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1、第四节 钩端螺旋体病,简称钩体病，是由致病性钩体引起的一种重要人畜共患病和自然疫源性传染病。家畜中主要发生于猪，其次是牛、犬、马、羊，临诊表现多样，主要有发热、黄疸、血红蛋白尿、出血性素质，流产、皮肤及粘膜坏死，水肿等。但大多数病畜都呈隐性感染，缺乏明显临床症状,第一章 多种动物共患细菌病,一、病原 钩端螺旋体病,1、分类：钩体目前公认的只有一个种，再根据物生物学特点不同，可分为两大群： （1）双曲钩体，为非致病性或腐生性钩体。 （2）问号状钩体，为致病性钩体；,2、形态特点：钩体形态纤细，螺旋整齐而致密，一端或两端弯曲如钩，不易为普通细菌染色剂着色，常用镀银染色和姬姆萨染色法，最容易观察的方
2、法是将活菌置暗视野显微镜下观察，可见钩体象一串发亮的微细珠粒，运动活泼而特殊，沿长轴方向旋转，旋转时两端柔软，中段僵硬，由此可确认。,姬姆萨染色 姬姆萨染液（天青色素、伊红、次甲蓝的混合液）的染色法。 染前用蛋白酶等进行处理，然后再用姬姆萨染液染色，在染色体上，可以出现不同浓淡的横纹样着色。 初染剂结晶紫进行初染，再用碘液媒染，然后用乙醇(或丙酮)脱色，最后用复染剂(如番红)复染。经此方法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞中 姬姆萨染色 初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染剂的颜色(红色)，该菌属于革兰氏阴性菌。 革兰氏染色法所以能将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这
3、,菌形态,4培养：对营养要求不严格，但初次分离的菌株需用要含兔血清的培养基，最常用的为柯索夫氏和希夫纳氏培养基。在人工培养基上生长较一般细菌为慢，如在上述培养基上，置28-30需5-7天，最长在一月以上才能生长良好，此时液体呈半透明、云雾状混浊，（1%）琼脂固体培养基上，有些菌株生长不好。,钩端螺旋体培养基一柯少夫（Korthof ）培养基 配法 蛋白胨400mg ，氯化钠700mg ，碳酸氢钠10mg，氯化钾20mg，氯化钙20mg，磷酸二氢钾120mg，磷酸氢二钠44Omg ，蒸馏水500ml，无菌兔血清（灭活）8-10ml。 将各成分溶于蒸馏水内煮沸20min ，以滤纸滤，调至pH 为7
4、.2 ，分装烧瓶内每瓶100ml，121 灭菌20min ; 无菌采取兔心血分离血清，置56 水浴箱中30min以破坏补体；上述蛋白胨盐溶液每100ml中加入无菌兔血清8-10ml；混合后，用无菌分装中号试管中，每管5ml；置56 水浴箱30min ; 37 温箱中孵育2 天，剔去污染者。,注： 为防止污染，每100ml培养基可加50mg磺胺嘧啶钠。 为了促进钩端螺旋体生长，可于该培养基中加入维生素Bl2 及烟酸（各1 mg100ml），并将兔血清量自8减至5 % ，培养基中不加氯化钙，（因氯化钙对生长无作用，且常形成沉淀物），再以100 加热30min 。用此法制得培养基清晰，无任何沉淀。,
5、4实验动物：以50-60g金地鼠和100-200g豚鼠最敏感。 5抵抗力：对理化（如日光、高温、干燥，酸碱、一般消毒剂、抗生素）很敏感，但对低温抵抗力较强，如可在-20可存活100天，但在中性到偏弱碱性（pH7.0-7.6）较适宜，可在pH 7.2-7.4水中生存1-2月，弱碱性湿土中生存达279天，这在流行病学上有一定意义。,二、流行病学,几乎所有温血动物都可感染钩体。流行病学上意义最大的是鼠、猪、犬、蛙；,动物种类 带菌率 带菌时间 黑线鼠 14.6-28.0% 黄胸鼠 2.4-4.8% 1-2年，甚至终身 黄毛鼠 8.1-34.6% 猪（但放养猪） 5-7% （45.9%） 371天 犬
6、 高 700天 蛙 46天 不详,主要以消化道、还可通过交配、损伤皮肤粘膜、乳汁、精液、尿分别传给仔猪、母猪，也可以吸血昆虫传播，有明显季节性（7-10月为高峰）。,三、症状,猪：主要菌型是波摩那，出血性黄疸和犬型三种； 居于症状首位的是流产及新生仔猪多数归于死亡。 妊娠母猪感染后1-4周流产，常为死胎或弱胎， 产后不久即死亡。流产率可高达半数以上。产木乃伊胎是本病与其它细菌子宫感染区别之一； 哺乳、断奶前后小猪，初似感冒，腹泻，后出现结膜炎（图4）、皮肤黄染（图3）、贫血、头颈或全身水肿（图2），尿色深黄色 ，茶尿病死率很高，架子猪可见体温升高，耳、尾尖皮肤坏死。,图2下颔水肿,图3病猪全身
7、黄胆和水肿,图4眼炎,牛：最初发热、鼻镜干燥、龟裂，皮肤粘膜黄染、贫血，随之出现血红蛋白尿，产乳量下降，乳色变黄，浓如初乳并含有血凝块； 还可见脑炎型：出现兴奋不安，冲向障碍物，自行撞伤，有的运动失常、转圈运动。 妊畜流产。,马：体温升高，出血，黄疸。皮肤干裂、坏死，血红蛋白尿，妊娠马流产； 也有报道脑膜脑炎型； 周期性眼炎：多半两眼同时受害，病马常失明。 犬：以犬型最多见，发热、黄疸，厌食呕吐，腹泻，齿龈口粘膜常见到小溃疡、扁桃体炎，呼出恶臭气体，许多犬表现腹壁紧张，同时肾区有压痛。,五、病变,急性病例，主要为黄疸、出血，血红蛋白尿、肝肾损害，慢性或轻型病例，则以肾的变化为突出 。皮肤、皮下
8、、粘膜、浆膜 ，脏器表面有出血、黄疸，胸腔有黄色积液，膀胱积有血红蛋白尿或浓茶样尿，肝肿大，棕黄色，肾肿大淤血，慢性者有散在灰白色病灶，有的皮肤坏死，有的还在身体各部，（头、颈、背、胃壁）等处出现水肿。,六、诊断,1微生物学检查：发热期、未出现黄疸前，采取血液，发病中后期用尿液（脊髓液不常用），要求在发病后6-10天，死后立即采取（不超过1-3小时，）肝、肾、脾、脑等组织，进行处理后，作暗视野检查或荧光抗体染色镜检，病理组织可用姬姆萨染色或镀银染色后检查。,分离培养：上述材料接种柯索夫氏培养基（需灭活的兔血清），28-30培养，每隔5-7天，需作一次检查，一般720天内开始生长，有时在1-3月
9、才出现，镜检阳性者要及时传代，适应后可2个月传代一次，若需保存毒力，需用动物和培养基交替传代，个别钩体在常用培养基不生长，兼用动物接种分离更好。,3动物接种：采用幼龄豚鼠或地鼠，腹腔接种被检材料2-3ml，隔离饲养观察，污水和尿可用浸泡感染法，动物感染后3-14日发病，应于发热时采取心血检查，或濒死前剖检，观察病变并取肾、肝组织盲传三代。,4血清学诊断 ： 凝溶试验：本试验适于钩体病诊断和菌型鉴定。一般先定性（初筛），将血清作低倍稀释，查明被检血清是否有钩体抗体及群别，后定量，即将血清作进一步稀释，测定凝溶效价及型别，作出诊断。 补反：血清效价在1：20以上有诊断价值，本试验所用抗原具有属特异
10、性，阳性结果只能证明是钩体感染，不能定型，故常用于流行病学调查（感染3天即出现，4周达高峰，持续一年）。,钩端螺旋体的显微镜凝集（显凝）实验 【原理】 钩端螺旋体显凝实验是一种血清学反应，可用已知的抗原（标准菌株）来测定患者血清中的未知抗体及其效价来进行辅助诊断；也可用已知的抗体（标准免疫血清）来鉴定未知菌株的型别作血清学鉴定。钩体运动活泼，在暗视野显微镜下，明显可见，若遇到相应抗体时可发生凝集。如血清中的补体未灭活，时间过久出现凝集的钩体发生溶解，则为钩体的凝（集）溶（解）实验。,【材料】 1、抗原的选择和制备：将我国15群15型钩端螺旋体代表株接种于：Korthof培养液中，28培养57天
11、，暗视野显微镜检查，暗视野显微镜400倍观察每视野下不少于50条，运动活泼且无 自凝者可作显凝抗原。 2、钩体免疫血清（家兔免疫血清）做血清学诊断时用疑似患者的血清。 3、1ml无菌吸管、无菌试管、清洁载玻片及盖玻片、0.9%氯化钠溶液、塑料凹孔板、2428温箱。,【方法】 1、用0.95氯化钠溶液将钩端螺旋体免疫血清自1:50开始，做50倍系列稀释，直到1:1600。 2、取各稀释度免疫血清0.1ml分别加入塑料凹孔板中，最后1孔加0.1ml0.9%氯化钠溶液作对照。 3、每孔加0.1ml钩端螺旋体纯培养物，摇匀，置2830温箱。 4、2小时后用接种环 自各孔中取12环于载玻片上，置暗视野显
12、微镜下观察。,【结果】 先观察阴性对照孔，该孔如出现凝集则实验失败。该孔无凝集时方能观察实验孔，根据凝集程度以“+”记录结果，结果判定参照如下标准进行。 -：完全无凝集，与对照管相同。 +：25% 以上钩端螺旋体凝集呈小蜘蛛状，大多数游离且运动活泼。 + +：50%以上钩端螺旋体凝集呈蜘蛛状，约有半数未凝集。 + + +：75%以上钩端螺旋体凝集呈蜘蛛状，其间有少数游离。 + + + +：几乎全部钩端螺旋体凝集呈巨大蜘蛛状，偶见极少数游离钩端螺旋体存在。 效价判定：出现“+ +”的血清最高稀释度（终末稀释度加入等量抗原后的稀释度）为该血清的凝集效价。测定患者血清时，单份血清效价1：300以上有
13、诊断意义，双份血清呈4倍以上升高时，更有诊断价值。,补体结合反应原理：在补体参与下，以绵羊红细胞和溶血素（红细胞相应抗体）为指示系统的抗原抗体反应。此反应包括两个系统，5种成分。一是被检系统，即已知的抗体（或抗原）和被检的抗原（或抗体）；另一个是指示系统，包括绵羊红细胞和溶血素，以及补体成分。补体用豚鼠新鲜血清。实验方法是先将被检系统的抗原、抗体及补体放入试管中，作用一定时间后，再加入指示系统，继续作用一定时间后，观察结果。,间接凝集（炭凝集、间接血凝、乳胶凝集等）利用钩体属特异性抗原吸附于载体颗粒上，使之成为致敏颗粒抗原，当与被检血清中相应抗体相遇时，则出现肉眼可见的凝集现象，其方法简便迅速
14、，准确性强。 ELISA、荧光抗体法：检出率高，且有早期诊断的优点，有条件单位可试用。 多价菌苗紧急接种诊断，用人用的3-5价菌苗作紧急接种，两周后新病例停止出现，既具有诊断效果，也具有治疗效果。,七、防制,1.做好防鼠、灭鼠和家畜管理工作，消除带菌、排菌的各种动物；清理污染的水源，污水、淤泥、牧地，饲养场、舍，用具，以防扩散传染。 2.选用与当地流行菌型一致的菌苗预防接种，或使用多价浓缩菌苗预防，接种应在本病流行前一月完成，中草药：穿心莲、板蓝天根、金银花、土茯苓，千里光，大青叶有一定预防效果。,3.治疗： 急、亚急性抗菌素疗效不佳，可结合保肝、强心利尿，可用高免血清或多价苗试治，慢性、带菌者可用土霉素、四环素、链霉素等药物治疗 。,THANK YOU!,