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1、共焦显微拉曼光谱的原理与应用,姓名：徐超 学号：6121203013,内容简介,一、Raman 散射及 Raman光谱学简介 二、共聚焦技术（confocal） 三、共聚焦拉曼光谱的应用,一、 Raman 散射及 Raman光谱学简介,光散射,光散射：当光（电磁）波射入介质时，若介质中存在某些不均匀性（如：电场、相位、粒子数密度、声速等）使光（电磁）波的传播发生变化。 例如，当一束光通过均匀、透明介质（如玻璃）时，人的肉眼从侧面看不到光的传播路径，而如果介质不均匀（如胶体），我们便可以在介质中清晰看到光的路迹。这种现象便是光的散射引起的：在玻璃这种均匀透明介质中，光基本都被反射或折射通过样品，
2、散射非常弱，而在不均匀介质中，一定数量的光子被散射向四面八方被人眼感知。,散射的分类,散射可以分为弹性散射和非弹性散射。 弹性散射中散射的光子能量和入射光子能量一致，而非弹性散射则是其能量发生了变化。 散射光波长相对入射光波长的改变量的大小对应于不同的散射机制。 光散射能量以波数（cm-1）为单位 凡波数变化 0.1 cm-1散射称为拉曼散射。,光散射的能量变化及其分类,光与物质作用时，初态的的光子被吸收，使系统（如电子和晶格振动）从初态跃迁到一个中间虚态，然后辐射出散射光子；同时中间虚态回到终态。如初终、态相同，就是弹性散射过程，否则，为非弹性散射过程。 光散射过程中能量与动量间有密切关联。
3、,Rayleigh散射& Raman 散射,当光子被物质中的原子或者分子散射时 绝大多数光子的能量保持不变，即发生弹性散射（比如Rayleigh散射）。 一小部分光子能量发生变化，即非弹性散射（ 比如Raman 散射）。 Raman 散射的过程分为斯托克斯（Stokes）过程和反斯托克斯（anti-Stokes）过程。 Stokes 过程中，散射光的能量比入射光能量小，anti-stokes 过程中，散射光子的能量比入射光子能量大。,Raman 散射原理,Raman 散射能级跃迁示意图,Rayleigh 散射前后，光子的能量不变 2. Stokes 过程中，光子损失了h的能量，散射光能量变小
4、3. anti-Stokes 过程，光子吸收了h的能量，散射光能量变大,Raman光谱简介,Raman 散射光的散射截面很小，通常只有 Rayleigh 散射的 10-3 10-6，信号采集困难。 19 世纪 60 年代之后，随着激光的出现以及高分辨率的单色仪和高灵敏度的光电检测系统的发展，使 Raman 光谱学进入崭新的阶段，在研究物质成分，结构及相变，物理性质比如超导等方面获得了巨大成功。,Raman光谱的基本特征,Raman光谱的基本特征,I）频率特征 i）不随入射光频率改变而改变； ii）斯托克斯和反斯托克斯频率的绝对值相等； II）强度特征 拉曼散射强度极弱，约为入射光的10-6 1
5、0-12，拉曼谱的斯托克斯强度IS比反斯托克斯强度IAS大许多。,III）偏振特征 当入射光是偏振光时，对确定方位的分子和晶体，散射光的偏振特征与入射光的偏振状态有关，从而有了偏振选择定则。一般，拉曼散射光时偏振光，因此，拉曼光谱往往是偏振光谱。,拉曼光谱数据的处理与鉴认是获得实验光谱后首先遇到的问题。利用谱特征与其它光谱区分开，方法： I）利用不同波长激发，利用谱是否随波长变化，可容 易地区分光致发光光谱和拉曼光谱； II）利用斯托克斯和反斯托克斯之间的对称性确认拉曼谱。,光谱鉴认,典型Raman光谱系统,一种 Raman 光谱系统的简单光路图 激光经分光镜反射后，被透镜聚焦以正入射方式照射
6、在样品上，样品的出射光（包括反射光、Raman 散射、瑞利散射及环境杂散光等）被同样的透镜收集，通过双色镜及滤波片进入光谱仪,二、共聚焦技术（confocal）,共聚焦技术的发展,20 世纪 50 年代中期，Minsky M 在美国哈佛大学进行博士后研究时提出共聚焦（confocal）显微镜的基本概念。 随着纳米、光电技术及现代医学的发展，如何得到更高分辨率的成像成为了人们追逐的目标，confocal 技术也逐渐受到人们的重视。 confocal 以一种非常简单的方法使光学显微镜的空间分辨率逼近光学的衍射极限，使纳米光学成为每个实验室都能研究的课题并得以飞速发展,光学衍射极限,1.光通过小孔时
7、会发生衍射，产生衍射光斑。如果两个物体的距离太近，两物体的一级衍射光斑会部分重合而难以被分辨开来。 2.理论上，光学系统中最小横向分辨率约为0.61/2nsin ，其中为入射光波长，n 为周围环境的折射率，为物镜的孔径角。,共聚焦技术,所谓“confocal”，就是使光轴上的物点和像点共轭。 光学 confocal，即在激发光路和探测光路中分别加入一个小孔光阑当做空间滤波器，这两个光阑被称为照射光阑和探测光阑。 照明光阑和探测光阑相对于被探测点（被照射点）来说是共轭的，激发光路与探测光路分别都在这两个光阑上聚焦，探测点也被称为 confocal 点，其所在平面即为 confocal 平面,典型
8、的激光共聚焦光路,1.激光（绿色线）首先通过一个微米级别的小孔，经双色镜反射后聚焦在样品点表面，这个小孔限制了样品被激发的区域。 2.样品表面发射的信号光（红色线）以正反射式方式透过双色镜并聚焦在另一小孔（探测光阑）上，这一小孔限制了样品被探测的区域，包括面内（x-y 平面）的面积及垂直表面的探测深度（z），保证不使探测范围外的杂散光混入。,两种共焦方法,真共焦,简单共焦 (赝共焦),两种共焦的对比,真共焦 先将激光束经透镜会聚至一个针孔（光源针孔），成为典型的“点光源”。这个点光源发出的光束在显微光轴的侧面，经由分束板至显微光轴，再通过显微物镜会聚在样品的上述照射点处。 位于取样点（即照射点
9、）的“像斑”处的针孔起到了空间滤波的作用； 通过调节针孔孔径，可以控制及精确地界定被探测区域的轴向位置和横向尺寸。 最后再将拉曼光反射到 CCD 接受器。 困难在于整机稳定性必须特别高。略有机械漂移，针孔就会离位，信号即被阻断,赝共焦 取消了“光源针孔”，激光束直接引入显微光轴，也经显微物镜会聚至样品照射点。 在样品照射点的“像斑”处，不用共焦针孔而用狭缝（就用单色仪的入口狭缝）。 共焦针孔的二维空间滤波简化成狭缝的一维空间滤波了。限制 CCD 探测器上像素的读取行数。 于是，狭缝作为一维空间滤波，限制像素的读取行数作为另外的一维（与狭缝垂直）滤波，共同形成一个虚拟的“方孔”，而称为“赝共焦”
10、 放宽了对机械稳定性的要求，因而可以降低成本。降低了空间分辨率（包括横向轴向）,轴向空间分辨率的对比,共聚焦显微镜的优势,1. 信号光和激发光都被限制在小区域内，因此大大提高空间侧向的分辨率（x 和 y 方向）。 2. 周围背景的反射光、散射光等均被收集光路上的小孔进行了空间滤波，因此降低了背景的强度。 3. 提高了视场深度和轴向的清晰度（z 轴）。只有靠近严格焦平面的一个薄层的部分光信号才能通过收集小孔被探测器收集，而焦点外区域对于探测信号的贡献可以忽略，从而提高轴向的清晰度及有效的抑制了杂质（如灰尘荧光、样品背面的污染）产生的背景噪音。分辨率接近于光学的半波衍射极限。,三、共聚焦拉曼光谱的
11、应用,共焦拉曼光谱区分宝石真假,同天然红宝石相比, 人工合成红宝石的主要拉曼峰如 377, 416 cm-1的半高宽均 6 c m-1, 一般为 8 10 cm-1,天然、 人工合成红宝石的拉曼光谱,共焦显微拉曼光谱深度剖析法在笔迹鉴定中的应用,印泥的信号强 度在零位置达到最大，签字笔的信号强度在 3um 处达到最大。 二者空间差距大于共焦拉曼光谱仪在 z方向上最小分辨距离（M KI-2000型共焦显微拉曼光谱仪采用50倍物镜,空间横向分辨率约 1um, 空间纵向分辨率约 2um） 所以二者在 z 方向上的空间位置可以通过共焦拉曼光 谱方法分开。,显微共焦拉曼光谱研究电化学合成聚苯胺膜,在不同的激发光聚焦深度,聚苯胺膜的拉 曼光谱有明显变化. 反映出聚苯胺膜的掺杂程度在膜生长过程中随膜厚度的增长而增加,共聚焦拉曼谱探测和鉴别隐匿的违禁药物,(a) 是一片可卡因HCl晶体上的指甲油的拉曼谱， (b)是指甲油下面的一片可卡因HCl晶体的拉曼谱 ， (c) 可卡因HCl的标准参考谱。 全谱用785 nm 波长激光激发，(a)收集时间10s，(b)和(c)收集时间是5s,