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1、第五章 动物性食品中致病微生物和寄生虫的检验检疫,根据国家食源性疾病监测网部分资料的分析结果显示，我国食源性疾病的高危食品依次为肉类、粮食、海产品、水果蔬菜、鸡蛋、豆类、奶。由动物或植物性食物污染所引起的疫病比例接近（约各占30%），而其中因微生物污染引起的食源性疾病比例接近40%，远高于化学性食物中毒（20%）。综观国内外食源性疾病的发病情况，动物性食品中微生物污染是人类食源性疾病的主要问题。,动物性食品中微生物污染的可能途径主要有： 食品原料本身的污染； 动物养殖环境中的微生物对食品原料的污染； 屠宰过程中的污染； 深加工动物食品可能受到加工车间、加工设备表面残存微生物污染； 食品从加工出
2、厂、贮存、运输、销售过程中可以受到相应环境中微生物的污染； 在家庭、宾馆等厨房中生熟食品的交叉污染。,第一节 动物性食品中菌落总数与大肠菌群的检验,食品微生物检测所涉及的类群,微生物检测程序,样品的采集 注意： 1 所用接触样品的用具经过灭菌 2 取样要均匀、特殊样品要控制温度 3 样品采好后要贴上标签（注明：样品名称、来源、数量、采样人、地点及时间）,样品的微生物检验 注意： 1 采好的样品送检不要超过3小时 2 检完的样品的存放时间 3 报告的填写,微生物对食品的污染问题是我国乃至全世界食品安全中最突出的问题，我国为此数次颁布食品微生物检验标准。按照食品安全国家标准要求，菌落总数和大肠菌群
3、是食品企业出厂时必检的微生物指标。,菌落总数是指一定培养条件下（如需氧状况、培养基成分、PH、培养温度和时间等）每克（每毫升）食品样品中所生长出来的细菌菌落总数。 检测菌落总数，可以判定食品被细菌污染程度，反映出食品的新鲜程度和卫生状况。如果某食品的菌落总数严重超标，说明其产品的卫生状况达不到基本的卫生要求，食品将加速腐败变质，失去食用价值。,菌落总数的检验程序,注意事项：,1 操作要在无菌的状态下进行。 2 操作时间越短越好。 3 样品不同选择的稀释倍数不同。 4 培养基冷却温度不宜过高或过低。,大肠菌群系指一群能发酵乳 糖、需氧和兼性厌氧的革兰 氏阴性无芽孢杆菌，包括肠 杆菌科的大肠埃希氏
4、菌属、柠檬杆菌属、肠杆菌属和克雷伯菌属细菌。 检测大肠菌群，可以判定食品被与粪便污染有关的细菌污染的程度。如果某食品的大肠菌群超标，则可以推测其产品中存在着肠道致病菌污染的可能性，食用之可能导致食物中毒或罹患流行病。,第二节 动物性食品中致病性细菌的检验 沙门氏菌 致病性大肠杆菌 副溶血弧菌 金黄色葡萄球菌 溶血性链球菌 产单核细胞李斯特菌 肉毒梭菌 结核分枝杆菌 空肠弯曲杆菌 炭疽杆菌 产气荚膜梭菌 蜡样芽孢杆菌 变形杆菌,食品中沙门氏菌检验,一、实验目的 1、掌握食品中沙门氏菌的检验原理。 2、掌握食品中沙门氏菌的检验方法。,二、实验原理 （一）沙门氏菌属简介,沙门氏菌属是一群符合肠杆菌科
5、定义并与其血清学相关的革兰氏阴性、需氧性、无芽孢杆菌。本菌属种类繁多，抗原结构复杂，现已发现2000多个血清型，我国已发现血清型近200个。,沙门氏菌属生物学特性,形态特征： 革兰氏阴性，大小为1-30.4-0.9m的两端钝圆的短杆菌，无芽孢，一般无荚膜，除鸡沙门氏菌和雏沙门氏菌以外，都有周身鞭毛，运动力强。,培养特性： 沙门氏菌需氧或兼性厌氧，1042都可生长，最适生长温度为37，最适pH为6.87.8。 营养琼脂平板上：3537培养18-24h，其菌落大小一般为23mm，光滑、湿润、无色、半透明、边缘整齐。 血平板上：中等大小的灰白色菌落。,生化特性： 绝大多数沙门氏菌有规律的发酵葡萄糖产
6、酸产气，但也有不产气者，不发酵蔗糖和侧金盏花醇、不产生吲哚、不分解尿素。,沙门氏菌属的抗原,菌体抗原（O抗原） 表面抗原（K抗原）：Vi抗原和M抗原 鞭毛抗原（H抗原） 纤毛抗原,沙门氏菌属致病性,沙门氏菌胃肠炎是由除伤寒沙门氏菌外任何一型沙门氏菌而所致，潜伏期一般6-72小时，主要症状为恶心、呕吐、腹绞痛、腹泻、发热寒颤头痛。病程一般12天或更长。感染剂量为1520个菌，死亡率达14%。最易感群体是年幼儿童、虚弱者、年长老人、免疫缺陷者等。 污染源主要是人和家畜的粪便，沙门氏菌常存在于动物中，特别是禽类和猪。在许多环境中也有存在。从水，土壤，昆虫中，从工厂和厨房设施的表面和动物粪便中已发现该
7、类细菌。它们可以存在于多类食品中，包括生肉，禽，奶制品和蛋，鱼，虾和田鸡腿，酵母，椰子，酱油和沙拉调料，蛋糕粉，奶油夹心甜点，顶端配料，干明胶，花生露，橙汁，可可和巧克力。,（二）检验,1.前增菌: 第一步使食物样品在含有营养的非选择性培养基中增菌，使受损伤的沙门氏菌细胞恢复到稳定的生理状态。 2.选择性增菌: 在含选择性抑制剂的促生长培养基中间，样品进一步增菌的一个步骤。此培养基允许沙门氏菌持续增殖，同时阻止大多数其他细菌的增殖。 3.选择性平板分离: 这一步采用固体选择性培养基，抑制非沙门氏菌的生长，提供肉眼可见的疑似沙门氏菌纯菌落的识别。 4.生物化学筛选: 排除大多数非沙门氏菌。也提供
8、了沙门氏菌培养物菌属的初步鉴定。 5.血清学技术提供了培养物菌种的鉴定。,三、实验仪器和材料 1 冰箱：04。 2 恒温培养箱：361，42。 3 显微镜：10100。 4 高压灭菌器。 5 超净工作台。 6 均质器或灭菌乳钵。 7 架盘药物天平：0g500g,精确度0.5g。 8 灭菌广口瓶：500mL。 9 灭菌锥形瓶：500mL、250mL。 10 灭菌吸管：10mL（具0.1 mL刻度）。 11 天菌培养皿：90mm。 12 灭菌小试管：内径3mm50mm。 13 灭菌毛细管。,四、培养基和试剂 1 缓冲蛋白胨水(BP) 2 氯化镁孔雀绿(MM)增菌液 3 四硫酸钠煌绿(TTB)增菌液
9、 4 亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液 5 亚硫酸铋琼脂(BS) 6 DHL琼脂 7 HE琼脂：按GB/T 4789.282003中4.21规定。 8 TSI琼脂 9 蛋白胨水、靛基质试剂 10 尿素琼脂(pH7.2) 11 氨基酸脱羧酶试验培养基 12 沙门氏菌因子血清：按26种用于初步分型；57种用于进一步分型；163种用于详细分型。,五、检验样品 1 鲜猪肉、鲜牛肉；冻猪肉 2 鲜牛奶、鲜鱼；冻鱼 3 香肠、虾仁,六、沙门氏菌检验流程,检样 前增菌法 直接增菌法 冻肉、蛋品、乳品及其它加工食品 鲜肉、鲜蛋、鲜乳及其它未经加工的食品 25g BP 225mL 25g 灭菌生理盐水25mL 制成
10、检样均质液 （361） 一般 4 h，干蛋品 1824 h 10mLMM(或TTB)100mL 10mLSC 100mL 检样均质液的半量MM(或TTB)100mL 检样均质液的半量SC 100mL 42 1824 h （361） 1824 h 42 1824 h （361） 1824 h BS DHL(或HE、WS、SS) （361） 4048 h （361） 1824 h 挑取可疑菌落 TSI（斜面、底层、产气、H2S）、蛋白胨水（靛基质）、尿素（pH7.2）、KCN、赖氨酸 H2S靛基质 H2S靛基质 H2S靛基质 非如左述的 尿素KCN赖氨酸 尿素KCN赖氨酸 尿素KCN赖氨酸/ 各种
11、反应结果 甘露醇、山梨醇 ONPG 沙门氏菌血清学实验 沙门氏菌血清学实验 非沙门氏菌 非沙门氏菌 报告,七、操作步骤,1、前增菌和增菌 冻肉、蛋品、乳品及其他加工食品均应经过前增菌。以无菌操作取25g（mL），加在装有225mL缓冲蛋白胨水的500mL广口瓶内。固体食品可先应用均质器以8000 10000r/min打碎1min，或用乳钵加灭菌砂磨碎，粉状食品用灭菌匙或玻棒研磨使乳化，于361培养4h (干蛋品培养18h24h)，移取10mL，转种于100mL氯化镁孔雀绿增菌液或四硫酸钠煌绿增菌液内，于42培养18h 24h。同时，另取10mL，转种于100mL亚硒酸盐胱氨酸增菌液内，于361
12、培养18h24h。,鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其他未经加工的食品不必经过前增菌。各取25g(25mL)加入灭菌生理盐水25mL，按前法做成检样匀液；取25mL，接种于100mL氯化镁孔雀绿增菌液或四硫磺酸钠煌绿增菌液内，于42培养24h；另取25mL接种于100mL亚硒酸盐胱氨酸增菌液内，于361培养18h24h。,2、分离 取增菌液1环，划线接种于一个亚硫酸铋琼脂平板和一个DHL琼脂平板(或HE琼脂平板、WS或SS琼脂平板)。两种增菌液可同时划线接种在同一个平板上。于361分别培养18h24h(DHL、HE、WS、SS)或40h48h(BS)，观察各个平板上生长的菌落。,沙门氏菌属各群在各种选择性琼
13、脂平板上的菌落特征,3、生化试验 自选择性琼脂平板上直接挑取数个可疑菌落，分别接种三糖铁琼脂、蛋白陈水(供做靛基质试验)、尿素琼脂(pH7.2)、氰化钾(KCN)培养基和赖氨酸脱竣酶试验培养基及对照培养基各1管，于361培养18h24h，必要时可延长至48h，按生化反应初步鉴定表判定结果。按反应序号分类，沙门氏菌属的结果应属于A1、A2和B1，其他5种反应结果均可以排除。,肠杆菌科各属在三糖铁琼脂内的反应结果,肠杆菌科各属生化反应初步鉴别表,沙门氏菌检验几点注意,冷冻样品解冻需在45以下，有自动调温器自控的水浴锅内不断搅拌进行15min或在2-8，18小时内软化。 为保证检验的准确性，必须在选
14、择性培养基上挑取足够数量的菌落进行生化和血清学鉴定。 进行生化反应时，应以纯培养物进行试验，如出现血清学阳性，而生化反应特征不符合时，应对接种物进行纯化，用纯化后的培养物重新进行生化试验。 测试中应同时接种阳性对照菌株。,金黄色葡萄球菌细菌学及其检验,1 生物学性状,自然分布： 金黄色葡萄球菌分布广泛，存在于环境、空气、水、牛奶、食品、污水及人和动物等。与人关系密切，构成人体皮肤、鼻腔、咽部等处的正常细菌群，对人有致病性，是临床医学中常见的化脓性球菌之一，也是污染食品造成食物中毒的细菌之一。,形态与染色： 典型金黄色葡萄球菌呈球形，直径0.51.0微米，较非致病性葡萄球菌略小，各个菌体的大小及
15、排列较整齐。细菌繁殖时呈多个平面的不规则分裂，堆积成葡萄串状排列。在脓汁或液体培养基中生长，常呈双球或短链排列，易误为链球菌。金黄色葡萄球菌无鞭毛，故不能自由移动，一般不形成荚膜，不产生芽孢。革兰氏染色为阳性，衰老、死亡或被白细胞吞噬的菌体，常转呈革兰氏阴性，故须注意。,培养特性： 本菌为需氧或兼性厌氧，对营养要求不高，在普通培养基上生长良好，最适宜生长温度为37，最适宜pH为7.4，耐盐性强，在含10-15%氯化钠培养基中能生长，利用这一特性，可有利于金葡菌的检出。,在普通琼脂培养基上形成圆形、凸起、表面光滑、湿润、边缘整齐、不透明的菌落。直径一般为1-2mm，密集生长的菌落较小，稀散或生长
16、较久着， 直径可达4-5mm。 在普通肉汤培养基中生长迅速，一般呈均匀混浊生长，如培养基中的糖类被分解后，产生较多的酸性物质即可发生酸性沉淀。培养时间较长，2-3日后常有菌膜形成而出现粘性沉淀。,在血琼脂平板上形成较大菌落，有色素产生，由于本菌产生的色素为脂溶性不溶于水，故色素只局限于菌落内，不透入培养基中。该菌产生溶血毒素，使菌落周围红细胞溶解而形成透明的溶血环，非致病性葡萄球菌无此现象。,在Bairdparker琼脂平板上，菌落呈圆形凸起，表面光滑湿润，直径23mm，灰黑色至黑色，有光泽，常有浅色的边缘，周围绕以不透明圈，其外常有一清晰带，菌落有黄油样粘稠感。从长期贮存的冷冻或脱水食品中分
17、离的菌落，其黑色常较典型菌落浅些，且外观可能较粗糙，质地较干燥。,抵抗力： 葡萄球菌抵抗力较强，在干燥的脓汁中能存活数月，有些菌株需加热 80 3060分钟才被杀死。在5%石炭酸中15分钟死亡。,2 致病性,金黄色葡萄球菌为潜在性的病原菌，它所产生的多种胞外蛋白质对人和动物组织有害，其中一类是各种酶类，如脂酶、蛋白酶、青霉素酶、凝固酶和耐热DNA酶等，另一类为毒素，它们是溶血素（、 ）、溶白细胞素、肠毒素（A 、B、 C、 D、E、TSS）及化脓性毒素等。,2 致病性,虽然人体对金葡菌感染具有一定的抵抗力，但当机体抵抗力下降或皮肤粘膜受损时易被感染，可引起局部或全身炎症，侵入血流可引起败血症及
18、脓毒血症。金葡菌污染食品之后可能产生大量的肠毒素，肠毒素是该菌引起食物中毒的主要因素之一。,金葡菌肠毒素具有极强的稳定性，能抵抗许多蛋白酶的消化，只有在小于pH2的条件下蛋白酶才能使其失去活性。这一点可以解释，为什么摄入肠毒素在胃中有蛋白酶时，仍然引起食物中毒，因为胃液的酸度大于pH2，所以不能消化肠毒素。肠毒素还相当耐热，经煮沸30分钟后仍不能完全破坏其毒性。当含肠毒素为20/ml 的牛肉汤（pH6.2），在121 加热需要37分钟以上，才能灭活毒素。,金葡菌肠毒素的产生因菌株不同而有所差异，有资料显示，食品中存在的金葡菌几乎都产生肠毒素，以SEA型为最多。以往认为凝固酶阳性的金葡菌能产生肠
19、毒素，但不是都产生肠毒素。后有实验证实，有些产生肠毒素的金葡菌株产生耐热DNA酶却不产生凝固酶，即一些凝固酶阴性菌株也产生肠毒素，要鉴定是否是产毒株，需同时进行凝固酶和耐热DNA酶测定试验。而耐热DNA酶和肠毒素的耐热力相近似，由此可见耐热DNA酶的产生与肠毒素的关系较凝固酶更为平行。所以常用耐热DNA 酶试验代替肠毒素测定。自1982年起有些国家就提出进口方便食品中不得检出含有耐热DNA酶的金葡菌。,结核分枝杆菌,分枝杆菌属Mycobacterium 一类直或微弯曲的杆菌，有分枝生长趋势，可呈丝 状或菌丝样生长。细胞壁脂质含量高（分枝菌酸）， 耐酸，抗酸染色阳性。对氧和营养要求高，生长慢。
20、不产生毒素和侵袭酶类，引起慢性疾病。 又称抗酸杆菌(acid-fast bacillus)-不易着色，可抵抗盐酸酒精的脱色作用 分类属放线菌科，本属有80多种，可分三类： 结核分枝杆菌、非结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌。 细菌的DNA G+Cmol%为6270,临床标本 抗酸染色+ L-J分离培养 +7天 +7天 缓生菌 速生菌 PNB + - - T2H + + - 非典型分枝杆菌 人型结核分枝杆菌 牛型分枝杆菌 光反应性试验 光产色菌 暗产色菌 不产色菌 分枝杆菌的鉴定程序,结核分枝杆菌,一、分类 结核分枝杆菌（Mycobacterium Tuberculosis，TB）复合群： 人结核分枝杆
21、菌(M.tuberculosis) 牛分枝杆菌(M.bovis) 非洲分枝杆菌 田鼠分枝杆菌,二、细菌特性 形态染色 TB菌细长略弯曲，有时可见分枝，呈单、成堆或成束排列，无鞭毛、无芽胞，有荚膜。可出现多形性，在陈旧的病灶和培养物中，形态常不典型，可呈颗粒状，串球状，短棒状，长丝形等。TB菌革兰染色阳性。 荧光染料金胺O染色，在荧光下菌体呈橘黄色。 萋尼氏抗酸性染色法染色，菌体染成红色。,培养特性 专性需氧菌，3%5%的CO2能促进生长。最适ph 6.5 6.8 ，最适温度为37，低于30难生长，营养要求高，在 含有蛋黄、马钤薯、甘油和天门冬素等的固体培养基上才能 生长，且生长缓慢。 固体培养
22、基-典型菌落为干燥、坚硬、表面呈颗粒状、 乳酪色或淡黄色，形似菜花样。 液体培养基-生长较快呈粗糙皱纹状菌膜生长，有毒株可 呈索状生长（吐温干扰）。,菜花样菌落,生化反应 生化不活泼。不发酵糖类，多数菌株触酶阳性，热触酶 阴性，非结核分枝杆菌正好相反。 结核分枝杆菌烟酸和硝酸盐试验阳性，耐噻吩2羧酸 肼(T2H)，牛型则相反。有毒株中性红试验阳性。 变异性 TB菌易发生形态、菌落、最适生长温度、毒力和耐药性的变异。如卡介苗、Much颗粒和多重耐药菌株出现等。,抵抗力 TB菌细胞壁含大量脂类，抵抗力较强 干痰中存活6-8个月，粘附尘埃上保持传染性8-10天。 3%HCL或4%NaOH、6%H2S
23、O4溶液中能耐受30分钟 常以酸碱中和处理严重污染的检材，杀死杂菌和消化粘稠物质，提高检出率 对一定浓度的孔雀绿有抵抗力。 对湿热、紫外线、酒精的抵抗力弱。 (如在液体中加热6030分钟，直射日光下23小时，75%酒精内数分钟即死亡。),三、临床意义 TB菌引起结核病。对人类致病的有人结核分枝杆菌、牛型结核杆菌和非洲分枝杆菌，人型结核杆菌感染引起的发病率最高。成为全球性重大公共卫生问题。 所致疾病 TB菌的致病作用可能是细菌在细胞内增殖引起炎症反应，以 及诱导机体产生免疫反应性损伤有关。通过呼吸道、消化道 和破损的皮肤粘膜进入机体，侵犯多种组织器官，引起相应 器官，其中以肺结核最常见。可分原发
24、感染和继发感染。,免疫性 TB菌的感染率很高，发病率却较低，这表明人体感染结核杆 菌可获得一定的抗结核免疫力，这种免疫称为有菌免疫或传 染性免疫。TB菌的免疫原rRNA和变应原结核菌素诱发机体 产生由T淋巴细胞介导细胞免疫反应。,致病物质 1.脂质脂质占菌体干重的2040%，占胞壁干重的60%。磷脂：能刺激单核细胞增生，并可抑制蛋白酶的分解作用，使病灶形成干酷样坏死。 索状因子：是分枝菌酸与海藻糖的复合物，具有破坏细胞线粒体膜，毒害微粒体酶类，抑制中性粒细胞游走和吞噬作用，引起慢性肉牙肿。具有该物质的TB菌毒株，在液体培养基中能紧密粘成索状。 蜡质D：是一种肽糖脂与分枝菌酸复合物，能引起迟发型
25、变态反应，并具有佐剂作用。 硫酸脑苷脂：TB菌毒株胞壁中含有，能抑制吞噬细胞中的吞噬体与溶酶体融合，使结核杆菌在细胞内存活。,2.荚膜主要为多糖，少量脂质和蛋白质。 粘附和入侵分解物质提供营养防止有害物质入侵 3.蛋白质TB菌菌体内都含有数种蛋白质，其中重要的蛋白质是结核菌素。结核茵素与蜡质D结合，能引起较强的迟发型变态反应。其他蛋白质可引起机体产生相应的抗体，但无保护作用。,四、微生物学检验 临床标本 涂片检查 分离培养 核酸检测 抗体检测 直接涂片 集菌涂片 处理标本或无污染标本 染色 液体培养基 固体培养基 动物试验 （罗氏或米氏） 抗酸 金胺O 37， 涂片镜检 仪器培养 7天生长 7
26、天生长 快速生长菌 慢生长菌 菌种鉴定 抗酸染色 菌落特点 鉴定试验 药敏试验,标本采集 感染部位不同，取不同的标本，宜用能抑制污染菌的方法 常见标本：痰、尿、胸腹水等 检查方法 1.显微镜检查 1）直接涂片：用萋尼氏法染色，若镜检找到抗酸性杆菌，通常应报告：“查到抗酸性杆菌”，需进一步分离培养鉴定。 2）浓缩集菌涂片：如标本中菌量少，杂菌和杂质多时，用离心沉淀法将菌浓缩聚集，再取沉淀物涂片作抗酸染色检查,分离培养 TB菌接种前处理液化和处理杂菌 4%NaOH、6%H2SO4、胰酶 15-20min 培养基选择罗氏培养基 鉴别培养基(PNB、T2H、NAP) 仪器培养Bacte460、BacT
27、/ALERT3D 液体培养基 培养时间长 一般6-8周 鉴定 1.染色性; 2.菌落特征; 3.生长速度; 4.色素产生; 5.生化试验,鉴别试验： NAP(p-nitro-acetylamino-hydroxy-propiophenome)抑制试验 结核分枝杆菌 NAP- 非结核分枝杆菌 NAP+,免疫学检测 1.结核菌素试验：OT或PPD 迟发型超敏反应。 2.全血干扰素测定 3. 抗体检测 检测PPDIgG辅助诊断。目前血清抗阿拉伯糖甘露糖脂IgG抗体是一种新的较好的诊断结核病的指标。 核酸检测 快速诊断PCR-RFLP、PCR-SSCP、PCR-核酸探针、PCR-核酸测序、多重PCR、
28、双重复插入序列PCR等。 色谱分析技术 测分枝菌酸,药物敏感试验 动物接种 菌株分离和检测毒力 结果分析与报告 涂片镜检的报告方式,非典型分枝杆菌,指结核分枝杆菌与麻风杆菌以外的分枝杆菌 已发现17种以上可引起人类疾病，在临床上难以与结核分枝杆菌感染区别 分类 光产色菌：暗处不产色素，光照后产色素 暗产色菌：有光或无光均产色素 不产色菌：有光或无光均不产色素 迅速生长菌：普通培养基上生长 3-6天,光产色菌 堪萨斯分枝杆菌、海分枝杆菌、猿分枝杆菌 暗产色菌 瘰痢分枝杆菌、苏尔加分枝杆菌 不产色菌 鸟-胞内复合分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、蟾分枝杆菌 迅速生长菌 偶发分枝杆菌、龟分枝杆菌,第三节 动物
29、性食品中致病性病毒的检验 口蹄疫病毒 流行性感冒病毒 禽流感病毒 猪瘟病毒 新城疫病毒 马立克氏病病毒 朊病毒 冠状病毒,口蹄疫病毒检验,口蹄疫病毒(Food and mouth disease virus，FMDV)是牛、猪、羊等偶蹄动物口蹄疫的病原。 是全球性最重要的动物健康问题之一。1898年，德国科学家Loeffler与Frosch发现口蹄疫病畜的病料通过滤菌器后仍能使健康动物发病。,一、生物学特性 口蹄疫病毒属于：微RNA病毒科(Picornaviridae)口蹄疫病毒属(Aphthovirus)，属内只有口蹄疫病毒一种。二十面体对称，直径2025nm，无囊膜，病毒基因组为单股正链R
30、NA，在RNA芯髓外对称衣壳上有32个壳粒。电镜下，可见病毒粒子表面的颗粒状结构和一个密度较低的中心。此外尚可见有较小的蛋白质亚单位颗粒，直径78nm，无感染性。病毒子在宿主细胞浆内可形成晶格状排列。本病毒是动物病毒中发现最早的一种。,二、抵抗力 对酸敏感，病毒在pH为6.5的缓冲液中、4条件下14h灭活90，在pH5.5时1min灭活90，在pH5.0时每秒钟灭活90，pH3.0时瞬间灭活，病毒在pH7.07.5时十分稳定。病毒的感染性RNA在pH4.0时较原病毒稳定。口蹄疫病毒对碱也很敏感。对消毒剂的抵抗力较强。病毒在低温下能长期保存。病毒的灭活温度为851min，7010min，6015
31、min，但裸露的RNA对热较稳定。,三、抗原性 根据病毒的血清学特征，目前已知口蹄疫病毒有七个主型：A、O、 C、南非、南非、南非和亚洲型(SAT1、SAT2、SAT3、Asia1 )。各型之间没有相互免疫作用。 本病毒有较大的变异性，病毒在保存和流行中，常发生血清学的变异，有时流行初期与末期毒型不一致，几乎每年都有新的亚型出现，本病毒已发现85个以上的亚型。,四、培养特性 1组织培养 利用犊牛、幼猪的肾脏或豚鼠、牛胚胎上皮组织制成细胞单层来培养病毒，病毒繁殖后，使细胞发生病变。 2鸡胚培养 本病毒不易在鸡胚上生长，必须反复交替通过牛与鸡胚或在添有牛舌上皮的鸡胚组织培养继代后，才可能适应于鸡胚
32、或鸡胚组织培养。 在感染了口蹄疫病毒的细胞培养液中，有大小不同的4种粒子：最大的粒子为完整病毒；第二种为不含RNA的空衣壳；第三种为衣壳蛋白亚单位；第四种是病毒感染相关抗原。,五、致病性 在自然条件下，主要发生于偶蹄兽，其中以奶牛和黄牛最易感，其次是水牛，牦牛、猪，再次为羊和骆驼等。野生偶蹄兽也能发生。从流行病学的观点来看，绵羊是本病的“储存器”，猪是“扩大器”，牛是“指示器”。 1.传播途径:呼吸道、消化道(被污染的饲料、饮水) ；创伤、皮肤、粘膜 2.流行特点：有一定的季节性(以冬、春季节发病较多，夏季可以平息),传播迅速,一般沿交通线进行传播。,六、微生物学诊断 (一)豚鼠接种试验 选择
33、500g以上的健康豚鼠46只，剪去后肢足掌部被毛，用湿棉花球洗净，再用70酒精棉消毒。将足掌部皮肤或口腔粘膜划破，把感染性病料涂擦于划破处。第二天如局部有水疱，即可确诊。 (二)乳鼠接种试验 选27日龄乳鼠5只，4只做检样，1只做对照，每只颈背部皮下接种0.1ml，观察1周，如有死鼠,及时取出，制备1:3检样，传代。如无死鼠取活鼠冻死传代，传2-3代不死亡为阴性。 接种乳鼠：呼吸急促，四肢和全身麻痹,禽流感病毒,禽流感： 是野生鸟类和家禽感染了一种甲型流感病毒，即禽流感病毒以后引起的以体温升高、打喷嚏、头部水肿、呼吸困难、产蛋率明显减少、腹泻等症状呼吸道传染病。被国际兽疫局定为甲类传染病，由称
34、真性鸡瘟或欧洲鸡瘟。按病原体不同，禽流感可分为高致病性、低致病性和非致病性三大类。,一、定 义,禽流感： 1878年，意大利发生鸡群大量死亡（鸡瘟的由来），1955 年证实其致病病毒为甲型流感病毒。此后，这种疾病被更 名为禽流感 19831984在美国、19921995在墨西哥、19992001在 意大利均发生禽流感的爆发流行 1997年香港发生了禽流感流行，150万鸡被宰杀，病毒为 H5N1 2003年月荷兰发生禽流感病毒H7N7流行 2003年12月5日禽流感在韩国爆发，疫情蔓延迅速，至今 该病毒已经在亚洲10个国家和地区出现过不同程度的流行,二、历史回顾,流感病毒属于正粘病毒（Ortho
35、myxovirus），大多呈球形颗粒状。正、副粘病毒的区别是以其核酸是否分节段为标准，分节段者为正粘病毒，不分节段者为副粘病毒。事实上，正粘病毒只有流行性感冒病毒一种。,三、流感病毒,结构： 病毒的直径为80120nm，内有一直径约为70nm 的电子致密核心，是病毒的核衣壳。流感病毒的结构主要包括内部的核心（即核衣壳）和外面的包膜（即病毒囊膜）两部分。核酸为单股负链RNA，甲、乙型流感病毒为8 个节段，丙型为7个节段，每一个节段就是一个基因， 决定流感病毒的遗传特性。根据核蛋白抗原性的不同，可把感染人的流感病毒分为甲、乙、丙三型。,三、流感病毒,灭活： 经过56，30分钟、60，10分钟处理均
36、 会丧失活性；加热到6570时只要2 分钟即失活 对紫外线敏感，用紫外线直接照射病毒可 以依次破坏其感染力、血凝素活性和神经 氨酸酶活性 在阳光直射下流感病毒4048小时即失活,三、流感病毒,四、流行病学(禽、人禽流感),传播途径： 飞沫经呼吸道传播（与SARS冠状病毒育别） 接触传播：经口，黏膜，破损皮肤 经口传播：污物口，粪口,(1)病毒分离 采用级鸡胚或敏感细胞系(如Vero、MDCK) 通常采用鼻咽拭子、含漱液、气管/肺胞灌洗液等 病毒分离后需经核酸检测和/或血清检测证实 病毒分离后可通过基因测序以确定所分离毒株与既 往分离毒株间的关系,1.病原学检测,（三）实验室检查,(2)核酸检测
37、 技术：RT-PCR、NASBA等 RT-PCR：目前常用技术。 目的基因：H5(HA1、HA0)、NP、NS等。 结果判定: 阳性：存在AI病毒。 阴性：不能依据阴性结果排除AI。,3.抗体检测 抗体：抗血凝素(HA)抗体、抗H5特异性体、抗神经氨酸酶 (NP)抗体、等。 方法：免疫荧光技术、 ELISA、血凝抑制试验（关于血凝试验 和血凝抑制试验）。 意义：检测病毒特异性IgM 抗体，单份血清阳性可作为早期诊 断依据检测。检测急性期和病后第34 周双份血清(血 清总抗体)，抗体效价增长4 倍以上，提示近期感染。,4.抗原检测 采用酶、荧光或其他标记单克隆抗体染色，可检出感染细 胞内相应的病
38、毒抗原，作为早期特异性诊断。,病原学检测需要有两个实验室平行检测，可与其他具有一定条件的实验室协同。 禽流感疫情的确认要由国家禽流感参考实验室（哈尔滨兽医研究所）检测鉴定。,第四节 动物性食品中致病性寄生虫的检验 旋毛虫 囊尾蚴 肉孢子虫 弓形虫 棘球蚴,旋毛虫病肉品检验技术,旋毛虫病是重要的人畜共患寄生虫病，它是由毛形科的旋毛形线虫成虫寄生于肠管，幼虫寄生于横纹肌所引起的。该病流行于哺乳类动物间，鸟类可实验感染。人若摄食了生的或未煮熟的含旋毛虫包囊的猪肉可感染生病，主要临床表现为胃肠道症状、发热、肌痛、水肿和血液嗜酸性粒细胞增多等，严重者可以导致死亡，故肉品卫生检验中将旋毛虫列为首要项目。旋
39、毛虫病的肉品检验是生猪屠宰检疫中的一项重要内容，通过该项检验可以检出感染旋毛虫的猪只。对于杜绝病猪肉流入肉品市场，有着重要的作用。,一、实验目的及要求 1掌握肌肉旋毛虫压片镜检法、消化法的操作方法。 2了解酶联免疫吸附试验的方法。 3掌握旋毛虫病肉的处理方法。,二、实验器材 （一）旋毛虫压片镜检法 1材料：被检肉品。 2器材：载玻片，剪刀，镊子，天平，显微镜。 3试剂：50%甘油水溶液，10%稀盐酸。,（二）旋毛虫集样消化法 1材料：被检肉品。 2器材：组织捣碎机，采样盘，磁力加热搅拌器，圆盘转动式计数镜检台，集虫器，载玻片，表面皿，烧杯，剪刀，镊子，天平，温度计，显微镜。 3试剂：0.04%
40、胃蛋白酶溶液，盐酸。,（三）旋毛虫酶联免疫吸附试验（ELISA） 1材料：被检肉品。 2器材：滤纸片，玻璃瓶，剪刀，酶标测定仪，反应板，加样器。 3试剂： （1）阳性血清，阴性血清； （2）旋毛虫抗原； （3）酶标抗体（又称酶结合物、酶标记免疫球蛋白）； （4）包被液：Na2CO3 1.59g、NaN3 0.2g、NaHCO3 2.93g，用蒸馏水加至1000ml，调整pH为9.6。放4冰箱中保存备用。 （5）洗涤液：NaCl 8.9g、Tween-20 0.5g、KH2PO4 0.2g、NaN3 0.2g、Na2HPO412H2O 2.9g、KCl 0.2g，用蒸馏水加至1000ml，调整p
41、H为7.4。 （6）底物溶液（OPD-H2O2）：称取邻苯二胺40mg，溶解于100ml pH5.0磷酸-柠檬酸缓冲液（0.1M柠檬酸24.3m1，加0.2M NaH2PO4 25.7ml，加水50ml）中，然后加30过氧化氢0.15ml，现配现用。 （7）终止液（2M H2SO4）：浓硫酸22.2ml，蒸馏水177.8ml。,三、实验方法、步骤和操作要领 （一）旋毛虫压片镜检法 1采样。自胴体左右两侧横膈膜的膈肌脚，各采膈肌1块（与胴体编成相同号码），每块肉样不少于20g，记为一份肉样，送至检验台检查。如果被检样品为部分胴体，则可从肋间肌、腰肌、咬肌等处采样。,2肉眼检查。撕去被检样品肌膜，
42、将肌肉拉平，在良好的光线下仔细检查表面有无可疑的旋毛虫病灶（见图21-2）。未钙化的包囊呈露滴状，半透明，细针尖大小，较肌肉的色泽淡；随着包囊形成时间的增加，色泽逐步变深而为乳白色、灰白色或黄白色。若见可疑病灶时，做好记录且告知总检将可疑肉尸隔离，待压片镜检后做出处理决定,3制片。取清洁载玻片1块放于检验台上，并尽量靠近检验者。用镊子夹住肉样顺着肌纤维方向将可疑部分剪下。如果无可疑病灶的，则顺着肌纤维方向在肉块的不同部位剪取12个麦粒大小的肉粒（2块肉样共剪取24个小肉粒）。将剪下的肉粒依次均匀地附贴于载玻片上且排成两行，每行6粒。然后，再取一清洁载玻片盖放在肉片的载玻片上，并用力适度捏住两端
43、轻轻加压，把肉粒压成很薄的薄片，以能通过肉片标本看清下面报纸上的小字为标准。另一块膈肌按上法制作，两片压片标本为一组进行镜检 。,4镜检。把压片标本放在低倍（410）显微镜下，从压片的一端第一块肉片处开始，顺肌纤维依次检查。镜检时应注意光线的强弱及检查速度，切勿漏检。,5结果判定。 （1）没有形成包囊的幼虫，在肌纤维之间呈直杆状或逐渐蜷曲状态，但有时因标本压得太紧，可使虫体挤入压出的肌浆中。 （2）包囊形成期的旋毛虫，在淡黄色背景上，可看到发光透明的圆形或椭圆形物。包囊的内外两层主要由均质透明蛋白质和结缔组织组成，囊中央是蜷曲的虫体。成熟的包囊位于相邻肌细胞所形成的梭形肌腔内。,（3）发生机化
44、现象的旋毛虫。虫体未形成包囊以前，包围虫体的肉芽组织逐渐增厚、变大，形成纺锤形、椭圆形或圆形的肉芽肿。被包围的虫体有的结构完整，有的破碎甚至完全消失。虫体形成包囊后的机化，其病理过程与上述相似。由于机化灶透明度较差，需用50甘油水溶液作透明处理，即在肉粒上滴加数滴50%甘油水溶液，数分钟后，肉片变得透明，再覆盖上玻片压紧观察。,（4）钙化的旋毛虫。在包囊内可见数量不等、浓淡不均的黑色钙化物，包囊周围有大量结缔组织增生。由于钙化的不同发展过程，有时可能看到下列变化：包囊内有不透明黑色钙盐颗粒沉着；钙盐在包囊腔两端沉着，逐渐向包囊中间扩展；钙盐沉积于整个包囊腔，并波及虫体，尚可见到模糊不清的虫体或
45、虫体全部被钙盐沉着。此外，在镜检中有时也能见到由虫体开始钙化逐渐扩展到包囊的钙化过程（多数是由于虫体死亡后而引起的钙化）。发现钙化旋毛虫时，可以通过脱钙处理，滴加10%稀盐酸将钙盐溶解后，可见到虫体及其痕迹，与包囊毗邻的肌纤维变性，横纹消失。,（5）鉴别诊断。在旋毛虫检验时，往往会发现住肉孢子虫和发育不完全的囊尾蚴，虫体典型者，容易辨认，如发生钙化，死亡或溶解现象时，则容易混淆。,（二）旋毛虫集样消化法 1实验原理。先用机械方法将受检肉样捣碎，使其呈颗粒或絮状，再用消化酶在最适温度和最佳酸碱度条件下进行生物化学消化。本实验采用快速集样消化法，即由磁棒转动带动杯中消化液旋转成旋窝，加速底物消化分
46、解，同时比水重的有形物质随旋窝的力量向中心移动，但未消化的巨型肌组织残质则被集虫器外周粗筛阻留，而虫体或虫体包囊等细小物体随旋窝向中心移动进入集虫器；当转动停止，集虫器中的有形物质便随旋窝作用逐渐沉降于底部细筛孔漏掉，只保留虫体和包囊在筛面上供镜检。,2实验方法、步骤和操作要领。 （1）采样。首先确定群检分组的头数，每组头数的大小可根据各地区旋毛虫病的发生情况而定，即在旋毛虫病的低发病地区采取5-10头猪为1组，而常年未检出旋毛虫的地区每组可增加到30-50头或100头。既能因地提高检验工效，又不致使旋毛虫检验流于形式。如果以10头猪为1组，其分组情况应按生产流水线上胴体编号1-10、11-2
47、0、21-30顺序。每头猪取横膈膜肌脚2g，每组10头样肉，共20g，依次放在序号相同的采样盘或塑料袋内送检。,（2）捣碎。按采样盘顺序，每次取1组（20g），置捣碎机容器中，加入0.04%胃蛋白酶溶液100ml（按每10g样肉加50ml酶溶液的比例），徐徐启动捣碎机，转速由8000rpm逐渐到16000rpm。捣碎约30s至肉样成颗粒或絮状，并混悬于混浊的消化液中。,（3）加热、消化、集虫。取下容器将捣碎液倒入500ml烧杯中，加入2%的热盐酸溶液100ml（与酶溶液等量），使温度保待在45左右。然后将集虫器从液面上小心压入杯中，加人磁棒，将烧杯放在加热磁力搅拌器上，启动转速节柄，消化液被搅成一旋窝。在45左右搅拌3-5min后，回转调节柄，停止搅拌，待磁棒静止后取出磁棒。取出集虫器，卸下集虫筛，用适量清水将筛面物充分洗入表面皿中。,（4）镜检。将表面皿移于镜检台的圆孔上，旋转圆盘使表面皿中心底部接物镜头下，将表面皿前后、左右晃动数次，使有形成分集中于皿底中心，用40倍物镜检查有无旋毛虫虫体、包囊以及虫体碎片或空包囊。,（5）查病畜胴体。镜检发现阳性时，按圆盘转数（0、1、2、3顺序）乘以100（每组头数圆盘孔数）加孔号乘以10（每组头数），即得出该组10头猪的胴体编号。计算公式：圆盘转数100+孔号