《第八章 微生物遗传.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《第八章 微生物遗传.ppt（86页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、第八章 微生物遗传,教学内容,1.掌握遗传变异的物质基础,2.掌握基因突变和诱变育种,3.了解原核生物和真菌的基因重组,4.了解基因工程原理,5.了解菌种的保藏与复壮,遗传（Heredity or Inheritance）与变异（Variation）是生物界最本质的属性之一。,遗传是指亲代生物将自身的一整套遗传因子（基因，Gene）传递给子代的行为或功能，它具有极其稳定的特性。,变异是指生物体在外因或内因的作用下，由于遗传物质结构或数量的改变（即基因型的改变），而引起某些相应的表型性状发生变化。变异所形成的新性状是稳定的、可遗传的。,（1）基因型（Genotype）或遗传型：,是指生物体所含有
2、的全部基因的总合。,基因型只是一种内在的可能性或潜力，只有在适当的环境条件下，通过自身的代谢和发育，才能使其具体化，转变为表型。,（2）表型（Phenotype）：,是指生物体所具有的一切外表特征和内在特性的总和，是基因型在适当环境条件下的具体体现。,表型与遗传型不同，是一种现实性。,修饰是非遗传的。如粘质沙雷氏菌: 25培养,产深红色的灵杆菌素，菌落染成鲜血状（宗教神显灵）； 37培养，此菌群体中的一切个体都不产色素； 重新降温到25，所有个体恢复产色素能力。,由于微生物所具有的独特的生物学特性，使之成为了现代遗传学和其他许多生物学基本理论研究的最理想材料，不仅促进了现代分子生物学和生物工程
3、学的发展，而且也为育种工作提供了丰富理论基础。,（3）修饰（Modification）或饰变：,指不涉及遗传物质结构的改变，而只发生在转录、转译水平上的表型变化。,第一节 遗传变异的物质基础,一.证明遗传物质基础的三个经典实验,二.遗传物质在胞内的存在部位及方式,一.证明核酸是遗传物质基础的三个经典实验,1.细菌的转化（Transformation）实验,1928年，F.Griffith首先发现细菌的转化现象。肺炎链球菌是一种成双或成链排列的球菌，可使人患肺炎，也可使小鼠患败血症而死亡。肺炎链球菌有两种菌株，1种称为S型(Smooth)，菌落光滑、可形成荚膜、具有致病性；另1种R型(Rough
4、)，菌落粗糙、不形成荚膜、无致病性。Griffith做了几组实验：,（1）动物试验,（2）细菌培养试验,（3）S型菌的无细胞提取液试验,（1）动物试验,小鼠(活),加活S菌,加活R菌或死S菌,加活R菌和热死S菌,小鼠(活),小鼠(死),小鼠(死),活的S菌,抽心血分离,（2）细菌培养试验,热死S菌,培养皿培养,不生长,活R菌,培养皿培养,长出R菌,热死S菌,+,活R菌,培养皿培养,长出大量R菌和10-6S菌,（3）S型菌的无细胞提取液试验,活R菌,S菌无细胞抽提液,+,培养皿培养,长出大量R菌和少量S菌,实验说明：加热杀死的S型细菌，在其细胞内可能存在一种转化物质，它能通过某种方式进入R型细胞
5、，并使R形细胞获得表达S型荚膜性状的遗传特性。,O.T.Avery,1944年，O.T.Avery等利用单细胞成分进一步证明了转化因子是DNA。,活R菌,加S菌的DNA,加S菌的DNA及DNA酶以外的酶,加S菌的DNA及DNA酶,加S菌的RNA,加S菌的蛋白质,加S菌的荚膜多糖,活S菌,活R菌,由这些结果可知，只有S型细菌DNA才能将肺炎链球菌由R型转化成S型；并且DNA的纯度越高，转化效率也越高，当所用的DNA量低于610-8g时，仍具有感染力，这说明，由S型菌株转移给R型的只有DNA。,2.噬菌体感染试验,1952年，Hershey和Chase利用同位素标记试验证明DNA是噬菌体的遗传物质
6、基础，在其DNA中，含有包括合成蛋白质外壳在内的整套遗传信息。,3.植物病毒的重建实验,1956年，Fraenkel-Conrat利用烟草花叶病毒（TMV）和霍氏车前花叶病毒（HRV）进行了植物病毒的重建实验。TMV与HRV亲缘关系相近。 结果证实：RNA病毒中，遗传的物质基础是RNA。,二.遗传物质在胞内的存在部位及方式,1.七个水平,细胞水平,细胞核水平,染色体水平,核酸水平,基因水平,密码子水平,核苷酸水平,(1)细胞水平,在微生物细胞中，其大部或几乎全部的DNA都集中于细胞核。,(2)细胞核水平,真核生物与原核生物的细胞核存在明显的差别。,除细胞核外，有的微生物细胞质内还存在一些能自主
7、复制的核外染色体质粒(Plasmid)。,不同细胞或同种微生物的不同细胞中，核的数目不同： 酿酒酵母、黑曲霉、产黄青霉是单核； 粗糙脉孢菌、米曲霉是多核； 放线菌的菌丝细胞是多核，而孢子则是单核； 细菌中，杆菌细胞大多存在两个核区，而球菌一般仅一个。,(3)染色体水平,染色体数：真核生物的染色体数目较多，如酵母菌属为17，脉孢菌属为7；而原核生物只有一个裸露的、在光学显微镜下无法看到的环状染色体。,染色体倍数：即同一细胞中相同染色体的套数。多数微生物是单倍体，少数真核微生物（酿酒酵母）的营养细胞及合子是双倍体，高等动植物的体细胞是双倍体。,核酸种类： 绝大多数生物的遗传物质是DNA，只有部分病
8、毒为RNA。,(4)核酸水平,核酸结构：绝大多数微生物的DNA是双链的，少数病毒，如E.coli的X174和fd噬菌体的核酸为单链结构。,DNA长度：即基因组大小。真核生物的DNA要比原核生物长得多，基因数量也较多。 如啤酒酵母DNA的长度约6.5mm，大肠杆菌为1.11.4mm；大肠杆菌含有7500个基因，T2-噬菌体约有360个基因，而最小的RNA噬菌体MS2只有3个。,DNA状态：在原核生物中DNA都是环状；在病毒粒子中有的呈环状，有的呈线状；细菌质粒的DNA是超螺旋结构的。,(5)基因水平,在生物体内，一切具有自主复制能力的遗传功能单位，都可称为基因。基因的物质基础是一个具有特定核苷酸
9、顺序的核酸片段，由众多基因构成了染色体。每个基因大体在1000-1500bp，分子量约为6.7105Dal。,(6)密码子水平,遗传密码是指DNA链上决定各具体氨基酸的特定核苷酸排列顺序。遗传密码的信息单位是密码子。,每个密码子（coden）由三个核苷酸序列即1个三联体所组成，它是负载遗传信息的基本单位。密码子一般都用mRNA上3个连续核苷酸序列来表示。因为4个核苷酸按三联体的方式排列可有64种组合，有同一氨基酸由几个密码子编码的情况。,基因水平是遗传的功能单位，密码子水平是信息单位，而核苷酸水平（即碱基水平）则可认为是一个最低突变单位或交换单位。,在绝大多数生物的DNA中，都只含腺苷酸(AM
10、P)、胸苷酸(TMP)、鸟苷酸(GMP)和胞苷酸(CMP) 4种脱氧核苷酸，但也有少数例外，如E.coli的T偶数噬菌体的DNA上就含有少量的稀有碱基5-羟甲基胞嘧啶。,(7)核苷酸水平,2.原核生物的质粒（Plasmid）,一种独立于微生物染色体外，能进行自主复制的细胞质遗传因子，只控制微生物的次要性状。,（1）质粒的构型,质粒一般以共价闭合环状(covalently closed circle，简称CCC)的超螺旋双链DNA分子存在于细胞中。,近年来在疏螺旋体、链霉菌和酵母菌中发现了线型双链DNA质粒和RNA质粒。,（2）质粒的大小,质粒 DNA,染色体 DNA,质粒分子的大小范围从1kb
11、左右到1000kb，细菌质粒多在10kb以内。每个质粒含有几个到数百个基因。每一个细胞可含有1几百个质粒。,（3）质粒的特性,a.是细菌非必须的遗传物质。,b.具有不相容性。,c.具有可转移性。某些质粒能以较高的频率（10-6）通过细胞间的接合作用或其他机制从供体细胞转移到受体细胞中。,d.可整合性。,e.可重组性。,f.可消除性。在高温或某些化学药物（丝裂霉素C、紫外线、利福平、重金属离子）的处理下，质粒可以被消除，同时宿主细胞也将失去质粒控制的表型性状。,g.耐碱性。与染色体的DNA比较，质粒DNA具有较强的耐碱性。,（4）质粒的类型,质粒按功能和赋予宿主的表型效应,接合质粒(Fertil
12、ity factor，F因子),抗性质粒(Resistance factor，R因子),细菌素质粒(Bacteriocin plasmid),毒性质粒(Virulence plasmid),代谢质粒(Metabolic plasmid),典型质粒：,F质粒：F因子、致育因子或性因子，是大肠杆菌等细菌决定性别并有转移能力的质粒。,R质粒：R因子。1957年，日本出现经抗生素治愈的痢疾病人中，可分离到同时对许多抗生素或化学治疗剂如链霉素、氯霉素、四环素或磺胺等呈抗药性的痢疾志贺氏菌。且这种抗药基因可传递。,Col质粒：大肠杆菌素质粒或产大肠杆菌素因子。,细菌素：许多细菌都能产生抑制或杀死其它近缘细
13、菌或同种不同菌株的代谢产物，因为它是由质粒编码的蛋白质，且不像抗生素具有很广的杀菌谱，所以称细菌素。,大肠杆菌素是一类由大肠杆菌某些菌株所产生的细菌素，具有专一地杀死其它种肠道菌或同种其它菌株的能力。大肠杆菌素由Col质粒编码。,Ti质粒：即诱癌质粒或冠瘿质粒。,降解性质粒：只在假单胞菌中发现。可为降解一系列复杂有机物的酶编码，用于污水处理、环境保护等方面。并可通过遗传工程手段构建具有数种降解质粒的菌株称“超级菌”。,根癌土壤杆菌或根癌农杆菌从一些双子叶植物的受伤根部侵入根部细胞后，在其中溶解并释放出Ti质粒，其上的TDNA片段会与植物细胞的核基因组整合，合成正常植株所没有的冠瘿碱类，破坏控制
14、细胞分裂的激素调节系统，从而使它转为癌细胞。,因TDNA片段可携带任何外源基因整合到植物基因组中，所以是当前植物基因工程中使用最广、效果最佳的克隆载体。,第二节 基因突变和诱变育种,一.基因突变,二.突变与育种,一.基因突变,基因突变(Gene mutation) 是指生物体内遗传物质的分子结构突然发生可遗传的变化。,根据突变的原因又可将其分为自发突变(Spontaneous mutation)和诱发突变(Induced mutation)两种类型。,1.突变的类型,突变株的表型,选择性突变株,非选择性突变株,营养缺陷型,抗性突变型,条件致死突变型,形态突变型,抗原突变型,产量突变型,按突变后
15、突变株能否在选择性培养基上被迅速筛选出划分为选择性突变株（Selective mutant）和非选择性突变株（Non-selective mutant）。,(1)营养缺陷型(Auxotroph),是指某一野生型菌株因发生基因突变而丧失合成一种或几种生长因子的能力，因而无法在基本培养基上正常生长繁殖的变异类型。,(2)抗性突变型(Resisant mutant),是指野生型菌株因发生基因突变，而产生的对某种化学药物或致死物理因子的抗性变异类型。,可在加有相应药物或用相应物理因子处理的培养基平板上选出，如抗药性菌株等。,可在加有相应营养物质的基本培养基平板上选出。,(3)条件致死突变型(Condi
16、tional lethal mutant),是指菌株或病毒经基因突变后，在某种条件下可正常生长繁殖并呈现其固有的表型，而在另一条件下却无法生长繁殖的突变类型。,Ts突变株即温度敏感突变株，如大肠杆菌的某些菌株在37可正常生长，不能在42下生长。原因是突变使某些重要蛋白质的结构功能改变，以致出现37可生长而42下不能生长的特点。,(4)形态突变型(Morphological mutant),是指由于基因突变而使个体或菌落形态发生的变异类型。,如细菌荚膜鞭毛的有无、霉菌或放线菌孢子着色的变化，菌落表面的粗糙或光滑等。,(6)产量突变型,是指由于基因突变而引起细胞抗原结构发生变异的类型。,是指通过基
17、因突变而产生的在代谢产物产量上明显有别于原始菌株的突变类型。若产量高于原始菌株者称正变株，反之为负变株。,如细胞壁缺陷变异（L型细菌等），荚膜或鞭毛成分的变异等。,(5)抗原突变型(Antigenic mutant),在生产实践上筛选高产正变株十分重要。,2.突变率(Mutation rate),每一个细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率，称为突变率。,一般突变是独立发生的，某一基因的突变不会影响其他基因的突变率。同一细胞中同时发生两个基因突变的几率是极低的。,3.基因突变的特点,由于遗传的物质基础相同，微生物在遗传变异的特点上与其他生物一样遵循同样的规律。比如细菌的耐药性可借三种方式产生：
18、即基因突变、质粒转移和生理适应。,如每次分裂中，青霉素抗性的突变率为10-8，链霉素抗性的突变率为10-6，则在同一细胞中两种突变同时发生的几率为10-14。临床上据此可联合用药提高疗效。,（1）不对应性：突变性状与引起突变的原因间无直接的对应关系。,（2）自发性：各种性状的突变，可在没有人为的诱变因素处理下自发地产生。,（3）稀有性：自发突变的频率极低，一般10-610-9。,（4）独立性：在某一群体中，突变是随机的，独立发生的，任何性状都可发生基因突变，并且该基因的突变不会影响其他基因的突变率。,（5）可诱变性：利用诱变剂处理，可以提高突变率10105倍。,（6）稳定性：由于突变造成遗传物
19、质在结构上发生稳定的变化，所产生的新的变异性状也是稳定的、可遗传的。,（7）可逆性：任何性状既可发生正向突变，也可发生回复突变。,4.基因突变的自发性和不对应性的实验证据,又称波动试验或彷徨试验，是1943年Luria和Delbruck根据统计学原理设计的实验(获1969年诺贝尔生理学奖):,(1)变量实验（Fluctuation test）,Salvador Luria,Max Delbruck,结果说明：E.coli抗噬菌体性状的突变，不是由噬菌体诱导出来的，而是在它接触噬菌体前，在细胞分裂过程中随机地自发产生的。而且自发突变发生得越早，抗性菌落数就越多，反之则越少。噬菌体在这里仅起着淘汰
20、原始的未突变的敏感菌和甄别抗噬菌体突变型的作用。利用这一方法还可计算出突变率。,(2)涂布试验（Newcombe experiment）,1949年，Newcombe设计了一种与变量试验相似，但方法更为简便的涂布试验。采用固体平板培养法。,结果：在涂布过的一组中，共长出抗性菌落353个，比未经涂布过的（仅28个菌落）高得多。证实抗性突变发生在未接触噬菌体之前。,(3)平板影印培养试验（Replica plating）,1952年，J. Lederberg夫妇设计了一种平板影印培养法，可更好地证明微生物的抗药性是在未接触药物前自发产生的，这一突变与相应的药物环境毫不相干。平板影印培养法实质上是一
21、种通过盖印章的方式，达到在一系列平板的相同位置上重现相同遗传型菌落的接种培养法。,Joshua Lederberg,结果证实：原始的链霉素敏感菌株在根本未接触链霉素的情况下，也可产生大量抗链霉素的突变株。,5.基因突变的机制,基因突变的原因多种多样，包括自发突变和诱发突变，诱变又可分为点突变和畸变。突变的类型概括如下：,（1）诱变的机制,凡能提高突变率的任何理化因子，都称为诱变剂。诱变的类型多样，常见：,碱基置换,移码突变,染色体畸变,碱基置换（Substituttion）,碱基置换是指一对碱基被另一对碱基所取代。,置换又可分为两类：,a.转换（transition）：AG，TC,b.颠换（t
22、ransversion）： AT，AC；GC，GT,亚硝基胍、硫酸二乙酯等可与碱基发生化学反应而直接引起转换（少数是颠换）。5BU（5-溴尿嘧啶）等是一些碱基的类似物，可通过活细胞的代谢活动掺入到DNA分子中而间接引起置换。,移码突变（frame-shift or Phase-shift mutation）,是指诱变剂使DNA分子增添或缺失一个或少数几个核苷酸，从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的一类突变。,包括缺失（ABCABABC）和添加（ABCABCABC）。,由移码突变所产生的突变株，称为移码突变株（frame shift mutant）。,移码突变与碱基置换都属点突变。
23、吖啶类染料，包括原黄素、吖啶黄、吖啶橙和-氨基吖啶等都是移码突变的有效诱变剂。,染色体畸变（chromosomal aberration）,某些强烈理化因子如X射线、烷化剂、亚硝酸等除能引起点突变外，还能引起DNA大损伤染色体畸变。,染色体畸变,缺失（deletion）:abc ghijkl,重复（duplication）:abcabc def,插入（insertion）:abcpqr def,易位（转座，translocation）:abcpqr ghi,倒位（inversion）:abcfed ghi,（2）自发突变机制,自发突变是指在没有人工参与下，生物体自然发生的突变。,自发突变是由于
24、一些原因不详的低剂量诱变因素的长期作用而造成的综合诱变效应。其可能机制如下：,自发突变机制,背景辐射和环境因素的诱变,微生物自身有害代谢产物的诱变效应,互变异构效应,环出效应,背景辐射和环境因素的诱变,宇宙空间的各种短波辐射或高温，以及自然界普遍存在的一些低浓度诱变物质（在微环境中有时也可能是高浓度），可引起自发突变。,微生物自身有害代谢产物的诱变效应,过氧化氢是许多微生物的代谢产物，这种物质具有强氧化性，对脉胞菌（Neurospora）等微生物有诱变作用，这种作用可因同时加入过氧化氢酶而降低；但如果加入酶的同时又加入酶抑制剂KCN，则又可提高突变率。这说明过氧化氢可能是“自发突变”中的一种内
25、源性诱变剂。,互变异构效应,有的诱变剂（如5-BU等）可引起碱基分子发生酮式至烯醇式的互变异构，由于识别错误，可导致突变。,在DNA的复制过程中，如果其中一条单链偶然形成一个小环，环上的基因就可能越过复制而发生遗传缺失，从而造成自发突变。下图即为环出效应的设想机制。,环出效应,在上链中，因标记B处发生“环出”，故只有A及C能进行复制，从而发生自发突变。而在下链中，复制仍正常进行。,6.紫外线对DNA的损伤及其修复,紫外线作用于微生物核酸后，嘧啶对UV的敏感性比嘌呤强，形成嘧啶二聚体及其水合物，造成局部DNA分子无法配对，从而引起微生物死亡或突变。,但微生物可以多种方式修复损伤的DNA，现主要介
26、绍以下两种。,光复活作用,暗修复作用,（1）光复活作用,经紫外线照射后的微生物立即暴露于可见光下时，可明显降低死亡率，这种现象称为光复活作用。,1949年，A.Kelner在灰色链霉菌中首先发现发现了这一现象，以后，在E.coli等许多微生物中都被证实。,对照：,试验：,8106个ml E.coli,8106个ml E.coli,100个ml E.coli,2106个ml E.coli,UV,UV,360490nm,可见光，30分,形成胸腺嘧啶二聚体的DNA分子，在黑暗下会被光激活酶结合，这种复合物暴露在可见光（300500nm）下时，此酶因获得光能而发生解离，并使二聚体重新分解成单体。,鉴于
27、在微生物中普遍存在光复活作用，因此，在进行紫外线诱变育种时，只能在红光下进行照射和处理照射后的菌液，且在黑暗条件下培养。,(2)暗修复作用：切除修复,与光复活作用不同，这种修复作用与光无关。,是一种不依赖可见光，只通过酶切作用去除嘧啶二聚体，随后重新合成一段正常DNA链的核酸修复方式。,二.突变与育种,1.自发突变与育种,在日常生产中，微生物会以一定频率（10-6）发生自发突变。利用自发突变可以选育优良的生产菌种。,(1)从生产中选育,(2)定向培育优良品种,定向培育是指用某一特定因素长期处理某一微生物的群体，同时不断地移种传代，以达到累积并选择相应的自发突变株的目的。,它是一种古老的育种方法
28、。如卡介苗是法国A.Calmette和C.Guerin把牛结核分枝杆菌接种在含牛胆汁和甘油的马铃薯培养基上，连续移种230多代（13年），直至1923年才获成功。,2.诱变育种,诱变育种是指利用物理或化学诱变剂处理均匀而分散的微生物细胞群，促使其突变率显著提高，然后采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选少数符合育种目的的突变株，以供科学实验或生产实践使用。,诱变育种具有极其重要的实践意义，是目前广泛使用的一种育种手段。当前发酵工业和其他微生物生产部门所使用的高产菌株，几乎都是通过诱变育种来提高生产性能的。,优点：可提高代谢产物产量，还可改进产品质量、扩大品种和简化生产工艺。方法简便易行、工作
29、进度快和收效显著。,最突出的例子是青霉素生产菌株的选育成功： 1943年，NRRL1951菌株发酵量为100U/mL。 目前，NRRL-Q1765进一步变异株发酵量为50000-100000U/mL。,(1)诱变育种的基本环节,出发 菌株,多数个体死亡,少数存活,诱变,多数未变,少数突变,多数负变,少数正变,多数 幅度小,少数 幅度大,多数不宜投产,少数适宜投产,存活率,突变率,正变率,高产率,投产率,计算：,(2)诱变育种的几个原则,选择简便有效的诱变剂,挑选优良的出发菌株,处理单孢子(或单细胞)悬液,选用适宜的诱变剂量,充分利用复合处理的协同效应,利用和创造形态、生理与产量间的相关指标,设
30、计或采用高效筛选方案或方法,3.营养缺陷型突变株的筛选,（1）筛选营养缺陷型突变株常用的三种培养基,基本培养基（MM，minimal medium）：是指只能满足某微生物野生型菌株生长需要的最低成分的组合培养基。,不同微生物由于营养要求不同，其基本培养基不相同的，有的极其复杂，如乳酸菌、酵母菌或梭菌等的基本培养基，有的极其简单，如E.coli的基本培养基。基本培养基可用“-”来表示。,完全培养基（CM，complete medium）：指凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或半组合培养基。,完全培养基可用 “+”来表示。一般可在基本培养基中加入一些富含氨基酸、维生素和碱基之类的天然物质（如
31、蛋白胨或酵母膏等）配制而成。,补充培养基（SM，supplemental medium）：是指只能满足相应的营养缺陷型菌株生长需要的组合培养基。,补充培养基是由基本培养基再添加营养缺陷型菌株所不能合成的代谢物所构成，可根据加入的营养物是A或B而分别用A或B来表示。,（2）与营养缺陷型突变有关的三类遗传型个体,野生型（Wild type）：是指从自然界分离到的任何微生物在其发生营养缺陷突变前的原始菌株。,可在其相应的基本培养基上生长。如果以A和B两个基因来表示其对这两种营养物的合成能力，则野生型菌株的遗传型应是A+B+。,营养缺陷型（auxotroph）：野生型菌株经诱变处理后，由于发生了丧失合
32、成某种营养物能力的突变，因而只能在加有该营养物的培养基中才能生长。,不能在基本培养基上生长，只能在完全培养基或相应的补充培养基上生长。A、B营养缺陷型的遗传型分别用A-B+或A+B-表示。,原养型（Prototroph）：一般指营养缺陷型突变株经回复突变或重组后产生的菌株。,其营养要求在表型上与野生型相同，原养型的遗传型为A+B+。,（3）营养缺陷型的筛选方法,诱变剂处理,淘汰野生型,检出缺陷型,鉴定缺陷型,抗生素法,菌丝过滤法,青霉素法,制霉菌素法,细菌,真菌,真菌,放线菌,夹层培养法,限量补充培养法,逐个检出法,影印平板法,生长谱法,第三节 基因重组,两个不同性状个体内的遗传物质进行交换，
33、经过基因的重新组合，形成新遗传型个体的过程，称为基因重组（Gene recombination）或遗传重组。,重组可使生物体在未发生突变的情况下，也能产生新遗传型的个体。,一.原核生物的基因重组,二.真核生物的基因重组,一.原核生物的基因重组,转化,转导,接合,原生质体融合,在原核微生物中，基因重组由以下几种方式：,1.转化（Transformation）,受体菌（Receptor）吸收来自供体菌(Donor cell)的DNA片段后，通过交换将其整合到自身的基因组中，再经复制就获得了来自供体的遗传信息。,受体菌接受供体菌的DNA片段而获得部分新的遗传性状的现象，称为转化或转化作用。通过转化方
34、式形成的杂种后代称为转化子（transformant）。,转化非常普遍，原核生物如肺炎链球菌、嗜血杆菌属、芽孢杆菌属、葡萄球菌属、根瘤菌属、假单胞菌属、黄单胞菌属等。真菌如酿酒酵母、黑曲霉等。,转化过程大致可分为：,感受态阶段,DNA的结合与吸收,转化DNA的整合,（1）感受态阶段,感受态（Competence）是指受体细胞最易接受外源DNA片段，并实现其转化的一种生理状态。,两个菌株间能否发生转化，主要与微生物的亲缘关系有关，但是，即使在转化率极高的那些种中，不同的菌株间也不一定都发生转化。研究发现，能进行转化的受体细胞必须处于感受态。,感受态出现除与菌种有关外，还受环境因子的影响，如cAM
35、P（环腺苷酸）和Ca2+可提高细胞的感受态水平。,一般原核生物的核基因组是一条环状DNA长链，在自然或人为条件下均易断裂成碎片，故转化因子通常只是15kb左右长的片段，其上平均含有15个基因。最易与细胞表面结合的是dsDNA形式。供体菌的dsDNA片段与感受态细胞表面的膜连DNA结合蛋白相结合，其中一条链被水解，另一条进入细胞。,转化因子的本质是离体的DNA片段。,来自供体菌的ssDNA片段被细胞内的特异蛋白结合，并使其与感受态细胞染色体上的同源区段配对重组，形成一小段杂合DNA区段，随着染色体复制而复制，形成转化子（即含有杂合DNA的受体菌）。,（2）DNA的结合与吸收,（3）转化DNA的整
36、合,转染,将噬菌体或其他病毒的DNA(RNA)抽提出来，使其感染感受态，进而产生正常的噬菌体或病毒的后代，称为转染(Transfection)。,转染与转化不同之处是病毒或噬菌体并非遗传基因的供体菌，中间也不发生任何遗传因子的交换或整合，最后也不产生具有杂种性质的转化子。,2.转导（Transduction）,以完全缺陷或部分缺陷的噬菌体为媒介，将供体细胞的DNA小片段携带到受体细胞中，通过交换与整合，从而使后者获得前者部分遗传性状的现象，称为转导。获得新遗传性状的受体细胞，称为转导子（transductant）。,转导是由J.Lederberg等(1952)在鼠伤寒沙门氏菌中发现的。现在，许
37、多原核生物都发现有转导现象，如大肠杆菌、枯草杆菌、假单胞菌属、志贺氏菌属、葡萄球菌属、弧菌属和根瘤菌属等。转导现象在自然界中比较普遍，它在低等生物的进化过程中，很可能是一种产生新基因组合的重要方式。,目前已知的转导方式主要有以下几种 ：,普遍转导,局限转导,溶源转变,（1）普遍转导（Generalized transduction）,通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何DNA小片段的“误包”，而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象，称为普遍转导。,普遍转导又可分为两种类型：,完全普遍转导,流产普遍转导,噬菌体将供体菌的染色体DNA片段误包形成缺陷噬菌体，这种噬菌体再将其中的DNA导入受体菌，经过与受
38、体菌染色体组上的同源区段配对、双交换，而将供体菌DNA整合到受体菌的染色体组上，从而使后者成为一个遗传性状稳定的转导子的现象，称为完全转导或普遍转导。,完全普遍转导,流产普遍转导,经转导获得供体菌DNA片段的受体菌，如果外源DNA在其内既不进行交换、整合和复制，也不迅速消失，而仅进行转录、转译和性状表达，这种现象称为流产转导。,发生流产转导的细胞在分裂后，只能将外源DNA分配给一个子细胞，而另一子细胞可获得供体基因经转录、转译形成的少量产物酶，因此在表型上仍可出现轻微的供体菌特征，每经过一次分裂，就受到一次“稀释”。所以，能在选择性培养基平板上形成一个微小菌落（即其中只有一个细胞是转导子）就成
39、了流产转导子的特点。,（2）局限转导（Restricted transduction）,1954年在E.coli K12菌株中发现此现象。,是指通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中，并获得表达的转导现象。,根据转导子出现频率的高低可将其分成两类：低频转导和高频转导。,以低频转导为例说明：,温和噬菌体感染供体菌后，可使供体细胞溶源化，当该供体菌发生诱导裂解时，由于极少数（10-5）的前噬菌体发生不正常切离，其结果会将插入位点两侧之一的少数宿主基因（如E.coli 前噬菌体的两侧分别为gal基因和bio基因）连接到噬菌体DNA上，通过衣壳的“误包”，就形成了缺陷噬菌体（De
40、fective phage）。当这种缺陷噬菌体再次感染宿主细胞时，可整合到宿主的核基因组上，使宿主细胞成为一个局限转导子（即获得了供体菌的gal或bio基因），而不是一个溶源菌，因而对噬菌体不具有免疫性。,（3）溶源转变（Iysogenic conversion）,如白喉棒状杆菌（Corynebacterium diphtheriae）和肉毒梭菌（Clostridium botulinum）,当温和噬菌体感染宿主而使其发生溶源化时，因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上，而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象，称为溶源转变。,溶源转变与转导有着本质的区别：,温和噬菌体并不携带任何来自供体菌的外
41、源基因，使宿主带来新性状的正是噬菌体本身的基因；,温和噬菌体是完整的，而不是缺陷的；,获得新性状的是溶源化的宿主细胞，而不是转导子；,获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失。,在细菌和放线菌中普遍存在接合现象，尤以生活于动物肠道内的一些G细菌最为常见。在放线菌中，研究得最多的是链霉菌属（Streptomyces）和诺卡氏菌属（Nocardia）。此外，接合还可发生在不同属的一些种间，如E.coli和鼠伤寒沙门氏菌间或鼠伤寒沙门氏菌与痢疾志贺氏菌（Shigella dysenteriae）间。,3.接合（Conjugation）,供体菌通过其性菌毛与受体菌相接触，把F质粒或其携带的不同长度的核基因
42、组片段传递给后者，使后者获得供体菌的遗传性状的现象，称为接合。通过接合而获得新性状的受体细胞，称为接合子（conjugant）。,在细菌中，接合现象研究得最清楚的是E.coli。对接合行为的研究表明：E.coli是有性别分化的。决定其性别的是F质粒，凡有F因子的细胞，在其表面就有相应的性菌毛存在。,根据细胞中是否存在F因子及其存在方式的不同，可把E.coli分成四种相互联系的接合型菌株：,F+(雄性)菌株,F-(“雌性”)菌株,Hfr菌株,F菌株,（1）F+（雄性）菌株,细胞中存在游离的F因子，细胞表面还有与F因子数目相当的性菌毛。当F+菌株与F菌株接触时，前者可通过性菌毛将F因子转移到后者的
43、细胞内，使F菌株也转变成F+菌株。,（2）F-（“雌性”）菌株,在F-菌株中不含F因子，细胞表面也没有性菌毛。据统计，从自然界分离到的2000个E.coli菌株中，约有30的菌株是F-。,但它可通过与F+菌株或F菌株的接合而接受供体菌的F因子或F因子，从而使自己转变成“雄性”菌株。,（3）Hfr菌株（高频重组菌株，high frequency recombination）,因Hfr菌株与F-菌株接合后发生重组的频率要比F+与F-接合后的重组频率高出数百倍故名。 在Hfr细胞中，其F因子已从游离状态转变成在核染色体组特定位点上的整合状态(频率约10-5)。,在实际转移过程中，由于线状单链DNA太
44、长常会发生断裂。所以，越是处于Hfr染色体前端的基因，进入F-的几率就越高。由于F因子位于线状DNA末端，进入F-细胞的机会最少，故引起F-变成F+(性别转变)的可能性也最小。因此，Hfr与F-接合的结果其重组频率虽最高，但仍然为F-。,当Hfr与F-菌株发生接合时，Hfr的染色体双链中的一条单链在F因子处发生断裂，由环状变为线状，F因子则位于线状单链DNA的末端。,（4）F菌株,当Hfr菌株内的F因子因不正常切离而脱离核染色体组时，可重新形成游离的但携带一小段染色体基因的特殊F因子，称为F因子或F 质粒。,4.原生质体融合（Protoplast fusion）,通过人为方法，使遗传性状不同的
45、两个细胞的原生质体发生融合，并进而发生遗传重组,以产生同时带有双亲性状的、遗传性稳定的融合子（Fusant）的过程，称为原生质体融合。,能进行原生质体融合的细胞是极其广泛的，不仅包括原核生物中的细菌和放线菌，而且还包括各种真核生物的细胞。原核生物的原生质体融合研究是在70年代后期才发展起来的一种育种新技术，这是继转化、转导和接合之后一种更有效的转移遗传物质的手段。,原生质体融合的主要步骤：,选择亲本：先选择两个有特殊价值的并带有选择性遗传标记的细胞作为亲本；,脱壁：在高渗溶液中，用适当的脱壁酶（细菌或放线菌可用溶菌酶或青霉素处理，真菌可用蜗牛酶或其他相应的脱壁酶等）去除细胞壁；,融合：将形成的
46、原生质体进行离心聚集，加入促融合剂PEG(Polyethylene glycol,聚乙二醇)或通过电脉冲等促进融合;,细胞壁再生：在高渗溶液中稀释，再涂在能使其再生细胞壁和进行分裂的培养基上。,鉴定：当形成菌落后，通过影印接种法，将其接种到各种选择性培养基上，鉴定它们是否为融合子，最后再测定其他生物学性状或生产性能。,第四节 菌种的衰退、复壮和保藏,一.菌种的衰退与复壮,二.菌种的保藏,一.菌种的衰退与复壮,在生物进化过程中，变异是绝对的，稳定性是相对的；退化性变异是大量的，而进化性变异却是个别的。,具体表现为： 原有形态性状变得不典型：苏云金芽孢杆菌的芽孢和伴孢晶体变小 生长速度变慢：细黄链
47、霉菌“5406”菌株在平板培养基上不产孢子 代谢产物生产能力下降，即负变：藤仓赤霉产赤霉素能力下降 致病菌对宿主侵染力下降：白僵菌对宿主致病力减弱 对外界不良条件包括低温、高温或噬菌体侵染等抵抗能力的下降。,衰退是指由于自发突变的结果，使某物种原有一系列生物学性状发生量变或质变的现象。,狭义的复壮：是一种消极措施，指在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和生产性能测定，从已衰退的群体中将少数尚未衰退的个体筛选出来，以达到恢复原有菌种典型性状的目的。,广义的复壮：是一项积极措施，是指在菌种的生产性能尚未衰退之前就有意识地进行纯种分离和生产性能测定，以期菌种的生产性能逐步有所提高。,衰退的防止,菌
48、种的复壮,菌种的复壮,1.衰退的防止,菌种的传代次数越多，产生的突变几率也越高，因此，应尽量避免不必要的移种和传代，并将必要的传代降低到最低限度。,（1）控制传代次数,（2）创造良好的培养条件,如在赤霉素生产菌的培养基中，加入糖蜜、天冬酰胺、谷氨酰胺、5核苷酸或甘露醇等丰富营养物时可防止衰退。,（3）利用不同类型的细胞接种传代,放线菌和丝状真菌的菌丝细胞是多核的或是异核体，如果用菌丝接种很容易出现衰退，而用孢子接种，不易出现衰退。,（4）采用有效的菌种保藏方法,在用于工业生产的菌种中，重要的性状都属于数量性状，但这类性状是最易退化的，即使在有效的保藏条件下，仍无法避免这种情况发生。,2.菌种的
49、复壮,（1）纯种分离,纯种分离法,菌落纯（菌种纯）,细胞纯（菌株纯）,平板表面涂布法,平板划线分离法,琼脂培养基浇注法,用“分离小室”分离单细胞,用显微操纵器分离单细胞,用菌丝尖端切割法分离单细胞,通过纯种分离，可将退化菌种的一部分仍保持原有典型性状的细胞分离出来，经扩大培养，即可恢复原菌株的典型性状。,（2）转入宿主体内生长进行复壮,对于寄生型微生物的退化菌株，可通过接种至相应的昆虫或动、植物宿主体内的措施来提高它们的致病性。,（3）淘汰已衰退的个体,“5406”（农用抗生素）放线菌（Streptomyces microflavus）的分生孢子采用-10至-30的低温处理57天后，死亡率达到80，而存活的抗低温个体，主要是未退化的健壮个体，这样就达到了复壮的目的。,例如，经过长期人工培养的苏云金芽孢杆菌会导致毒力减退和杀虫效率降低。这时如用衰退菌株去感染菜青虫的幼虫，然后再从病死虫体内重新分离出典型的产毒菌株。如此反复多次，就可提高菌株的杀虫效率。,二.菌