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1、禽流感的采样及实验室诊断,徐 辉 浙江省畜牧管理局,重要依据,高致病性禽流感 样品采集、保存及运输技术规范 （行业标准，NY/T 7652004 ） 高致病性禽流感 监测技术规范 （行业标准，NY/T 7702004 ） 高致病性禽流感 免疫技术规范 （行业标准，NY/T 7692004 ） 省防治禽流感工作领导小组办公室 ：关于规范高致病性禽流感防治工作有关事项的紧急通知 （密电200410号） 高致病性禽流感 流行病学调查技术规范 （行业标准，NY/T 7712004 ）,禽流感送检样品的采集,采样器械的准备,动物检疫器械箱，保温箱或保温瓶，解剖刀，剪刀，镊子，酒精灯，酒精棉，碘酒棉，注射
2、器及针头。 样品容器（如西林瓶，平皿， 1.5mL 塑料离心管， 10mL 玻璃离心管及易封口样品袋，塑料包装袋等）。 试管架，塑料盒（ 1.5mL 小塑料离心管专用），铝饭盒，瓶塞，无菌棉拭子，胶布，封口膜，封条,冰袋。 采样刀剪等器具和样品容器须经无菌处理。 不干胶标签、签字笔、圆珠笔、记号笔、采样单、记录本等；口罩、一次性手套、乳胶手套、防护服、防护帽、胶靴等。,样品采集基本要求,应从死禽和处于急性发病期的病禽采集样品，样品要具有典型性。采样过程要注意无菌操作，同时避免污染环境。采样人员要加强个人防护。 对病死禽应采集组织样品。取死亡不久的 5 只病死禽采样，病死禽数不足5只时，取发病禽
3、补齐 5 只。每只禽采集肠及肠内容物 1 份；肺和气管样品 1 份；肝、脾、肾、脑等各 1 份并分别采集。上述每个样品取样重量为 15g20g，放于样品袋或平皿中，如果重量不够可取全部脏器（如脾脏）， 不同禽只脏器不能混样，同一禽只不同脏器不应混样。样品采集完后，将样品封口，贴上标签。,样品采集基本要求,对发病禽拭子样品，应取 5 只病禽采样，每只采集泄殖腔拭子和喉气管拭子各 1 个，将样品端剪下分别置于含有抗生素 PBS或生理盐水 的）小塑料离心管中，封好口，贴好标签。 泄殖腔拭子采集方法：将棉拭子插入泄殖腔约 1.52cm,旋转后沾上粪便。 喉气管拭子采集方法：将棉拭子插入口腔至咽的后部直
4、达喉气管，轻轻擦拭并慢慢旋转，沾上气管分泌物。保存喉气管拭子的 PBS 或生理盐水中抗生素浓度。 小珍禽采泄殖腔拭子容易造成伤害，可只采集 5 个新鲜粪便样品（每个样品 1 g2 g ）,禽流感诊断的采样,需按要求同时采血清及病禽组织样品 送样时需附当地动物防疫监督机构的初步诊断意见书（包括畜主姓名、存栏数量、病症始发时间、发病禽种、发病日龄、发病和死亡数量、临床症状、剖检变化、疫苗使用情况、治疗经过等流行病学基本情况）等材料。 样品送检：以上样品采集后密封冷藏保存,送检前对样品外包装消毒后，连同附带材料，一并送省畜牧局实验室检验。 在采样过程中，要务必注意人员的自我防护。,禽流感监测的采样,
5、同时采集肛拭子及血清 送样时需附当地动物防疫监督机构的采样单，内容包括畜主姓名、存栏数量、免疫时间、疫苗种类及生产厂家、禽种及用途、日龄、健康状况等基本资料。,疫点、疫区和受威胁区的监测,封锁扑杀消毒后，对疫区和受威胁区所有养禽场、养猪场采集拭子样品，在野生禽类活动或栖息地采集新鲜粪便或水样，禽类每只采集咽喉和泄殖腔拭子一对，猪采集鼻腔拭子；按每个养殖场采30个（对）拭子，散养动物按每个自然村采集30个（对）拭子，野禽活动或栖息地采集30个样品。对采集的样品进行病原分离或RT-PCR检测。,强制免疫效果监测,鸡群（30只/群）在疫苗接种前、后（免疫后周）分别静脉采血3mL，分离血清，按GB/T
6、 18936血凝抑制试验（HI）检测鸡血清HI的抗体水平。当鸡HI抗体平均水平小于4log2时，判定为免疫效力低下，应当进行疫苗接种；HI抗体水平大于或者等于4log2时，判定为免疫效力良好。,封锁令解除后无病监测,封锁令解除后无病监测,疫区内重新使用的禽舍中饲养高致病性禽流感非免疫禽，或者设立50只岗哨动物，进行临床症状观察和血清学检测，如果禽群有发病或死亡，应采集死禽样品送检分离病原；血清学检测分别在重新饲养非免疫鸡或设立的岗哨动物后0d、30d和5个月时对感染场、危险接触场和可疑场进行，检测数量按照置信水平为95%，检出率低于5%的数量计算。,禽流感样品收样检测程序,实验室检测技术,病毒
7、分离与NASBA的比较,病毒分离与PCR的比较,荧光RTPCR技术,本方法为国家标准。理论上灵敏度较高，但本实验室尚未应用。其基本原理与RT-PCR相似。但结果通过荧光信号来检测，不需要取出扩增样品进行电泳检测，对环境污染少。通过本方法可以对H5、H7、H9亚型进行鉴定。,分子生物学检测方法,特点：简便、快速、灵敏，无需病毒分离，不需要生物安全三级（P3或BSL-3）实验室设施。 缺点：对操作环境比普通实验室要求高，一些试验成本高。 目前国内已批准的方法有： NASBA RT-PCR 荧光RT-PCR,分子生物学实验室基本要求,实验室应装备空调系统，干净密闭，带紫外消毒灯。 每个房间有单独的通风系统 实验室尽可能分区，根据功能划分出核酸提取区、基因扩增区、检测区,台式高速离心机,台式高速离心机,数显恒温水浴锅,移液器,普通、低温冰箱,PCR仪,NABSA核酸检测系统,荧光定量PCR仪,核酸电泳系统,凝胶成像系统,禽流感诊断的结果判定,特别要注意与其它病的鉴别诊断,切实加强禽流感的监测工作 掌握疫情流行病学情况,监测重点部位,种禽场及周围3公里区域 规模化养殖场户 养禽密集区域 野生禽类,监测工作要求,要把监测工作作为常规工作，常抓不懈。 省、市、县三级合理分工，各尽其责。 除禽流感主动监测任务，常规监测经费由同级财政安排。,谢谢各位！,