第05章核酸的化学.ppt

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1、第 五章 核酸的化学,重点内容,核酸的分子组成与基本结构单位 DNA与RNA的结构与功能 核酸的理化性质及其应用,第一节 核酸的概念和化学组成,The Concept and Chemical Component of Nucleic Acid,核酸的发现和研究工作进展,1868年 Fridrich Miescher从脓细胞中提取“核素” 1944年 Avery等人证实DNA是遗传物质 1953年 Watson和Crick发现DNA的双螺旋结构 1968年 Nirenberg发现遗传密码 1975年 Temin和Baltimore发现逆转录酶 1981年 Gilbert和Sanger建立DNA

2、 测序方法 1985年 Mullis发明PCR 技术 1990年 美国启动人类基因组计划(HGP) 1994年 中国人类基因组计划启动 2001年 美、英等国完成人类基因组计划基本框架,Oswald T. Avery (1877-1955).,埃弗里，美国细菌学家，他和C.麦克劳德、M.麦卡锡于1944年共同证明了遗传物质是DNA而不是蛋白质。,核 酸(nucleic acid),是以核苷酸为基本组成单位的生物大分子，携带和传递遗传信息。,（1）存在于细胞质（90%）及细胞核内。 （2）参与细胞内DNA遗传信息的表达（转录及 翻译）。 （3）对于RNA病毒，RNA是遗传信息的载体。,DNA（脱

3、氧核糖核酸，deoxyribonucleic acid ）,（1）存在于细胞核（98%）、线粒体、质粒等中。 （2）遗传的物质基础、携带遗传信息，决定细胞和 个体的基因型。,RNA（核糖核酸，ribonucleic acid ）,一、核酸的生物功能,（一）核酸是遗传变异的物质基础,核酸所含有的基因决定物质的遗传特性; 变异使物种进化和生物发展成为可能。,基因：系指含有合成一个功能性生物分子（蛋白质或RNA）所需信息的一个特定DNA片段。,（二）核酸与生物遗传信息的传递,核酸的遗传信息决定蛋白质的结构,（三）核酸与医药,致病：DNA分子结构的改变 抗病：核酸类似物 治疗：基因治疗 基因工程药物：

4、生物药物的一种新生产手段,二、核酸的分子组成与 基本结构单位 单核苷酸 Mononucleotide,核酸的化学组成,1. 元素组成 C、H、O、N、P（910%）,2. 分子组成, 碱基(base)：嘌呤碱，嘧啶碱, 戊糖(Five-carbon Sugars) 核糖(ribose ) 脱氧核糖(deoxyribose), 磷酸(phosphate),核酸,核苷酸,磷酸：H3PO4,核苷,戊糖（核糖或脱氧核糖）,碱基（嘌呤或嘧啶）,核酸分子的基本结构单位核苷酸,嘧啶,嘌呤,1. 碱基 (Bases),（一）核苷和核苷酸,嘌呤： purine,嘧啶： pyrimidine,腺嘌呤（A）,鸟嘌呤

5、（ G）,胞嘧啶（C）,尿嘧啶（U）,胸腺嘧啶（T）,adenine,guanine,cytosine,uracil,thymine,稀有碱基： 、I、DHU、 m7A、m7G、,2. 戊糖（Five-carbon Sugars）,-D-核糖 (ribose) 构成RNA,-D-2-脱氧核糖 （deoxyribose） 构成DNA,磷酸（phosphate）：H3PO4,两类核酸分子组成比较 DNA A、G、C、T 脱氧核糖（dR） 磷酸 RNA A、G、C、U 核糖（R） 磷酸,碱基 核糖 磷酸,3. 核苷(ribonucleoside)的形成,碱基和核糖（脱氧核糖）通过糖苷键连接形成核苷（

6、脱氧核苷）。,嘌呤核苷糖苷键： N9C1 嘧啶核苷糖苷键： N1C1,腺苷,脱氧胞苷,4. 核苷酸(ribonucleotide),核苷（脱氧核苷）和磷酸以磷酸酯键连接形成核苷酸（脱氧核苷酸）。,自然界存在的游离核苷酸为5核苷酸，5 可略去。,碱基不同：可产生由A、G、C、U、T组成的五 类核苷酸。 戊糖不同：可产生由脱氧核糖和核糖组成的两类 核苷酸DNA和RNA。 磷酸的数目不同：可产生含1个、2个或3个磷酸 基的不同核苷酸NMP、NDP、NTP。,O,N,N,NH2,O,OCH2,P,O,OH,HO,OH,H,1,1,脱氧胞苷酸（dCMP）,参与构成RNA的碱基、核苷及相应的核苷酸,RNA

7、 核苷 5-核苷酸 碱基base ribonucleoside ribonucleotide,腺嘌呤adenine(A) 腺苷adenosine 腺苷酸（AMP） 鸟嘌呤guanine(G) 鸟苷guanosine 鸟苷酸（GMP） 胞嘧啶cytosine(C) 胞苷cytidine 胞苷酸（CMP） 尿嘧啶uracil(U) 尿苷uridine 尿苷酸（UMP）,参与构成DNA的碱基、核苷及相应的核苷酸,DNA 脱氧核苷 5-脱氧核苷酸 碱基base deoxyribonucleoside deoxyribonucleotide,腺嘌呤adenine(A) 脱氧腺苷deoxyadenosin

8、e 脱氧腺苷酸(dAMP) 鸟嘌呤guanine(G) 脱氧鸟苷deoxyguanosine 脱氧鸟苷酸(dGMP) 胞嘧啶cytosine(C) 脱氧胞苷deoxycytidine 脱氧胞苷酸(dCMP) 胸腺嘧啶thymine(T) 脱氧胸苷deoxythymidine 脱氧胸苷酸(dTMP),体内重要的游离核苷酸及其衍生物,含核苷酸的生物活性物质： NAD+、NADP+、CoA-SH、FAD 等都含有 AMP,多磷酸核苷酸：NMP，NDP，NTP,环化核苷酸: cAMP，cGMP,AMP,ADP,ATP,cAMP,三、 核酸的分子结构,Molecular structure of nuc

9、leic acid,（一）DNA的分子结构,1. DNA 的一级结构,定义 核酸中核苷酸的排列顺序。 由于核苷酸间的差异主要是碱基不同，所以也称为碱基序列。,3 ,5 磷酸二酯键 概念：一个核苷酸戊糖C3的游离羟基与另一个核苷酸戊糖C5上的磷酸脱水缩合生成的化学键。,交替的磷酸基团和戊糖构成了DNA的骨架 (backbone)。,DNA链的方向是5 3,1) 主链与侧链 由磷酸-戊糖交替排列成的链状结构为核酸的主链； 碱基伸展于主链之外，称为侧链。 2) 5-端与3-端 多核苷酸链中，戊糖C5上有自由磷酸基的一端，称为5-端；而戊糖基的C3上有自由羟基者，称为3-端。,多核苷酸链 多个核苷酸聚

10、合所形成的链状结构称之。,3,5,主 链,侧 链,书写方法,5 pApCpTpGpCpT-OH 3,5 A C T G C T 3,核酸分子的大小常用碱基(base或kilobase)数目来表示。 小的核酸片段(50bp)常被称为寡核苷酸(oligonucleotide)。自然界中的DNA和RNA的长度可以高达几十万个碱基。,小 结,2.真核细胞染色质DNA与原核细胞生物DNA的一级结构特点,（1）重复顺序,高度重复顺序 中度重复顺序 单一顺序 (结构基因、单顺反子),（2）间隔顺序与插入顺序,（常有卫星DNA）,（内含子、外显子）,（3）回文结构：舟行水面水行舟,a.真核细胞染色质DNA的结

11、构特点：,b. 原核细胞染色质DNA的结构特点：,（1）基因重叠：同一DNA序列包含不同的基因区 （2）多顺反子 一个mRNA 分子上携带多个结构基因的编码信息 （3）结构基因连续性,原核生物的多顺反子,真核生物的单顺反子,3. DNA的二级 结构 Secondary Structure of DNA,（1）DNA的二级结构 双螺旋结构 The secondary structure of DNA DNA double helix,DNA双螺旋结构是DNA 二级结构的重要形式，它 是Watson和Crick两位科学家于1953年提出来的一种结构模型。,DNA双螺旋结构的研究背景,罗莎林德弗兰克

12、林Rosalind Franklin（1920-1958）,DNA双螺旋结构模型要点 （Watson, Crick, 1953）,DNA分子由两条相互平行但走向相反的脱氧多核苷酸链组成，两链以-脱氧核糖-磷酸-为骨架，以右手螺旋方式绕同一公共轴盘。大沟(major groove)及小沟(minor groove)相间。,DNA双螺旋结构模型要点 （Watson, Crick, 1953）,碱基垂直螺旋轴居双螺旋内側，与对側碱基形成氢键配对（互补配对形式：A=T; GC） 。 螺旋直径为2nm，相邻碱基平面距离0.34nm，螺旋一圈螺距3.4nm，一圈10对碱基。,亲水性的骨架位于双链的外侧。

13、疏水性的碱基位于双链的内侧。,骨架与碱基,碱基互补配对,T,A,G,C,DNA双螺旋结构模型要点 （Watson, Crick, 1953）,氢键维持双链横向稳定性，碱基堆积力维持双链纵向稳定性。 磷酸基的负电荷与介质中的阳离子的正电荷之间形成的离子键。,双螺旋DNA的结构特征,1、反向平行 2、右双螺旋：大、小二沟；10bp/螺旋，螺 距3.4nm (34A0)；D = 2nm(20A0) 3、主链骨架位于螺旋外侧，碱基在内 4、副键维系：横向氢键；纵向碱 基堆砌力 5、碱基互补（配对）：A = T；G C,双螺旋DNA的结构特点,（2）DNA双螺旋 结构的多样性 The Variety o

14、f DNA Structures,1953，Watson-Crick， BDNA（右手螺旋） (right-handed helix) 1979，Rich， ZDNA（左手螺旋） (left-handed helix),BDNA,ADNA,ZDNA,a.多种右手螺旋,天然DNA在不同湿度、不同盐浓度中结晶，其X线衍射所得数据不一样。,B. Z-DNA 左手螺旋。 螺距较大，直径变窄（细长而伸展），只有小沟。 分子长链中磷原子不是平滑延伸而是锯齿排列。,ZDNA也是天然DNA中的一种构象。 意义： DNA的左旋化可能与致癌、突变及基因表达的调控有关。,4. DNA的超螺旋结构及其在染色质中的组装

15、-DNA的三级结构,DNA的超螺旋结构,超螺旋结构(superhelix 或supercoil) DNA双螺旋链再盘绕即形成超螺旋结构。,正超螺旋(positive supercoil) 盘绕方向与DNA双螺旋方同相同,负超螺旋(negative supercoil) 盘绕方向与DNA双螺旋方向相反,超螺旋,原核生物DNA的高级结构,线状DNA形 成的超螺旋,环状DNA形成的超螺旋,DNA超螺旋结构的电镜图象,真核生物DNA的高度有序和高度致密的结构,真核生物DNA以非常有序的形式存在于细胞核内。 在细胞周期的大部分时间里，DNA以松散的染色质(chromatin)形式存在，在细胞分裂期，则形

16、成高度致密的染色体(chromosome)。,5. 染色质与染色体,真核生物的染色体,DNA在真核生物细胞核内的组装,真核生物染色体由DNA和蛋白质构成，其基本单位是 核小体(nucleosome)。,核小体的组成 DNA：约200bp 组蛋白：H1 H2A，H2B H3 H4,DNA染色质呈现出的串珠样结构。 染色质的基本单位是核小体(nucleosome)。,DNA染色质的电镜图像,核 小 体,核小体串珠样的结构,双链DNA的折叠和组装,DNA经过多次折叠，被压缩了800010000倍，组装在直径只有数微米的细胞核内。,6. 基因与基因组,DNA的基本功能是以基因的形式荷载遗传信息，并作为

17、基因复制和转录的模板。它是生命遗传的物质基础，也是个体生命活动的信息基础。,基因从结构上定义，是在染色体上占有一定空间的特定DNA片段，其中的核苷酸排列顺序决定了基因的功能。,基因组指一个生物体内所有遗传信息的总和即DNA分子的全序列（genome)。 人的基因组为2.8109 bp，3-4万个可翻译基因。,基因组内DNA序列的结构特征,基因序列和非基因序列； 编码序列和非编码序列； 单一序列和重复序列。,基因组学（genomics）: 研究生物体基因和基因组的结构组成、稳定性及功能的一门学科。,由于DNA的两条链是互补的，故如果知道一条链的碱基排列顺序，就可推算出另一条链的碱基排列顺序。 如

18、：已知某DNA一单链的碱基顺序是 5- A C G T A C A G 则另一互补单链的碱基顺序是下列哪个？ 1、 5- T G C A T G T C 2、 5- C T G T A C G T 3、 5- U G C A U C U C,（二） RNA的种类和分子结构,Category and Molecular Structure of RNA,RNA是一条由核糖核苷酸链形成的具有一定三级结构的大分子化合物。,RNA与蛋白质共同负责基因的表达和表达过程的调控。 RNA通常以单链的形式存在，但有复杂的局部二级结构或三级结构。 RNA比DNA小的多。 RNA的种类、大小和结构远比DNA表现出

19、多样性。,RNA可以在某些局部弯曲折叠，形成双螺旋式的二级结构。碱基配对关系是A = U，G C,UGCGAUACUCAUCGCA,5,3,U A G C G U,A U C G C A,5,3,A,C,U,C,Stem-loop Hairpin,RNA的种类、分布、功能,* rRNA的结构,* rRNA的功能 参与组成核蛋白体，作为蛋白质生物合成的场所。,1.核蛋白体RNA的结构与功能,*rRNA含量最多， 占总RNA的80%。,核蛋白体的组成,* rRNA的种类（根据沉降系数）,真核生物 5S rRNA 28S rRNA 5.8S rRNA 18S rRNA,原核生物 5S rRNA 23

20、S rRNA 16S rRNA,小亚基,大亚基,真核生物,原核生物,16S-rRNA,23S-rRNA 5S-rRNA,18S-rRNA,28S-rRNA 5.8S-rRNA 5S-rRNA,真核细胞中有四种rRNA，原核细胞有三种。,2. 转运RNA的结构与功能 （Transfer RNA, tRNA）,书写方法：tRNAPhe代表转运苯丙氨酸的tRNA,tRNA中含有多种稀有碱基 由7393核苷酸组成； 占细胞总RNA的15%； 种类很多，每一种氨基酸都有对应的一种或几种tRNA。,tRNA中含有多种稀有碱基,稀有碱基（rare base）是指除A、G、C、U外的一些碱基。,* tRNA的

21、二级结构 三叶草形 氨基酸臂 DHU环 反密码环 额外环 TC环,氨基酸臂,额外环,氨基酸结合点,* tRNA的三级结构 倒L形,* tRNA的功能 活化、搬运氨基酸到核糖体，参与蛋白质的翻译。,tRNA在蛋白质合成中起转运氨基酸的作用。,AA-COOH,tRNA在蛋白质合成中起转运氨基酸的作用。,AA-CO,密码子和反密码子互补配对,3. 信使RNA的结构与功能,（Messenger RNA , mRNA）,mRNA的种类多，含量少，半寿期短。,有一种蛋白质就相应有一种mRNA。 数量占总RNA的3-5%。 代谢活跃，半寿期只有几小时到几天。,内含子 (intron),* mRNA成熟过程,

22、外显子 (exon),mRNA的前体是hnRNA，在核内。移到胞液中变成成熟的mRNA。,mRNA是蛋白质合成的直接模板。 它能将核内DNA的遗传信息携带到胞液， 作为蛋白质合成的模板，决定蛋白质中的氨 基酸顺序。 具体说来，是以其分子上每三个核苷酸为 一组(密码子)，表示肽链上的某一个氨基酸。,5-m7GpppN,AAA AAA,真核生物的mRNA的结构特点是： 5-端有帽子结构，3-端有尾巴结构。 1、帽子结构：7-甲基鸟嘌呤-三磷酸核苷（m7GpppN） 2、多聚A尾：polyA，数十个至百余个A连接而成。,mRNA核内向胞质的转位 mRNA的稳定性维系 翻译起始的调控,帽子结构和多聚A

23、尾的功能,M7Gppp,GUG,UAA,AAAAAn,AUG,5-帽子结构,5-非翻译区,密码子,编码区,3-非翻译区,3-多聚A尾,哺乳动物成熟mRNA的结构特点,5,3,编码情况 原核生物 多顺反子，即1个mRNA分子编码可 作为多种多肽链合成的模板。 转录与翻译同时进行 真核生物 单顺反子，即1个mRNA分子只编码 一条多肽链。 转录与翻译分开进行,原核细胞,细胞质,细胞核,DNA,内含子,外显子,转录,转录后剪接 转运,mRNA,hnRNA,翻译,蛋白,真核细胞,核 蛋 白 体,蛋白质 核酸,组成单位 氨基酸 核苷酸,组成单位 20种氨基酸 A、C、G、T的种类 （DNA） A、C、G

24、、U （RNA）,核酸与蛋白质的比较（组成，结构，功能）,连接方式 肽键 磷酸二酯键 CONH,一级结构 氨基酸排列顺序 碱基序列,空间结构 二、三、四 双螺旋、超螺 级结构 旋、蛋白质-核 酸的非共价结 合等,功能 生命活动中各 遗传信息的贮 种功能的直接 存、传递、表达 执行者 决定蛋白质的结构,核 酸 的 理 化 性 质 The Physical and Chemical Characters of Nucleic Acid,第 二 节,一、核酸的一般性质： 核酸是生物大分子，故具有大分子的一般特性。 DNA是线性大分子，酸性强，粘度大。但变性后其粘度会降低。 RNA分子较小，粘度也较小

25、。 RNA和DNA都是极性化合物，故溶于水，不溶于乙醇等有机溶剂。且其钠盐的溶解度更大。,核酸也是两性电解质，也能进行电泳。,核酸中的嘧啶和嘌呤含有共扼双键，对260nm的紫外线有最大吸收，可用于核酸的定性定量分析。,1. DNA或RNA的定量 OD260=1.0相当于 50g/ml双链DNA 40g/ml单链DNA（或RNA） 20g/ml寡核苷酸 2.判断核酸样品的纯度 DNA纯品: OD260/OD280 = 1.8 RNA纯品: OD260/OD280 = 2.0,OD260的应用,二、核酸的变性、复性和杂交,理化因素破坏氢键和碱基堆积力，使核酸分子空间结构改变，从而引起核酸的理化性质

26、和生物学功能发生改变，称为核酸的变性。,1、概念：,DNA变性的本质是双链间氢键的断裂,变性只涉及空间结构的破坏，不影响一级结构。,部分变性DNA的电镜图像,2、变性因素 包括加热、强酸强碱，有机溶剂，尿素等。实验室中最常用加热变性的方法。,3、变性DNA的改变 DNA变性后，溶液的OD260增加的现象称为高色效应（或增色效应）。 机理： DNA变性时，双链分开，碱基暴露，故对紫外光吸收增加。,例：变性引起紫外吸收值的改变,DNA的紫外吸收光谱,4、 Tm（解链温度；融解温度）,加热DNA溶液，紫外光的吸收度达到最大值一半时的温度，（或DNA分子50%双链结构被解开时的温度）就是DNA的解链温

27、度（融解温度，Tm）。,其大小与G+C含量成正比。 Tm = 4 (G + C) +2 (A + T) (20bp时）,G+C 含量越高，解链温度就越高。,解链曲线的变化,三、DNA的复性与分子杂交,DNA复性(renaturation)的定义 在适当条件下，变性DNA分开的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性。,减色效应 DNA复性时，其溶液OD260降低。,热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为退火(annealing) 。,DNA复性,在DNA变性后的复性过程中，不同来源的DNA或RNA分子只要在某些区域存在碱基配对的关系，在适宜的条件下，就可以形成杂化双链，称为

28、核酸分子杂交。 这种杂化双链可以是DNA-DNA、DNA-RNA或RNA-RNA,核酸分子杂交(hybridization),核酸分子杂交,核酸分子杂交的应用 研究DNA分子中某一种基因的位置 分析两种核酸分子间的序列相似性 检测某些专一序列在待检样品中存在与否 是基因芯片技术的基础,第三节 核酸的分离与含量测定,重要原则 1 保证核酸一级结构的完整性； 2 排除其它分子的污染，保证核酸分子的纯度。,一、核酸的提取、分离和纯化,可以采取的措施： 1、简化步骤，缩短分离时间，减少对核酸的破坏 2、避免极端酸碱环境及高温，避免剧烈震荡 3、抑制核酸酶的活性（DNase和RNase） 4、防止核酸的生物降解 5、减少物理因素对核酸的降解，如高温、机械剪切力,（一）DNA的分离纯化,（三）核酸的纯度检测,纯DNA的A260/280为1.8 纯RNA的A260/280为2.0,A260/A280比值是纯度检测的重要指标。,（二）RNA的分离纯化,应用DEPC（焦碳酸二乙酯）,二、核酸含量的测定,1、定磷法: RNA平均含磷9.4%，DNA平均含磷9.9% 2、定糖法 3、紫外吸收法,The End,