《蛋白质综合实验.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《蛋白质综合实验.ppt（35页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、蛋白质综合实验,蛋白质浓度测定介绍,四种古老的经典方法: 定氮法，双缩尿法（Biuret法）、Folin酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。 新的测定法: 考马斯亮蓝法（Bradford法）。 还有近来广为应用的蛋白定量方法BCA法。,在选择方法时应考虑,实验对测定所要求的灵敏度和精确度； 蛋白质的性质； 溶液中存在的干扰物质； 测定所要花费的时间。,紫外吸收法,较为灵敏； 快速；510分钟； 原理：蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在 280nm处的光吸收. 干扰物质：各种嘌吟和嘧啶；各种核苷酸 说明：用于层析柱流出液的检测；不消耗样品，测定后样品仍能回收利用.,BCA（2,2-联喹啉-4,4-
2、二甲酸二钠）法,原理： 在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu1+。两分子的BCA(在BCA反应液中）螯合一个Cu1+ ，形成紫色的反应复合物。该水溶性的复合物在562nm处显示强烈的吸光性。 优点：灵敏度非常高; 较快速40分钟内； 干扰物质：螯合剂；略高浓度的还原剂 说明：抗干扰能力强， 蛋白不可逆的变性,蛋白质含量的测定,（Lowry法）,实验目的 1.学习和掌握蛋白质含量测定的原理 2.掌握Folin-酚法（Lowry法）测定蛋白质浓度的操作技术,原理 蛋白质含有两个以上的肽键(CONH)，因此有双缩脲反应，在碱性溶液中，能与Cu2+形成紫红色络合物。Folin酚反应是
3、在双缩脲反应的基础上，引进Folin试剂(磷钼酸磷钨酸试剂)，蛋白质铜络合物能还原磷钼酸磷钨酸试剂，生成蓝色物质。在一定条件下，蓝色强度与蛋白质的量成正比例。 本法的优点是操作简便、灵敏度高、较紫外吸收法灵敏1020倍，较双缩脲法灵敏100倍。其不足之处是此反应受多种因素干扰。,操作方法 血清蛋白的测定和标准曲线制作 试管编号 1 2 3 4 5 6 7 标准蛋白 (mL) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 稀释血清(mL) 1.0 0.9NaCl(mL) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 碱性铜溶液(mL) 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 混匀后室温放
4、置20 min。 酚试剂(mL) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 摇匀，30min后以0号试管为空白对照，在650nm处比色 .,作图 以OD650为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制一条过原点的标准曲线。,求算标本血清中的蛋白质浓度 查图：利用测定管读数在标准曲线上查出蛋白量（X），最后如下算出标本的蛋白含量： gX*（100/0.002）*10-6 以标准管和测定管的吸光数，按下列公式计算： g（OD测定/OD标准*标准管蛋白量）*（100/0.002）,注意事项 1）加入酚试剂时动作要快并立即摇匀，不应出现混浊 2）标准曲线制备：至少要有五个点以上。一条
5、理想的标准曲线应该是斜率接近l，且通过原点的直线，其范围应在被测物浓度的一半到二倍之间。吸光度在0.050.8之间。如果待测样品浓度超过标准曲线浓度范围，应将样品稀释再测。,临床意义 总蛋白增加：血液浓缩（严重腹泻、呕吐、高热、休克）；合成增多（多发性骨髓瘤G） 总蛋白减少： 血液稀释（补水过多、水钠潴留） 各种原因所至的白蛋白减少，如： 合成不足（肝脏功能下降） 合成原料不足（饥饿、腹泻、消化道肿瘤） 去路增多(肾病综合症、大量胸腹水、烧伤、大出血) 消耗过多（糖尿病、甲亢、肿瘤等）,层析法,实验目的,1.掌握葡聚糖凝胶的特性及凝胶层析的原理。 2学习葡聚糖凝胶层析的基本操作技术。,层析基本
6、知识,层析定义 层析法又称色谱法，利用分离物质中不同组份的某些理化性质的差异而建立起来的一种分离技术 由固定相和流动相组成,层析分类 根据操作形式不同分类 根据分离机制不同分类,凝胶层析,凝胶是一种具有多孔，网状结构的分子筛。利用这种凝胶分子筛对大小，形状不同的分子进行层析分离，称凝胶层析 。 小分子扩散进人凝胶颗粒内，大分子被排阻于颗粒之外；大小分子分开：大分子行程较短,已洗脱出层析柱，小分子尚在进行中。,分辨率不高，分离操作较慢。分子量的差异仅表现在流速的差异上，分离时流速必须严格把握。 对于分子量相差不多的物质难以达到很好的分离。 凝胶层析要求样品粘度不宜太高。凝胶颗粒有时还有非特异吸附
7、现象。,常用的凝胶类型有: 交联葡聚糖(sephadex) 交联琼脂糖(sepharose CL) 聚丙烯酰胺凝胶(biogel P) 琼脂糖(biogel A) 多孔玻璃(bio glass) 聚苯乙烯(bio-beads)等。 Spandex G(10-200) （1）数大，交联度小，网孔大 （2）代表持水量，G-25，1g干胶持水2.5ml.,操作：,装柱 加样 洗脱 清洗 凝胶回收 做思考题,实验结果,一、描述实验现象 二、分析实验现象,聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 分离血清蛋白,1了解凝胶电泳的基本原理及其主要影响因素。 2掌握凝胶电泳分离血清蛋白的方法。,实验目的,实验原理,以聚
8、丙烯酰胺作为支持介质的一种电泳技术。凝胶是聚丙烯酰胺和N,N-甲叉双丙烯酰胺交联而成的，催化剂为过硫酸铵，加速剂为TEMED（四甲基乙二胺 ）。 本实验采用聚丙烯酰胺凝胶不连续体系与非解离体系，电泳迁移率的大小与带电粒子的大小、形状和带净电荷的数量等因素有关。电荷数和分子大小不一的各种血清蛋白质通过浓缩效应、电荷效应、分子筛效应而被精细地分离。 由于具有以上三种效应，所以此方法分离效果好，分辨率高，血清蛋白在纸上电泳仅能分成57个组分，而在聚丙烯酰胺凝胶电泳中可分出1230个组分。,实验仪器,1垂直板电泳糟 2直流稳压电源 3微量移液器 4脱色摇床,实验试剂与材料,1分离胶缓冲液(4X) ：
9、1.5M Tris一HCl pH8.8，100ml 2浓缩胶缓冲液(4X) ： 0.5M Tris一HCl PH6.7，100ml 3胶母液(T34%，C6%) ：称取丙烯酰胺29.2g， 亚甲双丙烯酰胺0.8g，水溶至100ml， 不能加热。 410%过硫酸铵(AP) ：用少量煮过10分钟并冷却的蒸馏水配制，在4可存3-4周， 100ml。 5电极缓冲液(l0X) ：称Tris l5.lg，甘氨酸72g溶于水中，定容至500ml，使用前1:9稀释 （或者再稀释2-5倍也可）。 6样品染色液（ 考马斯亮兰染色液） ： 0.09%考马斯亮兰R一250，454ml 50%甲醇， 46ml冰乙酸定容
10、到5O0ml。 7加样缓冲液：甘油3.2m1，2M Tris一HCl（pH6.8）1.25ml，溴酚兰粉末少许加水至 l0ml。 8脱色液： 20%甲醇，7%10%的冰乙酸(现用现配) 9凝胶配制：实验用分离胶为10%，浓缩胶为3%（现用现配）,(一)凝胶的制备 (二)加样 (三)电泳 (四)剥胶 (五)染色 (六)脱色,基本实验步骤,实验步骤,1.胶模固定：将两块洗净的玻璃板，按要求对齐，夹好。将胶模装入电泳槽固定好，并将胶模下端封好，防漏。(电泳槽按要求清洗干净)。 2.制备分离胶：按分离胶配制方法配好分离胶，缓慢注入胶模中（占玻璃板的2/3），为了防止氧化，沿玻璃板壁轻轻加一层水层（注意
11、不能将胶冲起），室温下聚合40min。,3. 制备浓缩胶：配制好4%浓缩胶。将胶模中上层水倾倒出去，用滤纸吸干余水。倒入浓缩胶插好样品梳，注意避免汽泡出现，室温下聚合20min。 4. 将胶模装好，去胶条后，装入电泳槽中，检查是否漏液后，倒入电泳缓冲液，胶模内侧的液面没过矮板但不可超过高板（矮板在内）。 5. 上样：将样品梳拔出，用电极缓冲液冲洗样品孔。样品与样品缓冲液按一定比例混合好（蛋白含量大约为1- 2g/l）。,电泳:连接直流稳压电源，矮板连负极，打开电源开关。 染色: 关闭电源，取下凝胶模。用剪刀轻轻撬起胶模的 下方一侧，一个玻璃板即可取下，用刀片轻轻将胶的两侧划一下，掀起胶的一角，
12、慢向前推同时注水，靠水流压力和润滑作用，将玻璃板与胶分开。一次不行，可从另一端再操作或两端同时操作，在脱色摇床上用考马斯亮兰染色2h。 8 脱色：将胶取出，蒸馏水冲洗数次后，放入脱色液中， 数小时换液一次，直至背景清晰为止（或直接用少许水煮到背景清晰为止）。,分离胶和浓缩胶配制,10%分离胶(l) 4%浓缩胶(l) H2O 4200 3050 30.8%Acr/Bis 3250 650 1.5Tris-HCL PH8.8 2500 0.5Tris-HCL PH6.8 1250 10%APS 100 50 TEMED 10 4.5,注意事项 1丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是神经毒性试剂，并对皮肤有刺激作用，注意避免直接接触。大量操作时应在通风橱中进行。 2丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺溶液应装在棕色瓶中，置冰箱内（4）保存。可贮存12个月。测定pH（4.95.2）可检查其是否失效，失效不能聚合。 3TEMED要密封保存，过硫酸铵溶液最好当天配制，以防止氧化失效。 4凝胶的聚合速度与温度关系很大，温度低时，聚合速度减慢。,实验结果,电泳条带,聚丙烯酰胺凝胶电泳血清蛋白质区带分布图,实验报告的内容,实验二：目的要求、原理、操作步骤、结果与计算、注意事项。 实验七：目的要求、原理、操作步骤、结果分析、注意事项、思考题3。 实验十六：目的要求、原理、操作步骤、结果结果、注意事项。,