生物反应工程 第八章 生物反官应工程领域的拓展.ppt

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1、第八章 生物反应工程领域的拓展,主要内容 1、质粒复制与表达的动力学 2、超临界相态下的生物反应 3、菌体形态在发酵过程中的变化 4、界面微生物生长模型 5、双液相生物生长进展,8.1 质粒复制与表达的动力学,8.1.1 dv质粒的概述 8.1.2 动力学模型的几点假设 8.1.3 质粒复制动力学 8.1.4 基因表达动力学,8.2 温和压力提高生物催化效率,一、研究背景 二、变压生物转化 三、加压提高生物应激代谢物的合成 四、几点思考,一、研究背景,生物催化（biocatalysis）是指利用酶或有机体（细胞、细胞器）作为催化剂对底物进行催化反应，该反应过程又被称为生物转化。 压力是除温度、

2、化学组分外，影响化学反应的重要热力学参量。,研究背景（1）,压力生物技术的分类 超高压生物技术（100MPa） 超临界生物反应（10100MPa） 温和压力（Mild pressure)下的生物催化反应变压生物转化（0.11.0MPa）,研究背景（2）,压力影响生物反应的几个方面 反应速率和平衡常数 酶的蛋白结构，影响其底物专一性和催化活性 影响微生物的细胞形态、生理乃至遗传特性的产生,压力对化学反应的影响遵循Le Chatelie法则,如果一个反应的活化体积为300ml/mol，100Mpa压力下反应速率提高了约200,000倍。 胰凝乳蛋白酶,研究背景（3）,研究背景（4）,反应的活化体积

3、一些生物化学,Abe F. et al. (1999),利用压力提高生物催化效率的部分实例,温和压力下的酶促反应合成药物（酯化布洛芬、某些多肽等） 加压生物氧化法处理有机废水（加速BOD降解） 加压原位发酵分离技术（酒精发酵等） 加压发酵提高产品品质（啤酒发酵等）,研究背景（5）,部分压力下的生物催化反应,Miyawaki Osoto (2005),二、变压生物转化,“变压生物转化”是根据微生物本身特性，在生物反应的一定阶段施加温和压力,使细胞代谢通量沿着目的产物方向加强，或酶活力提高的一种生物催化方法,变压生物转化（1） 图1 高压试验装置流程图（1）,变压生物转化（2）,图1 高压试验装置

4、流程图（2）,变压生物转化（3）,图2 微生物 -11位羟基化转化反应,O2,表1 试验设计（小时）,变压生物转化（4）,图3 N2为加压介质对生物转化的影响 , 0; ,1; ,2; ,3; ,4; ,5,变压生物转化（5）,图4 高纯空气为加压介质对生物转化的影响 , 0; ,1; ,2; ,3; ,4; ,5,变压生物转化（6）,图5 高纯空气为加压介质，同时添加氧载体对生物转化的影响 ,0; ,1; ,2; , 3; ,4 , 5,变压生物转化（7）,变压生物转化（8）,图6 压力对蓝色梨头霉菌丝球形态变化的影响 A: 常压下的菌丝球形体 B: 加压后菌丝球形体,A,B,图7 电镜照片

5、 A 氮气 0.5MPa； B 常压,变压生物转化（9）,变压生物转化（10）,B,A,图8 电镜照片 A 高纯空气0.5MPa； B 常压,图9 加压对蓝色梨头霉脱氢酶活力的影响 :脱氢酶活力 ：氢可转化率,变压生物转化（11）,变压生物转化（12）,图10 压力对犁头霉菌丝球通透性的影响 分别为0.1MPa下电导率，A280和A260 ; 分别为空气0.5MPa下电导率， A280和A260,A260 A280,变压生物转化（14）,加压提高甾体药物（氢化可的松）的生物转化（1015%）的原因 提高底物的溶解速率 改善了菌丝团结构 增加生产菌株的细胞膜通透性 提高了脱氢酶活力和强化了相关途

6、径,三、加压提高生物应激代谢物质的合成,氨基酸或核苷酸：鸟嘌呤核苷、谷氨酸、脯氨酸和精氨酸 转化期和产酸期发酵液中充分供氧 罐压的改变提高细胞膜通透性 加强了特定的代谢途径，有利于产物合成，例如较高浓度的氧有利于加强生产菌HMP途径，利于鸟苷的生成。,加压提高生物应激代谢物质的合成（1）,压力作为胁迫因子，可以改变细胞正常生理状态下的代谢通量，刺激细胞发生应激反应，促进应激产物的生成。 海藻糖（1.0 MPa处理3h提高27% ） 谷胱甘肽 (0.5MPa处理3h提高42.6%) 麦角固醇 (0.5MPa处理3h提高20.1%),图11 保压时间对面包酵母胞内海藻糖和存活率的影响 左图: CI

7、CC1339; 右图: CICC1447; , , , 为 0.1 MPa, 1 MPa CO2 和1 MPa N2的细胞存活率 , , ,为 0.1 MPa, 1 MPa CO2 和1 MPa N2的胞内海藻糖含量,A,B,加压提高生物应激代谢物质的合成（2）,图12 保压时间对面包酵母胞内海藻糖合成酶活力的影响 左图: CICC1339; 右图: CICC1447 , 0.1 MPa ； , 1 MPa CO2 ； , 1 MPa N2,加压提高生物应激代谢物质的合成（3）,加压提高生物应激代谢物质的合成（4）,图13 压力对面包酵母细胞膜通透性的影响 左图: CICC1339; 右图:

8、CICC1447 ：电导率； ：A280 ； ：A260,加压提高生物应激代谢物质的合成（5）,图14 面包酵母CICC1339（左）和CICC1447（右） 环境扫描电镜照片（1.0Mpa ）,四、几点体会,1、应用领域 可以有效提高两相生物催化反应效率； 提高微生物应激产物的发酵得率 2、基础理论研究 温和压力对酶活力影响的基础数据； 温和压力对特定微生物细胞形态、代谢途径与通量的变化、基因表达以及活力变化的影响,8.3 发状念珠藻单体细胞培养 -与其在治理荒漠化中的作用?,一、发状念珠藻概述 二、悬浮培养条件下发状念珠藻形态及生长过程 三、开放式悬浮培养 四、发状念珠藻培养物成分分析及功

9、能试验 五、发状念珠藻细胞固态培养的初步研究 六、发状念珠藻细胞野外放大试验 七、不同营养模式下发状念珠藻细胞生长的比较 八、小结,一、发状念珠藻概述,荒漠-半荒漠地区陆生蓝细菌,荒漠草原唯一优势生长的固氮生物,生长于极端环境中的特种生物资源,发状念珠藻资源现状,分布具有很强的地域局限性 生长极为缓慢，生物量加倍时间需10多年,我国发菜主产地之一宁夏回族自治区60年代发菜生长地面积约 万公顷，至80年代中期减少到 万公顷，到90年代未已减至不足 万公顷，与此同时，商品发菜的价格从70年代的每公斤 元上涨到90年代的每公斤 元，至2000年时更高达上千元一公斤。 我国内蒙古自治区因采收发菜而遭破

10、坏的草场面积 万公顷，其中 万公顷完全退化为荒漠。,360.7,173.3,100,10,500,1266.67,400,原材料： 念珠藻（）（岩出101株）葉実末末 特許番号2989533 90包入 ￥54,000（税別）,抗疲劳 抗病毒 抗肿瘤,图片资料来源于日本MAC网站 www.mac-bio.co.jp,发状念珠藻药用价值,解决方案,二、悬浮培养条件下发状念珠藻形态及生长过程,A: 藻殖段 B: 营养细胞 （横分裂） C: 营养细胞（纵分裂） D: 异形胞 E: 细胞团 F: 厚壁孢子 G: 繁殖体,液体培养条件下单体发状念珠藻细胞类型及形态（标尺=10 m）,发状念珠藻细胞聚合体的

11、形成,液体培养发状念珠藻细胞聚合体,光照对细胞生长和多糖积累的影响,不同光照强度(molm-2s-1)下发状念珠藻细胞生长曲线,不同光照强度下发状念珠藻细胞胞外多糖产量,温度对细胞生长和多糖积累的影响,不同温度下发状念珠藻细胞生长曲线,不同温度培养20 d发状念珠藻细胞胞外多糖产量,初始pH值对细胞生长和多糖积累的影响,不同初始pH值下发状念珠藻细胞生长曲线,初始pH值对发状念珠藻细胞胞外多糖产量的影响,氮源对细胞生长和胞外多糖产量的影响,不同氮源下发状念珠藻细胞生长曲线,不同初始硝酸钠浓度下发状念珠藻细胞生长曲线,不同初始硝酸钠浓度下培养20 d发状念珠藻细胞胞外多糖产量,磷酸盐对细胞生长和

12、多糖积累的影响,不同初始磷酸盐浓度下发状念珠藻细胞生长曲线,初始磷酸盐浓度对发状念珠藻细胞 胞外多糖产量的影响,光反应器中发状念珠藻细胞培养过程特性,发状念珠藻细胞20L光反应器中培养过程曲线,通气量对藻细胞生长和多糖积累的影响,不同通气量下发状念珠藻细胞生长曲线,通气量对发状念珠藻细胞胞外多糖生成的影响,搅拌桨叶尖速率对细胞生长和多糖积累的影响,不同叶尖速率下发状念珠藻细胞生长曲线,不同叶尖速率下发状念珠藻细胞生长速率 及培养16 d细胞干重,A: 0.3 ms-1 B, C: 0.5 ms-1 D: 0.8 ms-1, 1.0 ms-1 E: 1.5 ms-1,不同搅拌桨叶尖速率下培养16

13、 d发状念珠藻细胞形态,不同叶尖速率下培养16 d发状念珠藻 细胞多糖产量,光照周期对于发菜细胞开放式悬浮培养的影响,三、开放式悬浮培养,通气量对于发菜细胞开放式悬浮培养的影响,初始液位对于发菜细胞开放式悬浮培养的影响,四、发状念珠藻培养物成分分析及功能试验,发状念珠藻多糖离子交换层析洗脱曲线,发状念珠藻多糖凝胶层析洗脱曲线,发状念珠藻细胞培养物和天然发状念珠藻HPLC图,发状念珠藻细胞与天然发状念珠藻氨基酸含量/mgg-1,发状念珠藻细胞培养物抗HSV-I试验,A：样品在病毒侵染1h后加入；B：样品在病毒侵染同时加入,发状念珠藻细胞培养以游离的藻丝或细胞群体的状态存在，不形成具有完整结构的发

14、状念珠藻体，其如果能在接近自然生长的固态培养条件下进行生长，将对于了解细胞生长过程中的形态变化以及与液体培养的差异，实现从发状念珠藻细胞到发状念珠藻体的生长过程，有重要意义。 在荒漠化地区进行发状念珠藻细胞培养，不仅是低成本获取发状念珠藻生物量的一种手段，也将对该地区的生态环境具有一定的改善作用。培养过程中一些人工管理手段的实施及发状念珠藻细胞的生长活动，都将促使其生长地的生态环境向良性化方向演替。,五、发状念珠藻细胞固态培养的初步研究,干燥发状念珠藻细胞复水不同时间后光合和呼吸作用,发状念珠藻细胞耐热性,A, B: 对照; C, D: 50处理,干燥发状念珠藻细胞不同温度处理2 h复水后荧光

15、染色结果,干燥发状念珠藻细胞不同温度处理2 h复水后荧光染色结果,E, F: 60处理; G, H: 70处理,干燥发状念珠藻细胞不同温度处理2 h复水后光合和呼吸速率,利用计算机视觉技术，将沙粒上发状念珠藻藻落的形态图片转化为二值图以计算藻落面积。,沙粒上发状念珠藻细胞的生长曲线,沙粒颗粒大小对发状念珠藻细胞生长的影响,图a、b、c中的培养皿上的沙粒大小分别为0.95mm,固态与液态培养发状念珠藻细胞干燥后复水呼吸作用与光合作用恢复比较,固态与液态培养发状念珠藻细胞的耐热性比较,发状念珠藻细胞及培养液对于沙粒渗水性及持水性的影响,渗水性,持水性,五、发状念珠藻细胞野外扩大培养,时间：2005

16、年6月20日至2005年11月30日 地点：宁夏银川市贺兰山东麓,七、不同营养模式对发状念珠藻细胞生长的影响,发状念珠藻细胞的光合自养、混合营养的生长曲线,细胞的形态和大小,A光合自养培养48h的发菜细胞 B混养培养48h的发菜细胞 C光合自养培养120h的发菜细胞 D混养培养120h的发菜细胞,A,B,C,D,室温吸收光谱,营养模式对发状念珠藻细胞生长与累积多糖的影响,25 45molm-2s-1 培养7d,多糖 细胞,培养基对发状念珠藻细胞生成胞外多糖的影响,（mg/L）,八、小结,1、可以进行单体发状念珠藻细胞的悬浮培养，悬浮培养获得的发状念珠藻胞外多糖与天然发状念珠藻水提多糖具有相似生

17、理活性；并与野生发状念珠藻和多糖具有相同的抗病毒活性。 2、发状念珠藻细胞可以在开放式（深层或固态）环境下单种培养。 3、发状念珠藻细胞可以在沙粒基质上生长形成细胞肉眼可见的细胞群落，并在沙粒基质上形成厚度约1 mm的结皮。在半荒漠草原生态条件下，单体发状念珠藻细胞可以存活并生长，在5个月的培养周期中，发状念珠藻细胞生物量增加约34倍。 4、比较了不同生长模式，混养培养可有效提高发状念珠藻细胞及其多糖产量。,8.4 界面微生物生长模型,8.4.1 界面的概念 8.4.2 界面与微生物 8.4.3 界面上丝状真菌的生长 8.4.4 界面微生物生长动力学模型,细菌纤维素的生物合成及其应用,网址 h

18、ttp:/ http:/,一、基本概念 二、细菌纤维素的性质 三、细菌纤维素的生物合成机制 四、细菌纤维素发酵 五、细菌纤维素的应用 六、有待研究的问题,细菌合成纤维素是在1886年由Brown首次报道。他发现木醋杆菌（Acetobacter xylinum）在静止培养时于培养基表面形成一层白色纤维状物质，经化学与物理方法分析确定此类物质具有纤维素的结构与化学性质，因其属细菌合成而命名为细菌纤维素。,一、基本概念,细菌纤维素与东方传统发酵食品,Bacterial cellulose,在不同条件下，常见以下九个属中的某些种的微生物合成纤维素，统称为细菌纤维素。 醋酸菌属（Acetobacter）

19、，典型的种有：Acetobacter xylinum木醋杆菌，Gluconobacter oxydans氧化葡糖杆菌 土壤杆菌属（Agrobacterium） 假单胞杆菌属（Pseudomonas） 无色杆菌属（Achrombacter） 产碱杆菌属（Alcaligcncs） 气杆菌属（Aerobacter） 固氮菌属（Azotobacter） 根瘤菌属（Rhizobium） 八叠球菌属（Sarcina）,细菌纤维素生产菌的特点,二、细菌纤维素的性质,细菌纤维素和植物或海藻产生的纤维素在化学性质上是相同的。但细菌纤维素有许多独特的性质，如：,1、高结晶度、高化学纯度； 2、高抗张强度和弹性模量

20、； 3、很强的水结合性； 4、极佳的形状维持能力； 5、较高的生物适应性。,细菌纤维素膜的形态,静态培养法：在发酵液表面形成乳白色半透明液膜。 动态培养法： （1）机械搅拌罐通风培养：细菌纤维素呈丝状、微团状或星状； （2）气升式生化反应器培养：细菌纤维素呈微小椭圆状。,细菌纤维素的网状结构,纤维素分子链间通过氢键交联形成的网状 细菌纤维素微纤维或细纤维交织成特殊的空间网状结构,细菌纤维素与其他纤维素的红外光谱,1、细菌纤维素； 2、棉纤维； 3、桑皮纤维； 4、羧基纤维素,X-射线衍射结果,细菌纤维素的固体CP/MAS 13C NMR谱,X-射线衍射和CP/MAS 13C NMR 互补研究大

21、分子聚合物的微观结构,细菌纤维素干膜的渗透性能,非极性气体O2难于透过干膜，而极性的水蒸气易于透过干膜。细菌纤维素干膜结构致密，有大量的极性基团。,细菌纤维素膜的持水性,三、细菌纤维素的生物合成机制 （A. Xylinum 细菌纤维素的生物合成）,葡萄糖的胞内聚合 分泌 组装 结晶化,这四个过程高度耦合，并和细胞膜上的特定位点密切相关,木醋杆菌的糖类代谢途径,细菌纤维素合成的关键调控因子,C-Di-GMP（cyclic di-GMP，环状二鸟苷酸）纤维素合成酶的变构效应物,细菌纤维素合成的代谢调控,细菌纤维素合成酶,细菌纤维素合成酶,细菌纤维素合成酶,细菌纤维素的分泌、组装和结晶化,纤维素分子

22、链原细纤维微纤维细纤维,微纤维分叉形成的可能机制,四、细菌纤维素发酵,网状结构的纤维素丝束和菌体,菌体表面特征性皱纹沿菌体纵轴多股微纤丝汇集成一根纤维素丝束,细菌纤维素流加发酵培养实验装置,细菌纤维素的静态发酵,分批补料发酵与分批发酵的比较,转子流量计 2.空气过滤器 3.膜过滤器 4.支架 5.恒温水浴 6.空气分布器 7.水夹套 8.升气筒,气升罐发酵生产细菌纤维素,细菌纤维素扫描照片 I 静态培养 II气升罐培养 The SEM photo of bacterial cellulose I Static culture II ALR culture,静态（左）和气升罐（右）发酵生产的细菌

23、纤维素微观结构比较,I II,不同形式发酵的结果,细菌纤维素生物合成的代谢流分析,代谢工程力图从细胞代谢网络的整个系统着手来研究代谢状况。其要解决的主要问题是改变某些途径中的碳架物质流量或者改变碳架物质流在不同途径中的流量分布。其目标是修饰初级代谢，将碳架物质流导入目的产物的载流途径以获得产物的最大转化率。因此建立完整的细胞代谢“球形”网络，有助于从整体上研究菌体的发酵过程。,基于物流平衡的MFA及其理论基础,基于物流平衡的MFA，不需要复杂的设备，相对比较简单，根据代谢路径中各生化反应的计量关系，通过测定细胞外代谢物及菌体组成来计算整个代谢网络的代谢流分布。该方法的基础是拟稳态假设：假设细胞

24、内的中间代谢物均处于拟稳态，即其浓度变化速率为0。 本文采用Joseph J.Vallino的方法5，根据物流平衡计算代谢物的积累速率，有：,Acetobacter xylinum M12合成细菌纤维素的代谢网络的构建,为了降低代谢网络的复杂性和减少代谢流量平衡方程，构建Acetabacter xylinum代谢网络时作了以下假设和简化： （1） HMP途径和TCA循环中的异柠檬酸脱氢酶反应是产生NADPH的主要途径。产生的NADPH主要用于生物合成，而没有进入线粒体氧化； （2） 为减少代谢网络中的反应数目，将直线性反应（无代谢分支的反应）归为一个代谢库（Metabolic pool），例如

25、：反应T3P PGP 3PG PEP，可简化为T3P PEP，这样几个反应就简化为一个反应，从而减少了模型的复杂程度； （3） 对于相互转化的两种物质A和B（没有第三种物质参与）模型中用一种物质C表示，例如DHAP和G3P用T3P表示。 由于6磷酸果糖激酶（PFK）缺乏或PFK的活性很低，在构建代谢网络时忽略了F6P T3P的反应。,确定计量系数时遵循以下原则： （1）“反应为负，生成为正”的原则。以5-磷酸核糖为例（见图51），反应方程中5-磷酸核糖若作为反应物，则其系数为负；若5-磷酸核糖作为生成物，则其系数为正；若无5-磷酸核糖则其系数为零。 （2）“1 C-mol为基准”的原则。含碳化

26、合物计量系数的代数值是以1 C-mol通量为基准确定的。例如在r8中，虽然1mol F6P生成2mol T3P，但碳通量未变，因此在该反应中F6P的系数为1，T3P的系数则为1。,采用MFA计算代谢通量，必须对系统作拟稳态假设，即假设胞内中间代谢产物均处于拟稳态，考虑到中间代谢物的过渡态相对于菌体生长速率和宏观操作条件的变化更为迅速，相对于菌体生长和发酵过程的过渡态而言，胞内中间物质的量相对不变，其累积速率为零。即 Ar=0 5-5 可以看出，矩阵中未知数为28，方程数为24，方程自由度为4，即需测定4个速率方程可确定代谢网络中的流量分布。在发酵过程中，底物和产物这些与环境有交换的物质，它们的

27、消耗或积累速率可以通过胞外在线或离线方法测量得到，将其对时间微分即可求得各物质的代谢速率。将该速率作为已知参量，代入上述代谢流平衡模型即可求得代谢流分布。,细菌纤维素生物合成的代谢流分布,代 谢 流 分 析,第一阶段，发酵前期（04天）菌体和细菌纤维素的大量合成时期，菌体的代谢流r28为15.60，生成细菌纤维素的代谢流r20为18.30，菌体生长需要大量核酸、蛋白质、脂肪、一些小分子中间代谢物、还原力NADPH和主要由TCA循环提供的NADH及FADH2，此时的细菌纤维素的生物合成的速度也较快。表明细菌纤维素的生物合成与菌体的生长密切相关，但菌体的生长也是以消耗葡萄糖为前提的。因此，提高细菌

28、纤维素产率的同时必须考虑菌株的生长。此结论与Atsushi Ishikawa6的研究报道相同。如何控制r2和r20的比值，即既能满足菌体大量生长所需要的能量、还原力、核酸、蛋白质、脂肪和一些小分子中间代谢物，又能有较多的G6P 流向细菌纤维素的合成是今后要探讨的重要问题。,第二阶段，发酵后期（48天）菌体生长减慢，同时细菌纤维素的合成速度也减慢。菌体的代谢流r28为1.90，生成细菌纤维素的代谢流r20为7.50。此时已发生代谢流迁移现象即代谢流重新分配，碳架被逐渐导向一些副产物的合成，例如AC的代谢流r11前期是0.73，后期是7.50。因此如能从遗传角度和发酵控制方面使副产物的生成减少，就

29、能达到代谢流迁移的目的，从而增大合成细菌纤维素的代谢流。HMP循环r2(208.09)也大于发酵前期代谢流分配（183.55），有关TCA循环的代谢流r13r18都大于发酵前期的代谢流，这样通过HMP循环和TCA循环产生的能量可能有大量的无效循环，具体的能量产生途径通量分布有待进一步研究和探讨。,BC发酵前期G6P节点流量分析,诱人的商业潜力,细菌纤维素已商品化，或已获取利，或始广泛使用的领域，包括：,音响振动材料，SONY (JAN), AJINOMOTO(JAN), US5274199 生物肠衣和临时皮肤替代物，Weyerhaeuser (US), Cetus Corp (US),商品名C

30、ellulon 纺织品的强化纤维 Dupont 高级功能纸张的添加剂 JP8049188A2 食品工业，如：低卡路里的膨胀剂和稳定剂，新型发酵饮料专利申请号99109800.5,五、细菌纤维素的应用,在造纸工业中的应用,随着对细菌纤维素的深入研究，细菌纤维素在特种纸或功能纸中应用成为研究热点。从已开展的应用工作来看，不必采用特殊的添加方法，就可开发出简单的细菌纤维素添料纸。,造纸实验,纸张强度性能测定 定量 抗张强度，裂断长 撕裂度 耐破度 透气度,苇浆配加细菌纤维素，抄纸,苇浆配加细菌纤维素，抄纸,苇浆配加细菌纤维素对纸张强度的影响,苇木混合浆(9:1)配加细菌纤维素，抄纸,苇木混合浆(9:

31、1)配加细菌纤维素对强度的影响,苇浆中分别配加(10%)木浆和细菌纤维对纸张强度的影响,细菌纤维对苇浆纸张强度的影响,苇浆纸张强度随着细菌纤维配加量的增加而显著增大，透气度明显下降。这可能是因为： 1) 细菌纤维素的微纤维交织成特殊的网状结构，有较大表面积，增加氢键作用位点，增大纤维间的结合力； 2) 细菌纤维本身有较大的强度。,纤维内与纤维间的氢键,纸张强度首先取决于纤维相互间的结合力和纤维本身的强度。细菌纤维素的微纤维交织成特殊的网状结构，有较大表面积，增加氢键作用位点，增大纤维间的结合力，提高纸张的抗张强度。,在医学材料中的应用,改良细菌纤维素物理化学性质、机械性能和生物医学的测试结果表

32、明它具有一些良好的独特性质，如生物活性（bioactivity）、生物可降解性、生物适应性和无过敏反应，尤其是良好的机械韧性，有可能作为新型的生物医学材料。,大鼠伤后不同时间伤口愈合率,细菌纤维素对大鼠皮肤创伤促愈作用的实验研究,细菌纤维素膜对深度烧伤大鼠皮肤治疗作用的实验研究，发现其对深度烧伤促进愈合作用不显著，与文献报道不符，分析其原因，可能是所用烧伤动物模型更适于暴露疗法，创面局部有焦痂组织阻碍细菌纤维素与创面直接接触，影响发挥作用有关。为此，本实验拟采用缺损性皮肤创伤的动物模型做进一步的探讨。,大鼠伤后不同时间伤口愈合率,皮下埋植细菌纤维素膜的实验研究,以上实验表明细菌纤维素膜能促进皮

33、肤损伤的愈合，具有一定的治疗作用，有可能成为一种临时皮肤代用品和有应用潜力的生物敷料。随着组织工程学的逐渐兴起，有必要探讨细菌纤维素膜作为皮肤组织工程材料人工真皮的可能性。,小结,细菌纤维素膜在一定程度上具有促进烧伤伤口愈合的作用，组织学观察治疗组与对照组病理损害和愈合程度，在各观察时点均无明显差异，炎症反应与创面感染情况也没有差异。 组织学切片显示，细菌纤维素膜可允许成纤维细胞和毛细血管逐渐长入。说明细菌纤维素膜对皮肤创伤性损伤具有一定的治疗作用。 细菌纤维素膜异物反应差，有利于血管和细胞的长入，有可能成为皮肤组织工程的材料,在食品工业中的应用,细菌纤维素具有很强的亲水性、持水性、凝胶特性、

34、稳定性及完全不被人体消化的特点，使之成为一种很具吸引力的食品基料，可作为增稠剂应用于食品工业中，也可作为固体食品的成型剂、分散剂和结合剂等。 红茶菌是以茶叶浸出液通过发酵制成的一种保健饮料。在培养红茶菌的过程中，在汁液的表面形成一层胶状液膜，其主要成分是细菌纤维素。 纳塔是一种由微生物经液态发酵形成于液体表面的凝胶膜状物，主要成分是纤维素。,在高级音响设备振动膜上的应用,细菌纤维素高纯度（100%）、高结晶度、高聚合度和优良的分子取向，高机械强度、经热压处理后，杨氏模数可达30Gpa，比有机合成纤维的强度高4倍，可满足当今顶级音响设备声音振动膜材料所需的对声音振动传递快和内耗高的特性要求。 细

35、菌纤维素振动膜的优异特性主要是其极细的高纯度纤维素组成的超密结构，经热压处理制成了具有层状结构的膜，使其杨氏模量和机械强度大幅度提高。,六、有待研究的问题,1、基因改造与表型或产物分泌状态的研究以及基因水平分子动力学研究： （1）通过基因改造，分析基因与表型或产物分泌状态之关系， （2）通过基因与代谢调控研究，建立细菌纤维素生物合成模型。,2、细胞水平的代谢调节特性的研究： （1）采用恒化器培养技术，研究以生化反应器优化操作为目标的，以生成不同的纤维素产物形式的微生物的生理生化特性，建立不同基质和条件的发酵动力学模型，研究微生物生长与产物表达条件的匹配关系。 （2）以恒化器培养方法和图像技术，

36、研究不同基质和操作条件与菌体形态与产物表达形态变化之关系。 （3）以代谢分布，产物分泌特征为主要内容的代谢特性研究，探索纤维素合成过程中空间特征与代谢之关系。,3、以细胞代谢分析与控制的生物反应器多水平参数的关联与优化技术研究： （1）静态与动态发酵过程及其产物性能比较； （2）宏观参数与微观参数的关联模型。,8.5 双液相生物反应进展,8.5.1 双液相酶促反应的进展 8.5.2 双液相发酵的进展,一 实验目的 二 实验原理 三 实验装置与流程 四 实验步骤及方法,8.5 神经网络技术在发酵过程中的应用,一 实验目的,学习神经网络的基本原理，学会MATLAB神经网络应用设计，掌握神经网络技术

37、在发酵过程建模中的应用。,二 实验原理,与经典的非结构动力学模型相比 （1）神经网络的基本原理 （2）MATLAB神经网络应用设计 （3）建模过程中的几个关键问题,图3.1-5 主监控界面,研究内容之三,33 聚赖氨酸发酵过程的建模与优化,3.3.1 聚赖氨酸发酵过程的建模方法 3.3.2 基于三底物限制的聚赖氨酸发酵过 程解析式软测量模型 3.3.3 聚赖氨酸发酵过程的神经网络模型 3.3.4 聚赖氨酸发酵过程操作变量的优化 控制 3.3.5 小结,引论,研究5升发酵罐聚赖氨酸分批发酵过程建模和优化控制问题。建立了受基质糖浓度、浓氧浓度DO、pH三底物限制的解析式软测量模型，以及基于神经网络

38、的软测量模型和预估模型，讨论了根据DO及其变化量以及生物参数的估计实时控制pH设定值的优化控制策略。,聚赖氨酸发酵过程的建模与优化,3.3.1 聚赖氨酸发酵过程的建模方法, 建模的目的 解析式软测量模型建模方法 BP神经网络模型建模方法,聚赖氨酸发酵过程的建模与优化,建模的目的,聚赖氨酸发酵过程建模的目的：一是为了深入了解聚赖氨酸发酵机理，实现操作变量的实时优化控制，提高聚赖氨酸发酵水平；二是为了实现发酵状态预估，提高实验的成功率。 数据来源5升发酵罐9批聚赖氨酸分批发酵实验数据，其中6批用于模型训练，3批用于模型验证。采用不同的方法建了两类模型即解析式软测量模型和神经网络模型，其中神经网络模

39、型有3种即软测量、预估和混合预估模型。,聚赖氨酸发酵过程的建模与优化,解析式软测量模型建模方法,解析式软测量模型通过多元非线性回归分析方法，以实验现象、实验数据、发酵机理为基础，采用了三底物限制的Monod方程结构，建立了由在线可测参数DO、pH、搅拌速率以及初始糖浓度对残糖、菌体和产物浓度进行估计并受基质糖浓度DO、pH三底物限制的解析式方程。,聚赖氨酸发酵过程的建模与优化,BP神经网络模型建模方法,人工神经网络(简称BP神经网络)模型是通过一组网络权值w和阀值b矩阵来描述输入与输出的关系。网络的计算输出为残糖、菌体和产物浓度K时刻的估计值，网络的输入是在线可测参数或K-1时刻的化验参数，根

40、据输入是否包含化验参数分为神经网络软测量模型和预估模型。,聚赖氨酸发酵过程的建模与优化,图33-1 BP神经网络结构图,BP神经网络模型建模优点,一是模型容量大，在合理的选择隐层神经元个数前提下，参与训练的样本数可以到几十个批次甚至几百个批次的发酵数据；二是无需发酵机理知识，只要模型所含各种发酵条件下的样本数足够多，就能够达到较满意的验证效果。,聚赖氨酸发酵过程的建模与优化,BP神经网络模型建模缺点,发酵过程是一个时序过程有很强的滞后，K时刻的发酵状态不仅取决于K时刻的发酵条件，而且与K时刻之前的发酵条件有关，相比之下解析式模型较容易描述一个时序过程，而神经网络模型却难以描述。,聚赖氨酸发酵过

41、程的建模与优化,混合神经网络模型建模,神经网络混合预估模型的输入不仅含有在线可测参数和K-1时刻的离线化验数据，而且运用了被解析式模型验证了的简单的且具有一般性的机理知识。比如DO的消耗量（100-DO）对时间的积分值是解析式软测量模型估计残糖浓度的重要多项式，可以把它作为一个输入数据用于神经网络混合预估模型。当训练样本数较少时可采用混合预估模型。,聚赖氨酸发酵过程的建模与优化,3.3.2 基于三底物限制的聚赖氨酸 发酵过程解析式软测量模型,发酵条件和实验数据 基于基质糖浓度DO、pH三底物限制的 聚赖氨酸分批发酵解析式软测量模型 结果讨论,聚赖氨酸发酵过程的建模与优化,发酵条件和实验数据,发

42、酵条件的相同部分是：5升罐装液量2500ml，通风量10VVM，温度30度，不流加。各批发酵整个发酵过程通风量和搅拌速率保持不变。 在线测量数据有pH、DO，离线化验数据有残糖浓度S、菌体浓度X、产物浓度P，估计值包括残糖浓度估计值Sg、菌体浓度估计值Xg、产物浓度估计值Pg。发酵时间单位为小时。,聚赖氨酸发酵过程的建模与优化,基于基质糖浓度DO、pH三底物限制的 聚赖氨酸分批发酵解析式软测量模型,残糖浓度估计软测量模型：,基于基质糖浓度DO、pH三底物限制的 聚赖氨酸分批发酵解析式软测量模型,菌体浓度估计软测量模型：,基于基质糖浓度DO、pH三底物限制的 聚赖氨酸分批发酵解析式软测量模型,产

43、物浓度估计软测量模型：,3.3.3 聚赖氨酸发酵过程的神经网络模型, 发酵条件和样本数据 聚赖氨酸发酵过程的BP神经网 络软测量模型 聚赖氨酸发酵过程的BP神经网 络预估模型 聚赖氨酸发酵过程的BP神经网 络混合预估模型,聚赖氨酸发酵过程的建模与优化,发酵条件和实验数据,聚赖氨酸分批发酵条件的相同部分是：5升罐装液量2500ml，通风量10VVM，温度30度，不流加。各批发酵搅拌速率和pH控制方式不同，每批发酵整个发酵过程通风量和搅拌速率保持不变。在线测量数据有pH、DO，离线化验数据有残糖浓度S、菌体浓度X、产物浓度P。,聚赖氨酸发酵过程的建模与优化,聚赖氨酸发酵过程的 BP神经网络软测量模

44、型,输入层、隐层、输出层节点数：7，12，1；学习次数：120万次；学习速率=0.1。 模型输入：u=t；pH；DO；pH_1；DO_1；DO_2；VVT 模型输出：残糖模型输出为K时刻的残糖估计值，菌体模型输出为K时刻的菌体估计值，产物模型输出为K时刻的产物估计值。,聚赖氨酸发酵过程的建模与优化,软测量模型训练结果,图33-6聚发酵（1）200rpm、pH不控制，S、X估计值与化验值的比较,图33-7聚发酵（5）350rpm、pH=3.0，S、P估计值与化验值的比较,图33-8聚发酵（7）350rpm、pH=5.0，S、P估计值与化验值的比较,训练误差以平均绝对误差表示，残糖模型训练误差：0

45、.0894；菌体模型训练误差：0.1308；产物模型训练误差：0.0292 。,软测量模型验证结果,图33-10验证样本聚发酵（9）350rpm、pH=4.3，S、X估计与化验值的比较,图33-9验证样本聚发酵（3）400rpm、pH不控制，S、P估计与化验值的比较,聚赖氨酸发酵过程的建模与优化,聚赖氨酸发酵过程的 BP神经网络预估模型,输入层、隐层、输出层节点数：7，9，1；学习次数：40万次；学习速率=0.1。 模型输入：u=t；X；S；PT，分别为K时刻的发酵时间/h、菌体/g/L、残糖/%、产物浓度/g/L的离线化验值。 模型输出：残糖模型输出为K+1时刻的残糖预估值，菌体模型输出为K

46、+1时刻的菌体预估值，产物模型输出为K+1时刻的产物预估值。,聚赖氨酸发酵过程的建模与优化,产物预估模型网络权值w和阀值b矩阵：,w1 = 15.4301 -9.7348 -9.6851 -6.8395; -12.1319 11.1584 -3.3187 20.0512; 2.1560 3.0867 6.3794 -27.6267; -1.0105 3.6712 14.4534 -22.3611; 14.5118 8.7028 -2.9942 -18.2467; 8.6660 10.1926 12.3773 -14.1977; -1.2103 8.9406 -18.1527 6.9004; b

47、1 = 3.8587 -6.0954 -0.7781 -0.0070 -2.7965 -3.6567 1.5770T w2 = -0.7566 4.1824 0.0120 2.5747 -2.2131 2.7714 2.9456; 3.1757 0.0784 -3.3546 1.1457 3.0772 4.0187 -3.2244; 0.4585 2.7346 2.3336 4.5853 1.1529 1.4877 -4.7418; -3.1666 -1.1154 -0.0928 2.9087 -1.9195 4.6168 4.4771; 2.6088 -2.1618 4.6633 -2.60

48、38 1.5733 -2.8485 -2.4579; 4.4859 -2.8101 1.5424 -2.5814 0.9674 4.0893 -1.1927; -5.4354 -2.9595 2.4507 -1.9734 -1.3888 -2.5803 2.1266; 3.0442 3.0284 -0.0244 0.6104 3.2412 -4.1049 -3.6341; -0.7520 -2.2401 4.8133 2.3164 1.8014 4.8946 0.1972; ,产物预估模型网络 权值w和阀值b矩阵：,b2 = -9.8405 1.0416 -0.1276 -1.9416 2.5993 -3.9141 5.6993 -3.1275