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1、14.发酵液的预处理和固液分离,影响发酵液后处理的主要因素 粘度,杂蛋白 影响树脂对产物的吸附能力； 在萃取操作中，易产生乳化，不利 于两相的分离； 污染滤膜，降低滤速 高价无机离子 当采用离子交换法提取产物时，影响树脂对生化物质的交换容量,14.1发酵液的预处理,降低发酵液粘度 去除杂蛋白,14.1.1 凝聚和絮凝技术 这两项技术能有效地改变细胞、菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态、使之聚集，增大体积，利于过滤，常用于菌体细小且粘度大的发酵液预处理中。,凝 聚,定义： 在中性盐作用下，由于双电层排斥电位的降低，而使胶体体系不稳定的现象，称凝聚。 s d 电位：可测,电位： 电位与扩散层厚度和电
2、动电荷密度q成正比。扩散成厚度又与溶液的离子强度I有关。高价阳离子的存在，可压缩扩散层厚度，使电位迅速降低。,常用凝聚剂高价阳离子 凝聚能力的次序为： Al3+Fe3+H+Ca2+Mg2+K+Na+Li+ 常用电解质： Al2(SO4)318H2O、AlCl36H2O、FeCl3、ZnSO4、MgSO4,絮 凝,定义： 是指在某些高分子絮凝剂存在下，基于架桥作用，使细胞聚集形成粗大的絮凝团的过程。,常用絮凝剂： 人工高分子聚合物：聚丙烯酰胺、聚苯乙烯，聚乙稀亚胺的衍生物 无机高分子聚合物：聚合铝盐、聚合铁盐 天然有机高分子絮凝剂：壳聚糖、葡聚糖、明胶、骨胶 微生物絮凝剂：糖蛋白，粘多糖，纤维素
3、，核酸,聚丙烯酰胺絮凝剂,影响絮凝的因素,絮凝剂的加量 絮凝剂的分子量 溶液的pH 搅拌速度 搅拌时间,14.1.2 杂蛋白的其他去除方法 变性沉淀 热变性：适于热稳定物质 大幅度调整pH：根据产物特性反向调节， 加有机溶剂 等电点沉淀,化合法沉淀 在酸性溶液中，蛋白质与阴离子形成沉淀，如：三氯乙酸，水杨酸盐，钨酸盐，苦味酸盐，鞣酸盐，过氯酸盐等 在碱性溶液中，与阳离子形成沉淀，如：Ag+，Cu2+，Zn2+，Fe3+，Pb2+等,14.1.3 高价无机离子的去除,Ga2+：加入草酸和草酸盐，生成草酸钙；加入磷酸盐，生成磷酸钙 Mg2+：加入草酸；加入磷酸盐，生成磷酸镁；三聚磷酸钠（Na5P3
4、O10），生成可溶性络合物 Fe3+：加入黄血盐，生成普鲁士兰沉淀,14.2 发酵液的固液分离,14.2.1 影响固液分离的因素 14.2.2 过滤 定义： 在一定的压力差下，利用多孔性介质截留固液悬浮液中的固体粒子，进行固液分离的方法称为过滤。,过滤介质,无定形颗粒：无烟煤、砂、颗粒活性炭、铁矿砂等 成形颗粒：烧结金属、烧结塑料以及用合成树脂粘结的硅砂、塑料颗粒等，做成圆筒形或板状。 非金属织补棉：化学纤维、玻璃纤维织品、长纤维滤布、短纤维滤布。 金属织布：不锈钢丝或铁丝等的织布。 无纺品：纸、毡、石棉板、合成纤维无纺布等。,过滤设备选择的依据,被过滤液体的特性 固形物含量1-10是采用连续
5、式过滤机的极限。 生产规模：大规模连续式 小规模间歇式 操作条件 操作要求 过滤机的材料：食品和药品工业聚丙烯或聚酯,过滤设备,板框过滤机 优点： 结构简单、装配紧凑、过滤面积大、允许采用较大的操作压力，辅助设备少，动力消耗小，过滤和洗涤质量好，对固形物含量要求低，材料选择范围广。 缺点： 设备笨重、占地面积多、辅助时间长生产效率低。,板框过滤机,真空转鼓过滤机 优点： 真空转鼓过滤机具有自动化程度高、操作连续、处理量大。特别适合固体含量大（10）的悬浮液的分离，在发酵工业中广泛用于霉菌、放线菌和酵母发酵液或细胞悬浮液的过滤分离。 缺点： 由于受真空度的限制，不适于菌体较小和粘度较大的细菌发酵
6、液的过滤，且过滤所得固相的干度不如加压过滤。,真空转鼓过滤机,14.2.3 离 心,定义： 借助离心机旋转所产生的离心力的作用，促使不同大小，不同密度的粒子分离的技术。,离心力（单位质量）,分离因数,粒子的重力沉降速度 Stokes 定律： 粒子的离心沉降速度,离心分离方法,差速离心工业上最常用的离心分离方法,区带离心多用于生化研究 事先在离心管中用某种低分子溶质调配好密度梯度，在密度梯度之上加待处理的料液后进行离心。 常用密度梯度物质： 蔗糖、CsCl、NaBr,实验室常用的转子,碟片式离心机 是传统离心机，为目前工业上应用最广泛的离心机。分离因数可达1000-20000，最大处理量达到30
7、0m3/h，常用于大规模的分离过程。 适用范围 细菌、酵母菌、放线菌、细胞碎片,离心分离设备,管式离心机 管式离心机是一种分离效率很高的离心分离设备，其转鼓细长，可在15000-50000的高转速下工作，分离因数可达104-6105。它设备简单、操作稳定。 适用范围 细胞、细胞碎片、细胞器、病毒、蛋白质、核酸等。特别适合一般分离机难以分离的固形物含量1% 发酵液的分离。,倾析式分离机 是一种靠离心力和螺旋的推动力作用自动连续排渣的离心机。具操作连续、适应性强、结构紧凑和维修方便的优点。分离因数为1500-3000。 适用范围 特别适合固形物含量较多的悬浮液的分离。,14.3 全发酵液提取,全发
8、酵液的提取:从悬浮液中直接提取生化物质 膜技术 双水相萃取 扩张床(膨胀床):expended bed adsorption,膨胀床操作过程,全发酵液萃取装置,思考题:,1.为什么要进行发酵液预处理？ 2.絮凝和凝聚的定义和区别。常用的絮凝剂 3.发酵液分离的主要方法. 4.分离和过滤的主要设备有哪些?,5,滤饼的比阻： 8.23X1014cm/g,15 细胞破碎,定义: 细胞破碎就是采用一定的方法，在一定程度上破坏细胞壁和细胞膜，设法使胞内产物最大程度地释放到液相中，破碎后的细胞浆液经固液分离除去细胞碎片后，再采用不同的分离手段进一步纯化.,15.1细胞壁的组成和结构,微生物细胞壁的化学组成
9、和结构 细菌，肽聚糖的网状结构 酵母菌：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白质 真菌：细胞壁更厚 植物细胞壁的化学组成和结构 初生壁，次生壁 具有很高的机械强度,15.2 细胞破碎技术,机械法和非机械法 15.2.1机械法 机械法主要是利用高压、研磨或超声波等手段在细胞壁上产生的剪切力达到破碎目的. 包括高压匀浆法,珠磨法和超声破碎法,高压匀浆器 影响匀浆破碎的主要因素是压力、温度和通过匀浆器阀的次数。 高压匀浆法的适用范围较广，在微生物细胞和植物细胞的大规模处理中常采用.,高速珠磨机(high spced bead mill) 研磨是常用的一种方法，它将细胞悬浮液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝等研磨剂一起快速
10、搅拌，使细胞获得破碎。 在工业规模的破碎中常采用高速珠磨机,超声波破碎器 超声波处理细胞悬浮液时，破碎作用受许多因素的影响，通常声强和振幅影响很大，但强度太高易使蛋白质变性，频率的变化影响不明显：此外介质的离子强度、pH值、菌体的种类和浓度也有很大的影响. 超声波振荡过程中遇到的最大问题就是产生的热量不容易驱散，所以影响了它在大规模工业上的应用，但在实验室和小规模生产中是一种很好的方法,15.2.2 非机械法 非机械方法很多，包括酶解、渗透压冲击、冻结和融化、干燥法和化学法溶胞等. 1)酶解法 是利用酶反应，分解破坏细胞壁上特殊的键，从而达到破碎目的。酶解法可以在细胞悬浮液中加入特定的酶，也可
11、以采用自溶作用。 酶解法的优点是发生酶解的条件温和、能选择性地释放产物、胞内核酸等泄出量少、细胞外形较完整、便于后步分离等；但酶水解价格高，故小规模应用较广.,渗透压冲击法 冻融法 干燥法 化学法:采用化学法处理可以溶解细胞或抽提胞内组分。常用酸、碱、表面活性剂和有机溶剂等化学试剂。,15.2.3 选择破碎方法的依据 (1)细胞的处理量 (2)细胞壁的强度和结构 (3)目标产物对破碎条件的敏感性 (4) 破碎程度 适宜的操作条件应从高的产物释放率，低的能耗和便于后步提取这二方面进行权衡,15.2.4 破碎技术研究的方向 (1)多种破碎法的结合 (2)与上游技术结合 (3)与下游操作技术结合,15.3 破碎率的测定,破碎率R:细胞破碎的程度.,常用的方法是测定目的产物的释放量: 释放的蛋白的量或酶的量.,15.4 基因工程包涵体的纯化方法,包涵体的洗涤和目标蛋白的变性溶解 目标蛋白的复性,思考题,1.细胞破碎的目的 2.举出几种细胞破碎常用的方法 3.,