生物药物分析所有课件,便于打印.ppt

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1、生物药物分析,生物工程教研室 曾叶霖 E-Mail : ,课程主要内容,主要参考书目 生物药物分析 白秀峰 中国医药科技出版社 生物药物分析 何华 化学工业出版社 药物分析 孙莹 吕洁 人民卫生出版社,生物药物分析学概述,药物分析的性质 药学的分支学科，是药学和分析学的交叉学科 包括药物的检验、药物稳定性、生物利用度、药物临床监测和生物药物检定等多方面的定性定量分析 目的是确保药物的质量及病人的用药安全有效,生物药物分析学概述,药物分析的任务 对药物生产过程的控制 对药物贮运进行检测 对临床用药进行监护 配合药物研究部门进行新药与新剂型的研制 提高药物工作者的素质,生物药物分析学概述,强生儿童

2、退烧药召回事件,维C银翘片含毒,拜耳避孕药停售,生物药物分析学概述,药物质量标准 药典是国家对药物质量标准及其检验方法所做的技术规定，是药物生产、监控、供应、使用及管理部门共同遵循的法令。 药典一般包括凡例、正文、附录、索引四部分,生物药物分析学概述,药典（药物质量标准、分析方法） 药典是国家对药物质量标准及其检验方法所做的技术规定，是药物生产、监控、供应、使用及管理部门共同遵循的法令。 药典与分析方法,生物药物分析学概述,药典（药物质量标准、分析方法） 药典一般包括凡例、正文、附录、索引四部分 “凡例”是解释和使用药典进行质量检定的基本原则与一致规定。,生物药物分析学概述,药典（药物质量标准

3、、分析方法）,生物药物分析学概述,药典（药物质量标准、分析方法） 药典一般包括凡例、正文、附录、索引四部分 正文部分为所收载的每种原料药和制剂的质量标准，包括名称、分子结构式、分子式、分子量、含量限度、性状、鉴别、检查、含量测定、类别、规格、贮藏条件等。,生物药物分析学概述,药典（药物质量标准、分析方法）,生物药物分析学概述,药典（药物质量标准、分析方法） 药典一般包括凡例、正文、附录、索引四部分 附录主要收载制剂通则、通用检测方法和指导原则。包括制剂通则，生物制品通则，光学、色谱学检查方法，一般杂质检查方法，特殊杂质检查方法，微生物限度检查法，抗生素微生物检定法等。,生物药物分析学概述,药典

4、（药物质量标准、分析方法） 药典是国家对药物质量标准及其检验方法所做的技术规定，是药物生产、监控、供应、使用及管理部门共同遵循的法令。 药典与分析方法,生物药物分析学概述,生物药物概述 包括生化药物、生物技术药物和生物制品。 特点： 相对分子质量的测定 生物活性检查 安全性检查 效价测定 生化法确证结构,生物药物分析学概述,生物药物的科学管理 GLP良好药物实验研究规范 GMP良好药品生产规范 GSP良好药品供应规范 GCP良好药品临床试验规范,生物药物分析学概述,生物药物的分析检验 药物的取样 药物的鉴别 药物的杂质检查 药物的安全性检查 药物的含量（效价）测定 检查报告的书写,药物的鉴别,

5、药物鉴别目的 判断药物的真伪 药物鉴别的特点 药物分析的首要任务 为已知药物的确证试验 个别分析 化学鉴别试验要有明确的现象 鉴别试验条件要准确,性状,一般鉴别试验,专属鉴别试验,药物的鉴别,药物鉴别的内容,外观 溶解度 物理常数,某一类药物的依据： 苯甲酸盐 钠盐 硫酸盐 氯化物等,某一种药物的依据,生物药物的杂质检查,杂质及其来源 药物中无治疗作用，或影响药物的稳定型和疗效，甚至对人体健康有害的物质 药物纯度和一般化学品及试剂的要求不同 生产过程引入杂质 贮存过程引入杂质,生物药物的杂质检查,杂质的种类 按性质分为影响药物稳定性的杂质、毒性杂质和信号杂质 按来源分为一般杂质和特殊杂质,生物

6、药物的杂质检查,杂质检查的原理 利用生物药物和杂质在物理性质上的差异 利用生物药物和杂质在化学性质上的差异,药物的杂质检查方法 对照法 限量检查法 （Limit Test） 特点：不需知道杂质的准确含量,生物药物的杂质检查,药物的杂质检查方法 灵敏度法 系指在供试品溶液中加入试剂，在一定反应条件下，不得有正反应出现 特点：不需对照品,生物药物的杂质检查,药物的杂质检查方法 比较法 含量测定法：测定杂质的绝对含量，如测定吸收度、pH值等。 特点：准确测定杂质的量，不需对照品,生物药物的杂质检查,生物药物的杂质检查,一般杂质检查 指在自然界中分布比较广泛，在多种药物的生产和贮存过程中容易引入的杂质

7、 检查项目有氯化物、硫酸盐、水分、酸、碱、硫化物、硒、氟、氰化物、铁盐、重金属、砷盐、铵盐、易炭化物、干燥失重、炽灼残渣、溶液颜色与澄清度等,仪器的配对性 如纳氏比色管应配对，刻度线高低相差不超过2mm，砷盐检查时导气管长度及孔的大小要一致 对照品与供试品的同步操作,生物药物的杂质检查,一般杂质检查规则,药品检验操作标准规定： 遵循平行操作原则,正确的取样及供试品的称量范围 1g不超过2%，1g不超过1%,正确的比色、比浊方法,检查结果不符合规定或在限度边缘时应对供试管和对照管各复查二份,生物药物的杂质检查,氯化物检查法,（一）原理 对照法,（二）测定条件,1. 标准NaCl溶液 10gCl/

8、ml，50ml溶液中含5080g的Cl所显浑浊梯度明显，相当于标准NaCl溶液58ml。,2. 反应需在硝酸酸性条件下进行，且以50ml供试溶液中含稀硝酸10ml为宜。,（1）加速AgCl浑浊的形成；,（2）产生较好的乳浊；,（3）避免弱酸银盐如碳酸银、磷酸银以及氧化银沉淀的形成。,3. 试剂：硝酸银,5. 避光、暗处放置5分钟后比浊，因氯化银见光易分解。,4. 供试液和对照液稀释后，再加硝酸银溶液，使生成白色浑浊而不是白色沉淀,6. 比浊方法：同置于黑色背景上，自上向下观察。,7. 平行操作原则,（四）干扰及排除,1. 若供试品有色，需经处理后方可检查。,（1）内消色法：倍量法，如枸橼酸铁铵

9、中氯化物的检查。,（2）外消色法：如高锰酸钾中氯化物的检查，可先加乙醇适量，使其还原褪色后再依法检查。,2. 当有其它干扰物质存在时，必需在检查前除去 （1）碘中氯化物的检查 （2）碘化物中氯化物的检查 （3）溴化物中氯化物的检查,3. 不溶于水的有机药物,（1）加水振摇，过滤，取滤液进行检查。,（2）加热，放冷，过滤，取滤液进行检查。,（3）溶于有机溶剂如稀乙醇、丙酮，可加稀乙醇或丙酮溶解后进行检查。,澄清度检查法,检查药物中的微量不溶性杂质，用作注射剂的原料药一般应作此项检查。,1. 检查方法 对照法,2. 浊度标准液的配制,中国药典规定用浊度标准液作为澄清度检查的标准。,反应原理：乌洛托

10、品在偏酸性条件下水解产生甲醛，甲醛与肼缩合生成甲醛腙，不溶于水，形成白色浑浊。,1.00硫酸肼溶液与10乌洛托品溶液等量混合配制浊度标准贮备液 浊度标准原液 浊度标准液（5个级号）,3. 判断 药典中规定的“澄清”，系指供试品溶液的澄清度相同于所用溶剂，或未超过0.5号浊度标准液。,4. 溶剂：水、酸、碱、有机溶剂 有机酸的碱金属盐类药物强调用“新沸过的冷水”,有机溶剂残留量测定法,1. 有机溶剂残留量测定法 是用以检查药物在生产过程中引入的有害有机溶剂，包括苯、氯仿、二氧六环、二氯甲烷、吡啶、甲苯及环氧乙烷。,2. 检查方法 中国药典采用气相色谱法检查残留有机溶剂,色谱条件： 固定相：直径为

11、0.250.18mm的二乙烯苯乙基乙烯苯型高分子多孔小球,载气：氮气 检测器：氢火焰离子化检测器检测 柱温：80170,色谱系统适用性试验：中国药典规定，在残留溶剂测定前应作色谱系统适用性试验。,生物药物的杂质检查,特殊杂质检查 指药物在生产和贮存过程中，有可能引入的中间体、分解产物以及副产物杂质 安全性检查 生物药物还有一类特殊杂质需要检查，对生物体产生特殊生理作用。,生物药物的杂质检查,异常毒性检查法 热原检查法 升压物质检查法 降压物质检查法 致敏物质检查法,,Thank You !,,微 生 物 限 度 检 查 法,1微生物限度检查法概述 2我国药品微生物限度标准的发展情况 3我国药品

12、微生物限度检验方法的发展情况 4微生物限度检查法所需的材料 5微生物限度检查试验用物品的准备 6无菌室技术要求 7细菌、霉菌与酵母菌的检查方法 供试品的抽样、保存及检验量 试验操作前的准备 供试液的制备 对照用菌液的制备,菌数测定阴性对照试验 细菌、霉菌（酵母菌）检验程序 供试液的稀释（10倍递增稀释法） 注平皿 倾注培养基 培养 菌落计数 菌数报告规则 注意事项 8.细菌、霉菌（酵母菌）的其他检查方法 管稀释法（试管法、MPN法） 滤膜法 计数板法 仪器法 平板涂布法,表面涂抹平板法 滤膜培养法 酵母菌镜检计数法 9. 大肠杆菌检查法 概述、原理 检验程序 增菌培养 分离培养 纯培养、革兰染

13、色、镜检 生化试验（IMViC） 实验中的注意事项 10沙门菌检查法 11铜绿假单胞菌检查法 12金黄色葡萄球菌检查法 13破伤风梭菌检查法 14活螨检查法 15结果判断,1微生物限度检查法的意义 药品是防病治病、关系用药者生命健康的特殊商品，必须保证其质量，用药的安全与有效。微生物污染药品引起的药源性疾病屡见不鲜，在国内外均有报道。为保证药品质量，必须对微生物污染进行必要的控制和检验。其意义在于： 已有许多实例表明，药品污染微生物不仅危及病人用药安全，而且也直接影响药品的有效性，所以药品卫生质量是药品质量不可分割的部分。 反映药品生产工艺的科学性、合理性及质量管理水平。通过检验，凡工艺条件、

14、生产管理水平、生产人员的素质差，不注意文明生产的单位和企业，其生产的药品，染菌必然严重，不合格率无疑就高。微生物限度的检验是提供药品卫生质量状况的重要依据，因而保证销售与使用过程中药品的有效性与安全性，是促进与提高生产单位全面质量管理水平与提高药品质量的重要依据。,微生物限度检查法概述,2微生物限度检查的范围 根据药品使用的要求，可划分为两大类： 规定灭菌的药品：包括注射剂和输液剂，及用于体腔、严重烧伤、溃疡、出血及眼科用药等制剂。 非规定灭菌药品：包括常用的口服制剂与一般外用制剂。对这一部分制剂一般不要求绝对无菌，允许一定限量的微生物存在，但同时规定不得有可疑致病的细菌存在。由于致病菌的范围

15、很广，各国药典都规定了几个常见的致病菌或指标菌作为控制菌。 在非规定灭菌的制剂中，对每克或每毫升的药品按剂型或品种不同规定： 染菌量检查：包括细菌数、霉菌数及酵母菌数测定，以检查这几类微生物对药品的污染程度。 控制菌检查：包括大肠埃希菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌及铜绿假单胞菌的检查等。,3药品微生物限度检查抽样量与检验量 药品微生物限度检验中的困难，最根本的原因在于检验对象本身的特殊性。 药品微生物限度检验对象的特性： 不确定性：药品受外来微生物的污染，这种污染是可无可有；在有中又可多可少；其种类可以多样。污染的情况可依生产、设备、原材料、管理、剂型等条件而定，非药品本身所固有。所以微生物限度检

16、查的对象是不确定的。药品所规定的检查项目，除无菌检查、热原检查具有上述性质，其他项均无此特征。这一点往往被忽视。污染对药品而言是一个意外事件。污染批号中的不合格品是一个随机变量。 分布的不均匀性：不均匀性是不确定性的另一种表现形式，在一个批号内产品有的被污染，有的不被污染，分布不匀；在被污染的部分中有的数量极多，有的较少，种类上可以复杂或较单一。这种不均匀性源于污染源的复杂性；原辅料 污染、工艺污染、空间污染,和操作人员污染等等构成污染量的多少差异，形成不均态。再者，微生物具有簇团性；簇团大小、紧密程度是可遗传的，簇团的分散性差异极大，该特点无疑强化了不均匀性。 活体特征：药典中以活的微生物作

17、为检验对象也是独特特性。 由于以上特殊性，抽样对微生物限度检测值将产生很大的影响。当药品无污染时，抽样将不影响检验，当批产品存在污染品时，抽样的样本是随机变量，抽样的影响如下： 抽样方法：不同的抽样方法对批产品总体的代表性是不同的，测定值也是有差异的。如抽取可疑样品与随机抽样，其检出率与数字显然前者大于后者。 抽样量：抽样量的多少，对样本的代表性极为重要，如含10不合格率的批产品，从中抽取2件数为样本进行控制菌检验时，有81机率判定为合格品，而抽取30件数时，会有96机率判定为不合格品。,以上表明抽样方法、抽样数量、抽样次数均影响测定结果。以控制菌检验为例，决定染菌检出与否必须具备两个条件：（

18、A）样品是否是含染菌的样品；（B）检验操作正确无误，其中（A）是前提条件。 中国药典2000年版关于抽验方法与抽样数量规定：供试品为随机抽样，一般抽样量为检验用量（两个以上最小包装单位）的3倍量。对异常的供试品应针对性的抽样，对外观可疑污染或对有争议复验的样品应抽取可以污染和有争议复验的原样品。对异常的供试品应针对性的抽样，对外观可疑污染或对有争议复验的样品应抽取可以污染和有争议复验的原样品。 凡能从药品、瓶（外盖内侧及瓶口周围）外观看出发霉、生虫以及变质的药品不必再继续检验，应直接判为不合格。不能以有时外观有上述情况而检验内容为合格，来判定该药品合格，因为瓶口染菌，对服用者是不安全的，如自瓶

19、口直接服药时，所染菌随之进入人体，同时发现瓶口一旦染菌，瓶内药液最终要受到污染。 检验量与抽样量是两种不同范畴的量，后者指从全批产品,（或抽样全过程）抽取的单位包装，前者是指检验用量，一般抽样量大于检验量。检验量只是抽样量各包装的混合样品的一部分。 中国药典2000年版规定检验量为每次最少应分取两瓶（盒）以上的样品共10克或10毫升，中药蜜丸至少应分取4丸以上共10克。 目前我国以1克或1毫升、膜剂以10cm2作为报告单位；英美药典及欧洲药典也是以1克或1毫升作为限量，但控制菌有的是以10克或10毫升作为限量，比我国的限量规定严格。 总之，抽样量和检验量大小对检验结果影响较大（尽管目前抽样方案

20、还存在不科学，漏检率高）。由于药品微生物检验是破坏性检验，检验1瓶（盒）会破坏1瓶（盒），检验量愈大，则破坏性愈大，尤其对贵重药品，生产单位、经营单位损失也就越大。因此，如何确定适宜的既能满足抽样检验基本要求，又能使生产、经营者可接受的抽样方案，是目前需要解决的问题。但目前的规定必须遵循，不能随意变动，尤其不能减少（除对贵重、微量包装的药品可酌情减少检验量除外）。,微生物限度检验方法的发展情况,11980年我国药品微生物限度检验工作正式发行药品卫生检验方法。 21984年出版第二版药品卫生检验方法。 31990.12年中检所出版第三版，主要对原方法中各地反映意见较多的问题进行了改写；增加了部分

21、检验方法和供试液的制备方法；为了同国内外检验方法相协调，对某些内容作了相应的更改，此外，还参照国家标准的编写格式作了编排。 41990年版药典第二增补本收载了微生物限度检查法。这也是我国首次在药典上收载此方法。 51995年版药典也收载了此检查法，少数剂型收载了限度规定。（20个化学药品规定限度）。,6、2000年版药典一、二部同时收载了检查法和限度标准。首次把 微生物限度检查法和限度标准同时发布。,微生物限度标准发展情况,11972年开展此项工作 21978年颁布我国第一个“药品卫生标准” 31986年颁布修改后的“药品卫生标准”，1987年12月1日起供内部执行 41989年下达“药品卫生

22、标准补充规定和说明” 51990年版药典第二增补本收载了20个化学药品种的微生物限度标准规定，与国际惯例一致 61995年版药典少数几个剂型（滴眼剂等）收载了微生物限度。规定按微生物限度检查法检查不得有菌生长 72000年版药典按剂型、中西药分类规定微生物限度，还对几个生化药品在各论中项下作了具体规定,实 验 所 用 的 培 养 基,营养琼脂培养基 玫瑰红钠琼脂培养基 酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基（YPD） 胆盐乳糖培养基（BL） 4甲基伞形酮葡糖苷酸蛋白胨培养基（MUG） 乳糖培养基 5乳糖培养基 蛋白胨水培养基 磷酸盐葡萄糖胨水培养基 枸橼酸盐培养基 曙红亚甲蓝琼脂（EMB） 麦康凯琼脂（

23、MacC） 营养肉汤,微生物限度检查常用检验设备及器材,恒温培养箱 3035 361 霉菌培养箱 2528 恒温水浴箱 451 净化工作台 生物显微镜 1500X 体视显微镜或放大镜 电冰箱 电热干燥箱 250300 高压蒸汽消毒器 电子天平或药物天平 感量0.1g 匀浆仪或研钵 锥形瓶 100ml，250ml，500ml，1000ml,直形吸管 1ml，10ml 量杯 10ml 试管 18x180mm，13x200mm，30x200mm 试管筒 培养皿 9cm 培养皿筒 陶瓦盖 12cm 量筒 100ml，500ml，1000ml 滤器及微孔滤膜 孔径0.450.02um 注射器 1ml，5

24、ml，10ml，30ml 载玻片及盖玻片 接种针及接种环 试管架,乙醇灯 康氏振荡器 离心机 5004000min 紫外灯 365nm 玻璃或搪瓷消毒缸 （带盖） 大、小橡皮乳头 乙醇棉球或碘伏棉球 灭菌剪刀、镊子、钢锥 灭菌称样纸 灭菌不锈钢药匙 火柴、记号笔（玻璃铅笔） 白瓷盘、洗手盆 实验记录纸,细菌、霉菌与酵母菌的检查方法 （平皿菌落计数法）,（一）供试品的抽样、保存及检验量 1 供试品应随机抽样。一般抽样量（2个以上最小包装单位）为检验量的3倍量。 2对异常的供试品应针对性的抽样。抽样时，凡发现有异常或可疑的样品， 应选取有疑问的样品，但机械损伤、明显破裂的包装不得作为样品。 凡能从

25、药品、瓶口（外盖内侧及瓶口周围）、外观看出长螨、发霉、虫蛀及变质的药品，可直接判为不合格，无需在抽样检验。不能以外观有上述情况而检查内容物合格，来判断该药品合格。 3供试品收检后应及时检验，若有困难，应存放在该品种规定的储存条件下（一般为阴凉干燥处），勿冷藏或冷冻，以防供试品内污染菌因保存条件不妥引起致死、损伤或繁殖。,4供试品在检验之前，应保持原包装状态，严禁开启，包装已开启的样品不得作为供试品。 5供试品的取样必须在净化条件下无菌操作，严防再污染。（原料药、装量大的药） 6有剂型检验量均需取自2个以上包装单位（中药蜜丸、膜剂，除需取自2个以上包装外，还应取4丸、片以上样品）。 7固体及半固

26、体（粘稠性供试品）制剂检验量为10克。 8液体制剂检验量为10毫升。 9膜剂除另有规定外，中药膜剂检验量为3050cm2 ，化学膜剂及生化药膜剂检验量为 100cm2 。 10贵重的或微量包装的供试品检验量可以酌减，除另有规定外，口服固体制剂不低于3克，液体制剂采用原液者不得少于6毫升，采用供试液者不得少于3毫升，外用药品不得少于5克 6,（二）实验操作前的准备 1 将供试品及所有已灭菌的平皿、锥形瓶、匀浆杯、试管、研钵、吸管（1ml 10ml）、量筒、稀释剂等移至无菌室内。每次实验所用物品必须事先计划，准备足够用量，避免操作中出入操作间。编号后将全部外包装（牛皮纸、布）取掉。 另外还有增菌液

27、、培养基（营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基，保持在45左右的水浴中）、MUG培养基试管等湿热灭菌的物品 称量纸、手术镊子、剪子等 .干热灭菌的物品 2 开启无菌室紫外杀菌灯和空气净化装置，并使其工作不少于30分钟。 3 操作人员用肥皂洗手，关闭紫外杀菌灯，进入缓冲间，换工作鞋。再用0.1 苯扎溴铵溶液或其他消毒液洗手或用乙醇棉擦手，穿戴无菌衣、帽、口罩。,4 操作前先用乙醇棉球擦手，再用碘伏棉球（也可用乙醇棉球）擦拭供试品瓶、盒、袋等的开口处周围，待干后用灭菌的手术镊或剪将供试品启封。 （三）供试液的制备（1：10供试液） 按供试品的理化特性与生物学特性采取适宜的方法制备供试液。不得改变污染

28、微生物的数量和种类。 1液体供试品 取供试品10ml，加入到稀释剂90ml中，混匀，作为供试,液。（有的书上讲取10 ml，置灭菌锥形瓶中，加入90ml稀释剂，摇匀）。 油剂可加适量聚山梨酯80；,气雾剂、喷雾剂供试品 将供试品置冰室内2hr后 ，取出，用灭菌钢锥小心钻孔，使抛射剂缓慢释放，然后用灭菌注射器加入稀释剂，混匀后吸取相当于10g或10ml供试品，再稀释成1：10供试液。 USPXXIV规定是抛射剂导出后，吸取10ml或取10g供试品，加稀释液使成100ml。 合剂（系指含蜂蜜或王浆者）与滴眼剂可用供试品作为供试液。（滴眼剂不得检出霉菌和酵母菌）。 含蜂蜜、王浆的制剂2固体、半固体或

29、粘稠供试品 称取供试品10g，置装有0.9无菌氯化钠100ml的匀浆杯中，用匀浆仪（30005000r 24min ），或其他适宜方法（振荡器或研钵研磨等方法分散混匀，作为供试液。 在制备过程中，必要时可加适量聚山梨酯80，并适当加温，但不应超过45。,3非水溶性供试品 软膏剂、乳化剂 称取供试品5g(5ml)，加入含已灭菌熔化并保温45左右的司盘80 50g、单硬脂酸甘油酯 3g 、聚山梨酯80 10g混合物的烧杯中，用无菌玻棒搅拌成团后，慢慢加入45左右的0.9无菌氯化钠溶液约80ml ，（实际测可能是85ml），边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为供试液（1：20）。 油剂 取供试品10m

30、l，加入无菌聚山梨酯80 58ml，摇匀，再加入稀释剂至100ml 。 栓剂 称取供试品10g，置灭菌锥形瓶中，加适量稀释剂，置45左右水浴保温10min，使溶，加入无菌聚山梨酯80 58ml，振摇使之乳化，再加稀释剂（稀释剂和聚山梨酯80总量为100ml），摇匀, 茶剂 取供试品10g，置灭菌锥形瓶中，加入稀释剂100ml，振摇30秒，以灭菌纱布过滤（如为袋泡茶，可直接取2袋，以称样结果按1：10加稀释剂，浸泡30分钟）。, 胶丸剂 （如鱼肝油丸等） 同胶囊剂 胶剂 （如阿胶） 取胶剂若干，捣碎，称取10g ，再用研钵研细，转入250ml锥形瓶内，加入稀释剂100ml，置451水浴中，振摇使

31、溶，即为1：10供试液。,胶丸剂 （如鱼肝油丸等） 同胶囊剂 胶剂 （如阿胶） 取胶剂若干，捣碎，称取10g ，再用研钵研细，转入250ml锥形瓶内，加入稀释剂100ml，置451水浴中，振摇使溶，即为1：10供试液。,4含抑菌成分供试品 （仅限检查控制菌时用） 凡含防腐剂或抑菌成分且影响检验（供试品按常规检查法，加入规定量的对照菌，不能检出时）的供试品，可根据供试品的性质，控制菌的特性及检验条件等按以下方法之一或两种以上方法联合应用处理后，依法检查。同时做阳性和阴性对照。 药典规定：供试品如干扰控制菌检验，按以下方法处理后，依法检查。 实际操作中：先把供试液离心（500r/min 5min）

32、这样菌体在上层，吸取上清液过滤，把滤膜直接贴在培养基上培养即可，具体吸取上清液10ml还是100ml按品种要求自己定。取10ml过滤测出来的是个克，取100ml过滤测出来的是个10克。 （限度检查） 稀释法： 将供试品种入较大量的培养基中，使该供试液稀释至不具抑菌作用的浓度（使该供试液稀释至阳性对照菌能生长的浓度）。此法用作控制菌检查和限度检查。 本法适用于抑菌作用不强的中药、化学药品的检验。,离心沉淀集菌法： 取规定量的供试液于无菌刻度离心管中，离心（每分钟3000转）30分钟，弃去上清液，留底部集菌液约2ml，再稀释成原规定的供试液。如有不溶性药渣，可先离心（每分钟500转）5分钟，取全部

33、上层液，再行集菌处理。 本法适用于一些抑菌作用不强的中、西药品，如蜜丸、水丸、片剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂及液体制剂。 应用本法需严防操作污染，并注意上层液或上清液和底部残渣的分离，避免沉渣混入其中。 薄膜过滤法： 取规定量的供试液，置稀释剂100ml中，摇匀，以无菌操作加入装有直径约50mm、孔径不大于0.45um0.02um的微孔滤膜过滤器中，减压抽干后，用稀释剂冲洗滤膜3次，每次50100ml，取出滤膜备检。冲洗时每次最好不少于100ml ，可以将培养基加入滤器或取出滤膜，加入增菌培养基中，可以用加入滤器中供试品的量来控制检验量，也可以把滤膜取出来剪成24片，使每片相当于供试品1g或1ml

34、，放入增菌培养基中，作控制菌检验。,本法适用于水溶性抑菌成分的中、西药品和滴眼剂等制剂的“灭活”处理。安放滤膜时，注意滤膜与滤器应密合，防止滤膜破损、漏液。本法所用滤膜孔径0.45um0.02um。 （钝化）中和法： 凡含磺胺、汞、砷类或防腐剂的供试品，可用相应的试剂钝化活性因子，中和毒性后制成供试液。 磺胺类药物中和法 取规定量含磺胺类的供试品，于100ml增菌液中加入含1对氨基苯甲酸约15ml（以前讲加入0.5ml）。 本法用于含磺胺较少的制剂，如：三黄软膏、消炎眼药水、斑马眼药水等。应用本法可因供试品的不同，对氨基苯甲酸的用量可适当调整。 含砷、汞等重金属药物中和法，取规定量的供试品，加

35、入硫乙醇酸盐培养基100ml中，作增菌培养。,本法适用于含重金属盐类药物的检验，如磺胺嘧啶银软膏等。 含洗必泰等防腐剂的供试品中和法，取规定量的供试品，加入含适量聚山梨酯80等表面活性剂的100ml增菌液中（表面活性剂的用量应预试，用量过大有抑菌作用）。 本法适用于洗必泰含片、洗必泰栓、霉滴栓剂及其它含抑菌成分的供试品。应用本法需注意，由于供试品不同，表面活性剂的用量应预试，用量不宜过大，否则本身易产生抑菌作用。 沉降法： （药典上没收载此法）取规定量的供试液，自然沉降5分钟，取上层液于100ml增菌液中，作增菌培养。本法用于单一成分固体制剂如磺胺嘧啶片。 取规定量的供试液，自然沉降5分钟，吸

36、取上层液于（含1对氨基苯甲酸1ml）100ml增菌液中，作增菌培养。本法适用于复方磺胺制剂，如复方磺胺嘧啶片、复方新诺明片等,以上两法适用于难溶于水的抗菌制剂。如磺胺类药 应用沉降法时，供试品应充分研细，并与稀释剂充分摇匀，使污染菌分散于液相中；沉降时间不宜超过5分钟，以防菌细胞下沉；取上清液时，避免吸入药渣。 （四）对照用阳性菌液 控制菌检查均应作相应已知菌的阳性对照试验。对照菌株为大肠杆菌CMCC(B)44 102、沙门菌CMCC(B)50 094、铜绿假单胞菌、CMCC(B)10104及金黄色葡萄球菌CMCC(B)26 003 制备：取相应菌株的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物1白金耳，接种

37、至营养肉汤培养基内，培养1820小时后，稀释至1：106。对照菌的加入量为50100个。 CMCC医学微生物菌种保藏管理中心。国内药品微生物检验所用的菌种主要是CMCC(B)、CMCC(F)菌号，B(bacteria)代表细菌，F(fungi)代表真菌。中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供这些干燥菌种。,（五）平皿菌落计数法 取均匀供试液，进一步稀释成1：102 1：103等适宜的稀释级。分别取连续三级10倍稀释的供试品液各1ml，置直径约9mm的平皿中，再注入约45的培养基约15ml ，混匀，待凝固后，倒置培养，每稀释级应作23个平皿。 营养琼脂培养基用于细菌计数，玫瑰红钠琼

38、脂培养基用于霉菌计数。在特殊情况下，前者同时点记霉菌、酵母菌菌落数，后者同时点记细菌菌落数。酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基用于酵母菌计数。含蜂蜜、王浆的制剂用玫瑰红钠琼脂培养基与酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基分别测定霉菌、酵母菌菌落数，合并计数。含糖的液体及半固体制剂用玫瑰红钠琼脂培养基同时点计霉菌菌落数及酵母菌菌落数。 （六）菌数测定阴性对照试验 取供试验用的稀释剂各1ml，置4个无菌平皿中，分别按细菌、霉菌计数用的培养基制备平板，培养，检查，不得长菌。 （七）检验程序,细菌、霉菌（酵母菌）检验程序,（八）供试液的稀释（10倍递增稀释法） 取23支灭菌试管，分别加入9ml灭菌稀释剂。另取1支1m

39、l灭菌吸管吸取1：10均匀供试液1ml，加入装有9ml灭菌稀释剂的试管中混匀，即得1：100供试液。依此类推，根据供试品的污染程度，可稀释至1：103、1：104等适宜稀释级（至少共三级）。一般取1：10 1：102 1：103 三级稀释液检验。每递增一个稀释级，必须另换一支吸管。在作10倍递增稀释时，吸管插入第1级稀释液内不低于液面2.5cm，反复吸吹约10次。吸液时，应先吸至高于吸管上部刻度少许，然后提起吸管，贴于试管内壁调整液量至刻度，再沿第2支稀释管的内壁靠近液面（勿接触液面）缓慢地吹出全部供试液（吸管内应无粘附或残留液体），然后将吸管放入消毒液缸内。,（九）注平皿 在进行10倍递增稀

40、释的同时，以该稀释级吸管，吸取各级稀释液各1ml至每个平皿中，每一稀释剂注23个平皿。（此时，一般为左手执平皿，将盖半开，右手执吸管），注平皿时，将1ml供试液慢慢全部注入平皿中，管内无残留液体，防止反流到吸管尖端部。同时做阴性对照（待各级稀释液注皿完成后，用一支1ml吸管吸取稀释剂各1ml，分别注入4个平皿中。其中两个作细菌阴性对照；另2个作霉菌、酵母菌阴性对照，如另用YPD琼脂测定酵母菌数时，再增加2个平皿作酵母菌数阴性对照）。 （十）倾注培养基 将预先配制好的培养基（细菌计数用营养琼脂，霉菌、酵母菌计数一般用玫瑰红钠琼脂，含蜂蜜、王浆液体制剂另加用YPD琼脂）溶化，冷至约45时，,倾注上

41、述各个平皿约15ml，以顺时针或反时针方向快速旋转平皿，使试液与培养基混匀，（注意，混匀时切勿将培养基溅到平皿边及皿盖上），置操作台上待凝。 （十一）培养 细菌计数平板倒置于3035培养箱中培养48h，霉菌、酵母菌计数平板于2528培养箱中培养72h 。 （十二）菌落计数 1细菌培养时间为48小时，分别在24小时及48小时点记菌落数，一般以48小时菌落数为准，霉菌、酵母菌培养时间为72小时，分别在48小时及72小时点记菌落数，一般以72小时菌落数为准。菌落如蔓延生长成片，此平板不宜计数。点计后，计算各稀释级的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。,2一般将平皿置菌落计数器或从平皿的背面直接以肉眼

42、点计，以透射光衬以暗色背景，仔细观察。勿漏计细小的琼脂层内和平皿边缘生长的菌落。注意细菌菌落与霉菌菌落和酵母菌菌落以及它们与供试品颗粒、培养基沉淀物、气泡等的区别。必要时用放大镜或用低倍显微镜直接观察或挑取可疑物涂片镜检。如仍难区别，可延长培养时间47天，细菌菌落常会生长增大而加以区别。 3供试品如为微生物制剂，应将有效微生物菌落排除，不可点记在细菌、霉菌和酵母菌数内。排除的方法须按该制剂微生物品种而定，并须观察菌落特征及染色形态。 4供试品稀释液常含有不溶性原料、辅料，（特别是1：10级别）培养基注皿后亦可能产生沉淀物，经过培养后有时形成数量很多且难与菌落用肉眼相区别的有形物。为了有利于菌落

43、计数，可在操作时将适宜稀释级的供试液多增加注皿,（12个平皿），注皿后不经培养而放置于冰箱（勿结冻）中，在计数菌落时作为对照。或用0.001TTC营养琼脂注皿，经培养后可将细菌菌落与其他有形物区别开来。0.001%TTC肉汤琼脂培养基（0.001%2、3、5氯化三苯四氮唑琼脂），在每1000ml营养琼脂内加入灭菌的1TTC溶液1ml混匀后倾注平皿，防止菌落蔓延。 有些软膏等非水溶性供试品，经营养琼脂注皿后呈乳白色，培养后生长的菌落不易辨认和点计，为防止这种情况，也可用0.001TTC营养琼脂注皿，经培养后生长的菌落为红色，衬以白色背景上易于点计。 5若平板上有2个或2个以上菌落重叠，肉眼可辨别

44、时仍以2个菌落或2 个以上菌落计数；若平板生长有链状菌落，菌落间无明显界限，一条链作为一个菌落计，但若链上出现性状与链状菌落不同的可辨菌落时，仍应分别计数，若生长蔓延较大的片状菌落或花斑样菌落，一般不宜作为计数用。,附表：细菌、霉菌、酵母菌形态特征比较（营养琼脂及玫瑰红钠琼脂平板）,6如同一稀释级2个平板菌落数超过1倍以上，不应计数，菌落蔓延成片不应计数。 7当2个平板菌落数均在15（含15）以下时，按菌落计数的Poisson分布菌数的95%可信限计。二个平板最大差值分别在04，17，29，310，412，514，615，以上各数分别为菌落平均值1、2、3、4、5、6、7的上限及下限，超出以上

45、限度，视为操作误差，不得作为计数依据。 每个稀释级使用3个平板时，平板菌落数均在10个以下的情况。03，15，27，39，410，512，613，714。 8对有疑议的供试品以YPD培养基作酵母菌计数时，可培养至1周再点计菌落数。 （十三）菌数报告规则 1细菌数选取平均菌落数在30300（国外近年有选取25250的趋向）之间的稀释级，霉菌、酵母菌选取平均菌落数在30100之间的稀释级作为报告菌,数计算的依据。 如只有1个稀释级平均菌落数在30300（30100）之间，则将该稀释级的菌落数乘以稀释倍数报告。 2如有2个相邻稀释级平均菌落数在30300（30100）之间时，则按比值计算。当比值2时

46、，则以2个稀释级的均值报告。当比值2时，则以低稀释级的平均菌落数乘以稀释倍数报告。 比值（高稀释级平均菌落数稀释倍数）（低稀释级平均菌落数稀释倍数） 3如有3个稀释级平均菌落数均在30300（30100）之间时，则以后2个稀释级计算级间比值报告。 4如各稀释级平均菌落数均在300（100）以上，则按最高稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告；如各稀释级平均菌落数均在30以下，一般则按最低稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告。,5如各稀释级平均菌落数均不在30300（30100）之间，则以最接近30或300（100）的稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告。 6如各稀释剂的平板均无菌落生长或仅最低稀释级平均菌落

47、数小于1时，则报告菌数为小于10个g或ml。 如供试品原液平板均未生长霉菌及酵母菌，则报告未检出霉菌及酵母菌ml。 7当各稀释级平均菌落数均小于30时，如高稀释级平均菌落数大于或等于低稀释级平均菌落数时，应以培养基稀释法重新测定，按测定结果报告菌数。,培养基稀释法：取低稀释级供试液（原液或1：10供试液）3份，每份各1ml，分别注入5个或5个以上平皿中（每皿0.2ml或0.2ml )，每1个平皿倾注营养琼脂培养基约15ml，混匀，凝固后，倒置培养，计数。 5个或5个以上平板点计的菌落数之和，即为每1ml菌落数，共得3组数据。以3份低稀释级供试液菌落数的平均值乘以稀释倍数报告。,8结果报告 菌落数在100以内时，按实有数报告。 菌落数大于100时，取两位有效数字报告，第三位按数值修约规则处理。 复试 供试品细菌数、霉菌数及酵母菌数其中任一项一次检验不合格，应重新取2倍包装量供试品，依法作单项复试两份，以三次检验结果的平均值报告。,（十四）注意事项 1供试品检验全过程必须符合无菌技术要求。使用灭菌用具时，不能接触可能污染的任何器物，灭菌吸管不得用口吹吸。 2从供试品稀释至倾注琼脂培养基操作应在1小时内完成，避免由于时间过长导致菌细胞繁殖或死亡。 3供试液稀释及注皿应取均匀的供试液，