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1、4.5 薄层层析法及其实验技术,4.5.1 技术参数 4.5.2 理论基础 4.5.3 薄层层析固定相选择原则 4.5.4 薄层层析展开剂选择原则 4.5.5 薄层层析的实验技术 4.5.6 应用技术,提 纲,10-60min,塔板数高,0.01g,薄层层析法特点,4.5.1 技术参数,1) 比移值Rf,在薄层层析分离中，原点距展开剂前缘的距离为12cm，原点距展开斑点A.B的距离各为6cm.8cm。A.B两斑点的比移值各为多少？,RfA=6/12=0.50 RfB=8/12=0.67,一对斑点层析时移动距离的差值与两个斑点底宽和的比值的2倍。,2)分离度Rs,3) 分离数SN,a为Rf=1及
2、Rf=0两种组分斑点中心距离 W1/20为Rf=0 的组分斑点宽度的1/2 W1/2为Rf=组分斑点宽度的1/2,什么是相对比移值（Rf)，他如何测定？代表了什么？为什么可以利用它来进行定性鉴定？,思考题,展开剂在薄层中的流速与展开剂的表面张力、黏度及吸附剂的种类，粒度，均匀度等因素有关，即和层析系统（包括固定相和流动相两方面）有关，但也和展开距离有关。,4.5.2 理论基础,溶剂在薄层中的流速问题,L2=k t, V=dL/dt= k/2L,1、在薄层层析过程中为什么不讨论平均塔板高度与展开剂流速间的关系，而是讨论与展开距离间的关系？ 2、设用一定的层析系统进行薄层层析分离时，展开剂前缘移动
3、5cm需要5min。如果展开剂前缘移动10cm层析可以结束，需要多少时间？在展开剂前缘离原点5cm和10cm处，展开剂前缘的上升速度分别为多少？,思考题,何种层析(吸附、分配、亲和、凝胶） 被分离组分性质（极性、离子、分子 大小等） 吸附剂吸附性能强弱,4.5.3 薄层层析固定相选择原则,选择原则,常用固定相,吸附层析 展开剂对被分离组分有一定的溶解度 展开剂对被分离组分有适当的亲和力 展开剂极性一般比被分离物质的极性略小 分配层析 展开剂选择各组分溶解度相差大的溶剂,4.5.4 薄层层析展开剂选择原则,制备薄层板： 干板-软板，湿板-硬板 定性定量时薄层厚度为0.2-0.3mm 制备薄层的厚
4、度要求约为0.5-2mm,4.5.5 薄层层析的实验技术,活化 形式：硅胶G、硅胶H、硅胶GF254、 硅胶HF360 粘合剂（煅石膏：牢度差，不能用于分离无机物；羧甲基纤维素：牢度好，不能用腐蚀性显色剂；淀粉：不能用于分离有机物）,硅胶,特殊薄层,混合薄层：两种不同吸附剂 酸碱薄层：稀酸或稀碱代替水 络合薄层：加入络合剂 涂布固定液的薄层： 具有浓缩区的薄层：不同粒度 高效薄层：极细均匀的吸附剂,1、层析用硅胶，有硅胶G、硅胶H、硅胶GF254、硅胶HF360等等不同标号，这些分别表示什么？应用这些硅胶时应分别注意些什么？ 2、聚酰胺薄层的作用机理是什么？ 3、试比较软板和硬板的优缺点。 4
5、、简述混合薄层、酸碱薄层、络合薄层、涂布固定液的薄层、具有浓缩区的薄层、高效薄层的分离原理。,思考题,点样： 溶解试样的溶剂，点液集中，点量精确，点样量适当,展开： 极性增强顺序：石油醚环己烷二硫化碳四氯化碳三氯乙烯苯甲苯二氯甲烷氯仿乙醚乙酸乙酯乙酸甲酯丙酮正丙醇乙醇甲醇吡啶酸,三角图形法,微量圆环技术,原则：先用单一溶剂，再用混合溶剂 在硅胶薄层上分离生物碱： 单一溶剂：环己烷、苯、氯仿 混合溶剂：苯-氯仿（9：1，1：1） 环己烷-氯仿-二乙胺（5：4：1） 苯-乙酸乙酯-二乙胺（7：2：1） 苯-正庚烷-氯仿-二乙胺（60：50：10：0.2） 二乙胺：改变极性，调整酸碱度，增大试样的溶
6、解度,聚酰胺薄层 展开剂洗脱能力的大小顺序： 水乙醇甲醇丙酮稀氢氧化铵（钠）溶液甲酰胺二甲基甲酰胺 在聚酰胺薄层上用混合展开剂： 水-乙醇（1:1） 水-甲醇（1:1） 水-乙醇-乙酰基丙酮（4:2:1） 水-乙醇-丁酮-乙酰基丙酮（13:3:3:1） 水-乙醇-乙酸-二甲基丙酰胺(6:4:2:1) 二甲基甲酰胺-苯 （3:97） 数值分析方法 用56种展开剂分离22种磺胺类药物时，可较快地找到最佳 系统组合,展开方式,上行展开 下行展开 径向展开 多次展开 连续展开 双向展开 程序控制多次展开法,氯仿-甲醇（95：5）为展开剂分离麦角生物碱 氯仿：极性较弱，沸点较低,边缘效应,思考题 1、怎
7、样选择薄层层析的展开剂？应该怎样来考虑？ 2、新发展的薄层技术有哪些？ 3、用Al2O3薄层层析分离并测定氨基蒽醌中的-氨基蒽醌时，用环己烷-丙酮(3:1)的混合溶剂为展开剂。你认为下列三种溶剂中选用哪一种来溶解试样最为合适？为什么？吡啶、二氧六烷、丙酮，他们的沸点分别为116C，101 C ，56 C ，溶剂的极性和试样在他们之中的溶解度都依次递减。,显色：在紫外光下观察，以蒸汽熏， 喷以各种显色剂以及生物自显影,定性：比移值，斑点的显色特性，斑点的原位光谱扫描，与其他分析技术的联用 定量：目视比较半定量法，洗脱法（误差约为1-5% ），薄层扫描仪,瑞士CAMAG9(长玛)公司,质量优异,
8、价格昂贵,主流薄层色谱扫描仪为SCANNER-。 日本SHIMADEU(岛津) 公司销售量大,其主流扫描仪为CS-9300、CS-9301。 上海科贺生化技术有限公司是国内唯一的薄层色谱扫描仪生产厂商,TLSee薄层色谱扫描仪,全自动展开仪 ADC2(瑞士) 全自动控制薄层活化、预平衡，展开缸饱和，展开距离及干燥等所有展开步骤，实时监控并报告展开温度及湿度,一束光线的波长S是被测物的吸收峰所在；另一束光线的波长R是被测物不吸收的，可使由于薄层不均匀所引起的基线波动得以消除 由于斑点中被测组分的分布是不均匀的，一般是斑点中心被测组分较多，周围较少，因此采用微小光束，曲折形的扫描方式 采用背景补偿
9、来消除铺薄层所用的吸附剂中可能含有杂质和显色不均匀性的影响 散射参数校正后吸光度和浓度之间成线性关系,在医药方面的应用,4.5.6 应用技术,聚酰胺薄膜 苯-甲醇-丁酮-甲酸（7：1：1.5：0.5）为展开剂 分离了7种黄芩中8种黄芩苷及苷元,人参皂苷的分离图谱,四环素中差向四环素的含量应低于一定标准，因为后者毒性较大。溶四环素试样于甲醇中配成一定浓度的溶液，取一份点于硅藻土薄层上，用丙酮-氯仿-乙酸乙酯（3：1：1）的混合溶剂为展开剂展开后，用浓氨水熏，然后在254nm的紫外光下观察，除四环素主斑点外不得出现差向四环素的杂质斑。,产品质量控制及杂质检验,反应终点的控制,未知物结构剖析,在薄层
10、上分离良好的层析条件，对于柱层析是很有参考价值的。也可用薄层分离制备成品，把粗制品点在较厚、较大的制备型薄层板上分离杂质，可达到制备纯品的目的,柱层析,保持层析过程于低温或高于室温的温度下进行,粒径越小，理论板高值降低; 粒径越小会降低流速,极细固定相，宜用直径与长度比例大的层析柱,Rs正比于n，也正比于L; 柱长增加使流速减慢; 峰宽度正比于L; 柱的直径大小与板高H没有直接关系,影响柱效.,除去蛋白质中的盐及小分子物质 Sephadex G-25 Bio-gel P30,大黄70%甲醇提取液加到凝胶色谱柱上，并用70%的甲醇洗脱，依次得到二蒽酮苷、蒽醌二葡萄糖苷、蒽醌单糖苷、游离苷元,弱极
11、性的大孔树脂，用水将糖等亲水性成分洗脱，用不同浓度的乙醇洗下被大孔树脂吸附的苷类,XDA大孔吸附树脂, 用85乙醇洗脱，可用于咖啡碱的吸附分离,纸层析,分配层析：67%键合水 滤纸要求： 物理性状均匀展开速率均匀； 一定的机械强度防变形； 一定的纯度，定性灰分0.1%，定量灰分0.05%; 厚薄、纤维松紧、纵横向； 前处理,展开剂 Rf：0.050.85，Rf0.05； 不与被分离组分反应； 层析点圆整； 不选高沸点有机溶剂，影响展开后干燥。,氨基酸的分离和检出:用酚-水（7：3）作展开剂进行第一次展开；用丁醇-醋酸-水（4:1:2）做展开剂进行第二次展开。展开后用茚三酮的丁醇溶液，使之显色。,