品中的总糖通

19、常是指具有还原性的糖（葡萄糖、果糖、乳糖、麦芽糖等）和在测定条件下能水解为还原性单糖的蔗糖的总量。 （二）测定方法 1、直接滴定法,预处理,样品提取液,还原糖液,盐酸水解,样品,直接滴定法 测还原糖含量,5.4.1 直接滴定法原理,操作方法,同蔗糖操作。,5.5 淀粉的测定,淀粉粒的特性:淀粉在植物细胞内以颗粒状态存在，故称淀粉粒。 形状：圆形、椭圆形、多角形等。 大小： 0.0010.15毫米之间，马铃薯淀粉粒最大，谷物淀粉粒最小。 晶体结构：用偏振光显微镜观察及X-射线研究，能产生双折射及X衍射现象,1、玉米 2、马铃薯 3、稻米 4、小麦,特性,淀粉的物理性质:白色粉末在热水中融溶胀。

20、纯支链淀粉能溶于冷水中，而直链淀粉不 能，直链淀粉能溶于热水。无还原性,遇碘呈蓝色，加热则蓝色消失，冷后呈蓝色。 糊化:淀粉粒在适当温度下，在水中溶胀，分裂，形成均匀的糊状溶液的过程被称为糊化。其本质是微观结构从有序转变成无序。 淀粉测定方法： 1.用酸或淀粉酶将淀粉分解为单糖后测定 2.用重金属盐将蛋白质,单宁等除去.用显色剂显色后进行比色分析。,酸水解法,原理：,淀粉样品,乙醚、乙醇洗涤,淀粉,酸水解,还原糖,还原糖法测定含量,折算为淀粉含量,淀粉含量=还原糖含量0.9,操作步骤,样品处理 粮食、豆类、糕点、饼干等较干燥食品。 蔬菜、水果、各类粮豆含水熟食制品。 测定 按照还原糖测定直接滴

21、定法进行操作,计算,式中 X-试样中淀粉的含量，%； A1-测定用试样水解液中还原糖量，mg； A2-试剂空白试样中还原糖量，mg； m-样品质量，g； V1 -测定用样品处理液的体积，ml； 500 -试样处理液总体积，ml； 0.9-还原糖换算为淀粉的系数。,5.6 纤维素的测定,粗纤维是植物性食品的主要成分之一，广泛存在于各种植物体内。化学上不是单一组分，是混合物。 粗纤维主要成分是纤维素、半纤维素、木质素等。集中存在于谷类的麸、糠、秸杆、果蔬的表皮等处。对稀酸、稀碱难溶，人体不能消化利用的部分。 纤维素构成植物细胞壁的主要成分，是葡萄糖聚合物，由1，4糖苷键连接，人类及大多数动物利用它

22、的能力很低。不溶于水，但能吸水。,半纤维素一种混合多糖，不溶于水而溶于碱、稀酸，加热比纤维素易水解，水解产物有木糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖等。 木质素不是碳水化合物，是一种复杂的芳香族聚合物，是纤维素的伴随物。难以用化学手段或酶法降解，在个别有机溶剂中缓慢溶解。 膳食纤维(食物纤维) 它是指食品中不能被人体消化酶所消化的多糖类和木质素的总和。它包括纤维素、半纤维素、戊聚糖、木质素、果胶、树胶等，至于是否应包括作为添加剂添加的某些多糖(羧甲基纤维素、藻酸丙二醇等)还无定论。,测定方法,食品中纤维的测定提出最早、应用最广泛的是重量法。此外还有中性洗涤纤维法、酸性洗涤纤维法、酸解重量法等分析方法。

23、这些方法各有优、缺点。,粗纤维的测定（重量法）,原理：在热的稀硫酸作用下，样品中的糖、淀粉、果胶等物质经水解而除去，再用热的氢氧化钾处理，使蛋白质溶解、脂肪皂化而除去。然后用乙醇和乙醚处理以除去单宁、色素及残余的脂肪，所得的残渣即为粗纤维，如其中含有无机物质，可经灰化后扣除。,适用范围及特点,该法操作简便、迅速，适用于各类食品，是应用最广泛的经典分析法。目前，我国的食品成分表中“纤维”一项的数据都是用此法测定的，但该法测定结果粗糙，重现性差。由于酸碱处理时纤维成分会发生不同程度的降解，使测得值与纤维的实际含量差别很大，这是此法的最大缺点。,中性洗涤纤维（NDF）的测定,原理：样品经热的中性洗涤

24、剂浸煮后，残渣用热蒸馏水充分洗涤，除去样品中游离淀粉、蛋白质、矿物质，然后加入一淀粉酶溶液以分解结合态淀粉，再用蒸馏水、丙酮洗涤，以除去残存的脂肪、色素等，残渣经烘干，即为中性洗涤纤维 (不溶性膳食纤维)。,第六节 蛋白质及氨基酸的测定,6.1 概述 6.2 蛋白质的测定凯氏定氮法 6.3 氨基酸的测定点位滴定法,6.1 概述,蛋白质是含氮的有机化合物，分子量很大。主要由C、H、O、N、S五种元素组成。某些蛋白质中还含有微量的 P、Cu、Fe、I 等。 在食品和生物材料中常包括蛋白质，可能还包括有非蛋白质含氮的化合物，（如核酸、含氮碳水化合物、生物碱等；含氮类脂、卟啉和含氮的色素）。,蛋白质的

25、测定方法分两大类： 一类是利用蛋白质的共性即含氮量、肽键和折射率等测定蛋白质含量。 另一类是利用蛋白质中的氨基酸残基、酸性和碱性基因以及芳香基团等测定蛋白质含量。 常用方法 凯氏定氮法最常用的，国内外应用普遍。 双缩脲反应、染料结合反应、酚试剂法 国外： 红外分析仪,食品和其原料中蛋白质含量的测定，主要（也是最常用的）用凯氏定氮法测定总氮量，然后乘一个蛋白质换算系数。这里也包括非蛋白的氮，所以只能称为粗蛋白的含量（但马铃薯等非蛋白氮多的要单测）。 蛋白质是生命的物质基础，人体11%13%总热量来自蛋白质。无论动物、植物都含有蛋白质，只是含量及类型不同。 蛋白质是食品的最重要质量指标，其含量与分

26、解产物直接影响食品的色、香、味。,6.2 蛋白质的测定凯氏定氮法,一般说来，动物性食品的蛋白质含量高于植物性食品。例如牛肉中蛋白质含量为 20.0%左右，猪肉 9.5%， 兔肉 21%， 鸡肉 20%， 牛乳 3.5%， 带鱼 18.0%， 大豆 40%，面粉 9.9%， 菠菜 2.4%， 黄瓜 1.0%，苹果 1.4% 测定食品中的蛋白质的含量，对于评价食品的营养价值，合理开发利用食品资源、提高产品质量、优化食品配方、指导经济核算及生产过程控制均具有极其重要的意义。,（一）常量凯氏定氮法,原理：样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机

27、氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出。 也可以用过量的标准H2SO4或标准HCl溶液吸收后再以标准NaOH滴定过量的酸。 用H3BO3吸收后再以标准HCl溶液滴定。根据标准酸消耗量可以计算出蛋白质的含量。,整个过程分三步：消化、蒸馏、吸收与滴定,1. 消化 总反应式：,加硫酸钾 作为增温剂，提高溶液沸点， 纯硫酸沸点 340，加入硫酸钾之后可以提高 至400以上。也可加入硫酸钠，氯化钾等提 高沸点，但效果不如硫酸钾。, 加硫酸铜 作为催化剂。还可以作消化终点指示剂，做蒸馏时碱性指示剂。, 加氧化剂 如双氧水、次氯酸钾等加速有机 物氧化速度。,浓H2SO4： A：脱水使有机物炭化

28、，然后有机物炭化生成碳，碳将H2SO4还原为SO2，本身则变为CO2 B： 氧化 C： 蛋白质与浓H2SO4生成NH3，CO2，SO2，H2O D： NH3与H2SO4生成硫酸铵,仪器：143页 要防止爆沸。,2. 蒸馏 消化液 + 40%氢氧化钠加热蒸馏，放出氨气。,3. 吸收与滴定 用4%硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定，指示剂用混合指示剂（甲基红溴甲基酚绿混合指示剂）国标用亚甲基兰+甲基红。 指示剂 红色 绿色 红色 （酸） （碱） （酸） 用过量的 H2SO4 或 HCl 标准溶液吸收，再用 NaOH 标准溶液滴定过剩的酸液，用甲基红指示剂。,吸收,滴定,操作步骤,准确称取样品中0.20-

29、2.00g于500ml凯氏瓶中加10g无水K2SO4加0.5gCuSO4加20ml H2SO4在通风橱中先以小火加热，待泡沫消失后，加大火力，消化至透明无黑粒后，将瓶子摇动一下使瓶壁炭粒溶于硫酸中继续消化30分钟至样液呈蓝绿色状态，停止消化，冷却加200ml水连接蒸馏装置用硼酸作吸收液在K氏瓶中加玻璃珠数粒和80ml 50% NaOH振摇会出现深蓝色或产生褐色沉淀 再加100mL水加热至到K氏瓶内残液减少到三分之一时，取出冷凝管下端，用水冲洗，继续蒸1min用0.1000mol/L HCl滴定。,结果计算： 式中 w蛋白质的质量分数，%； c盐酸标准液的浓度，mol/L； V0空白滴定消耗盐酸

30、标准液量，mL； V1试剂滴定消耗盐酸标准液量，mL； m样品质量，g； 14氮的摩尔质量，g/mol； F蛋白质系数。一般为 6.25 也可查表。,说明：, 所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。 消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，以免粘贴在凯氏瓶内壁上的含氮化合物在无硫酸存在的情况下消化不完全而造成氮损失。 消化时应注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下，并促进其消化完全。 样品中若含脂肪或糖较多时，消化过程中易产生大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始消化时应用小火加热，并时时摇动；或者加入少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控制热源强度。 当样品消化液不易澄清透

31、明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入30过氧化氢 23 mL 后再继续加热消化。, 若取样量较大，如干试样超过5 g 可按每克试样5 mL的比例增加硫酸用量。 般消化至呈透明后，继续消化30分钟即可，但对于含有特别难以氨化的氮化合物的样品如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等时，需适当延长消化时间。有机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色。 蒸馏装置不能漏气。 蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成氢氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量。 蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗管口，再蒸1分钟后关掉热源否则可能造成吸收液倒吸。,(二) 微量凯氏定氮法,1、原理及适用范围

32、同前 2、与常量法不同点： 加入硼酸量由50 ml 10 ml, 滴定用盐酸浓度由0.1 mol/L 0.01 mol/L , 可用微量滴定管。,6.3 氨基酸的测定点位滴定法,原理：根据氨基酸两性的作用，加入甲醛以固定氨基的碱性，使羧基显示酸性，将酸度计的玻璃电极及甘汞电极同时插入被测液中构成电池，用氢氧化钠标准溶液滴定，根据酸度计指示的pH值判断和控制终点。 本方法快速准确，可用于各类样品游离氨基酸含量测定。 对于浑浊或色深样品可不经处理而直接测定。,操作方法,吸取含氨基酸约20mg的样品溶液于100mL容量瓶中，加水至标线，混匀后吸取20.0mL置于200mL烧杯中，加水60mL，开动磁

33、力搅拌器，用0.0500mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至酸度计指示pH8.2，记录消耗氢氧化钠标准溶液mL数，供计算总酸含量。 加入10.0mL甲醛溶液，混匀。再用上述氢氧化钠标准溶液继续滴定至pH9.2，记录消耗氢氧化钠标准溶液毫升数(V1)。 同时取80mL蒸馏水置于另一200mL洁净烧瓶中，先用氢氧化钠标准溶液调至pH82，（此时不计碱消耗量），再加入10.0mL中性甲醛溶液，用0.05mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至pH9.2，记录消耗氢氧化钠标准溶液毫升数(V2),作为试剂空白试验。,结果计算： 式中 w试样中氨基酸态氮的质量分数，%； c氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L； V0空

34、白实验滴定至终点（pH8.2）时消耗氢氧化钠标准液的体积，mL； V1滴定至终点（pH8.2）时消耗氢氧化钠标准液的体积，mL； m测定用试样溶液相当于试样的质量，g； 0.0141mL氢氧化钠标准溶液相当于氮的质量，g/mol；,第七节 维生素的测定,7.1 概述 7.2 脂溶性维生素的测定 7.3 水溶性维生素的测定,7.1 概述,维生素：是维持人体正常生命活动所必需的一类天然有机化合物。其种类很多，目前已确认的有30余种，其中被认为对维持人体健康和促进发育至关重要的有20余种。这些维生素结构复杂，理化性质及生理功能各异，有的属于醇类，有的属于胺类，有的属于酯类，还有的属于酚或醌类化台物。

35、,维生素都具有以下共同特点： 这些化合物或其前体化合物都在天然食物中存在； 它们不能供给机体热能。也不是构成组织的基本原料，主要功用是通过作为辅酶的成份调节代谢过程，需要量极小； 它们一般在体内不能合成，或合成量不能满足生理需要，必须经常从食物中摄取； 长期缺乏任何一种维生素都会导致相应的疾病。,我们在评价食品的营养价值，开发利用高含量维生素的食品资源，指导人们合理调整膳食结构，指导制定加工工艺或贮存条件，最大限量地保留各种维生素，还要控制强化食品中加入量，防中毒，都离不开分析检测工作。 维生素分类： 脂溶性（A、D、E、K） 水溶性两类（B族、C）,7.2 脂溶性维生素的测定,VA、VD、V

36、E与类脂物一起存于食物中，摄食时可吸收，可在体内积贮。脂溶性维生素具有以下理化性质： 1溶解性：脂溶性维生素不溶于水，易溶于脂肪、乙醇、丙酮、氯仿、乙醚、苯等有机溶剂。 2耐酸碱性：维生素A、D对酸不稳定， 对碱稳定，维生素E对碱不稳定，但在抗氧化剂存在下或惰性气体保护下，也能经受碱的煮沸。,3耐热性、耐氧化性： 耐热性 氧化性 VA 好，能经受煮沸 易被氧化 （光、热 促进其氧化） V D 好，能经受煮沸 不易被氧化 V E 好，能经受煮沸 在空气中能慢慢被化 （光、热、碱促进其 氧化）,维生素A和维生素E的测定,维生素A存在于动物性脂肪中，主要来源于肝脏、鱼肝油、蛋类、乳类等动物性食品中。

37、植物性食品中不含VA，但在深色果蔬中含有胡萝卜素，它在人体内可转变为VA，故称为VA原。 维生素E（Vitamin E）是一种脂溶性维生素，又称生育酚，是最主要的抗氧化剂之一。溶于脂肪和乙醇等有机溶剂中，不溶于水，对热、酸稳定，对碱不稳定，对氧敏感，对热不敏感，但油炸时维生素E活性明显降低。,生育三烯酚,生育酚,（一）高效液相色谱法测定食物中VA、VE,（GB/T 5009.822003中第一法） 高效液相色谱法测定维生素A是近几年发展起来的方法，此法能快速分离和测定视黄醇和它的同分异构体、酯及其衍生物。这里介绍的是同时测定维生素A和维生素E的方法。 测定原理：样品中的VA和VE经皂化提取处理

38、后，将其从不可皂化部分提取至有机溶剂中。用高效液相色谱法C18反相柱将维生素A和维生素E分离，经紫外检测器检测，并用内标法定量测定。,仪器设备,仪器： 高效液相色谱仪（带紫外检测器） 其它见课本（P147） 试剂 见课本P148,操作方法,（1）试样处理 皂化：称取110g样品（含维生素A约3g，维生素E约40g)于皂化瓶中，加30mL无水乙醇，进行搅拌， 直到颗粒物分散均匀为止。加5mL 10抗坏血酸，苯并e芘标准液2.00mL，混匀。加10mL(1+1)氢氧化钾，混匀。于沸水浴上回馏30min使皂化完全。皂化后立即于水中冷却。 提取：将皂化后的样品移入分液漏斗中，用50mL水分23次洗皂化

39、瓶，洗液并入分液漏斗中。用约100mL乙醚分两次洗皂化瓶及其残渣，乙醚液并入分液漏斗中。如有残渣，可将此液通过有少许脱脂棉的漏斗滤入分液漏斗。轻轻振摇分液漏斗2min，静置分层，弃去水层。,洗涤：用约50mL水洗分液漏斗中的乙醚层，水洗至水层不显碱性，（最初水洗轻摇，逐次振摇强度可增加）。 浓缩：将乙醚提取液经过无水硫酸钠（约5g）滤入与球形蒸发瓶内，用约100mL乙醚冲洗分液漏斗及无水硫酸钠3次，入蒸发瓶内，并将其接至旋转蒸发器上，于55C水浴中减压蒸馏并回收乙醚，待瓶中剩下约2mL乙醚时，取下蒸发瓶，立即用氮气吹掉乙醚。加入2.00mL乙醇，充分混合，溶解提取物。将乙醇液移入一小塑料离心管

40、中，离心5min（5000rpm)。上清液供色谱分析。,标准曲线的制备,将维生素A和维生素E标准品配置成标准溶液（约1mg/mL），制备标准曲线前用紫外分光光度法标定其准确浓度。标准浓度的标定方法 取维生素A和维生素E标准液若干微升，分别稀释至10.00mL乙醇中，并分别按给定波长测定各维生素的吸光值。用比吸光系数计算该维生素的浓度。,测定条件,标准物 比吸光系数 E1%cm 波长，nm 视 黄 醇 1835 325 生育酚 71 294 生育酚 92.8 298 生育酚 91.2 298,标准浓度计算： c1 = A/E1/10010.00/(S10-3) 式中：c1维生素A浓度，g/mL；

41、 A 维生素A的平均紫外吸收值； S 加入标准的量，L； E 维生素A 1%比吸光值； 10.00/(S10-3)标准液稀释倍数,标准浓度计算： X1 = A/E1/10010.00/(S10-3) 式中：X1维生素A浓度，g/mL； A 维生素A的平均紫外吸收值； S 加入标准的量，L； E 维生素A 1%比吸光值； 10.00/(S10-3)标准液稀释倍数,绘制标准曲线 标准和内标物进行色谱分析，以维生素A峰面积与内标物峰面积之比为纵坐标，维生素A浓度为横坐标绘制标准曲线。 高效液相色谱分析 预柱: ultrasphere ODS 10m, 4mm4.5cm 分析柱:ultrasphere

42、 ODS 5m, 4.6mm25cm 流动相:甲醇:水98:2 混匀,于临用前脱气 紫外检测器波长：300nm 进样量：20L 流速：1.7mL/min,试样分析 定性：用标准物色谱峰的保留时间定性。 定量：根据色谱图求出某种维生素与内标物峰面积的比值，以此值在标准曲线上查到其含量，或用回归方程求出其含量。 计算：,式中：X维生素的含量，mg/100g； c 标准曲线上查到某种维生素的含量，g/mL； V 试样浓缩定容体积，mL； m试样质量，g；,（二）维生素D的测定,维生素D为固醇类衍生物，具抗佝偻病作用，其中最重要的是D2和D3。植物不含维生素D，但维生素D原在动、植物体内都存在。植物中

43、的麦角醇为维生素D2原，经紫外照射后可转变为维生素D2，又名麦角钙化醇；人和动物皮下含的7-脱氢胆固醇为维生素D3原，在紫外照射后转变成维生素D3，又名胆钙化醇。以D3为最重要。 维生素D2 药片吃多了中毒。,分析方法中较好的是比色法和高效液相色谱法。是AOAC选定的正式方法。,维生素D的结构,三氯化锑比色法,原理：在三氯甲烷溶液中，维生素D与三氯化锑结合生成一种黄色化合物，呈色强度与维生素D含量呈正比。在500nm波长下测定其吸光值。 食品中维生素D含量较低，其他维生素严重干扰其测定，因此测定前必须经柱层析除去干扰成分。层析介质为硅藻土、中性氧化铝 此法测定的是维生素D2和维生素D3的总量。

44、 仪器试剂：见课本P150。,7.3 水溶性维生素的测定,水溶性维生素B1、B2和C，广泛存在于动植物组织中，饮食来源充足。但是由于它们本身的水溶性质，除满足人体生理、生化作用外，任何多余量都会从小便中排出。为避免耗尽，需要经常地由饮食来提供。 测定维生素C的方法有荧光法（第一法）、2，4二硝基苯肼光度法（第二法）、靛酚滴定法及高效液相色谱法等。,根据上述性质，测定水溶性维生素时，一般都在酸性溶液中进行前处理。,维生素Bl、B2 盐酸水解 酶解 提取 纯化 维生素C通常采用草酸、草酸醋酸、偏磷酸醋酸溶液直接提取。在一定浓度的酸性介质中，可以消除某些还原性杂质对维生素C的破坏作用。草酸价廉，使用

45、方便，对维生素C有很好,维生素C的测定,维生素C是一种己糖醛基酸，有抗坏血病的作用，所以又称作抗坏血酸。维生素C广泛存在于植物组织中，新鲜的水果、蔬菜，特别是枣、辣椒、苦瓜、柿子叶、猕猴桃、柑桔等食品中含量尤丰富。 维生素C具有较强的还原性，对光敏感，氧化后的产物称为脱氢抗坏血酸，仍然具有生理活性。进一步水解则生成2，3 -二酮古乐糖酸，失去生理作用。,2，6二氯靛酚滴定法,原理 还原型抗坏血酸可以还原染料2，6-二氯靛酚。该染料在酸性溶液中呈粉红色(在中性或碱性溶液中呈蓝色)，被还原后颜色消失。 还原型抗坏血酸还原染料后，本身被氧化成脱氢抗坏血酸。在没有杂质干扰时，一定量的样品提取液还原标准染料液的量，与样品中抗坏血酸含量成正比。,2，4二硝基苯肼比色法,GB/T 5009.862003 蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸含量测定方法第二法 可测总抗坏血酸，总抗坏血酸包括还原型、脱氢型和二酮古乐糖酸型。此法是将样品的还原型抗坏血酸氧化为脱氢型抗坏血酸，然后与2，4-二硝基苯肼作用，生成红色的脎。脎的量与总抗坏血酸含量成正比，将红色脎溶于硫酸后进行比色，由标准曲线计算样品中总VC。,