食品微生物第九章.ppt

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1、#,1,第九章 传染与免疫,是讨论病原微生物与其宿主间 相互关系的科学,#,2,内容（2学时）,第一节 病原微生物的传染 一、传染与传染病 二、传染结局及其影响因素 第二节 寄主的免疫力 一、非特异性免疫 二、特异性免疫 第三节 血清学反应 一、抗原抗体反应的一般规律 二、主要的抗原抗体反应 三、现代免疫标记技术,#,3,第一节 病原微生物的传染,细菌的感染(bacterial infection)或传染 细菌侵入宿主机体后，进行生长繁殖、释放毒性物质等引起不同程度的病理过程 具体内容：外源或内源的少量寄生物突破其宿主的“三道防线”后，在宿主的一定部位生长繁殖，并引起一系列病理生理过程， 寄生

2、物如果长期保持潜伏状态或亚临床的感染状态，传染病就不至于发生； 如果环境条件有利于寄生物的大量繁殖，并随之产生大量的酶和毒素来损害其宿主，则宿主就患了传染病。,#,4,病原菌pathogen,能使宿主致病的为致病菌 不能造成宿主感染的为非致病菌或非病原菌 有些细菌在正常情况下并不致病，但当在某些条件改变的特殊情况下可以致病，这类菌称为条件致病菌,#,5,正常菌群,正常菌群:自然界中广泛存在着大量的，多种多样的微生物。当人体免疫功能正常时，这些微生物对宿主无害，有些对人还有利，是为正常微生物群，通称正常菌群(normal flora)。 正常菌群的生理学意义： 生物拮抗 营养作用 免疫作用 抗衰

3、老作用,#,6,肠道的正常菌群,健康青年 粪便涂片,健康壮年 粪便涂片,健康 中年 粪便 涂片,#,7,人体常见的正常菌群,#,8,鼻咽腔 葡萄球菌、甲，丙型链球菌 肺炎球菌、奈氏菌、类杆菌等,外耳道 葡萄球菌、类白喉杆菌 绿脓杆菌、非致病性分枝杆菌,表皮葡萄球菌 口腔 甲，丙型链球菌 类白喉杆菌、肺炎球菌 奈氏菌、乳杆菌、梭杆菌 螺旋体、放线菌、白念珠菌,肠道 大肠杆菌、产气杆菌、变形杆菌 绿脓杆菌、葡萄球菌、厌氧性细菌 真菌、乳杆菌，双歧杆菌等,阴道 大肠杆菌、乳杆菌 白念珠菌、类白喉杆菌 非致病性分枝等,皮肽 葡萄球菌、绿脓杆菌、白念珠菌 丙酸杆菌、类白喉杆菌、 非致病性分枝杆菌,人 体

4、 内 正 常 菌 群 的 分 布,眼结膜 白色葡萄球菌、干燥杆菌,尿道 白色葡萄球菌、类白喉杆菌、 非致病性分枝杆菌,#,9,条件致病菌,致病条件,正常菌群与宿主间的生态平衡被打破，原来不致病的正常菌群就成了条件致病菌,1、寄居部位的改变 2、免疫功能低下 3、菌群失调,#,10,一.病原微生物的致病原理,病原微生物要引起机体发生传染，必须具备三个条件： 1.毒力 荚膜能阻止吞噬细胞的吞噬 侵袭力 毒性酶能攻击、损害机体组织 毒力 外毒素(exotoxin)G+分泌到体外的 毒 素 毒性蛋白 内毒素(endotoxin)G-释放的一种脂多糖 2 .数量 3.侵入途径,#,11,毒素,微生物在新

5、陈代谢过程中产生的、对人或动物有毒害的物质，主要由细菌、霉菌产生。 外毒素（Exotoxin） 在病原菌（ G+）生长过程中不断向外界环境分泌的一类毒性蛋白质，属于酶、酶原或毒蛋白。 内毒素（Endotoxin） G-细菌细胞壁外层的组分之一，化学成分为脂多糖（LPS），在活细胞上而不分泌到体外，在细胞死亡自溶后或人工裂解时才释放 真菌毒素,#,12,外毒素与内毒素的主要区别,#,13,内毒素的生物学效应,热源质（Pyrogen） 将内毒素注射到温血动物或人体内后，刺激宿主细胞释放的内源性的Progen 内毒素的性质 生物毒性 化学稳定性：250度干热灭菌2小时 一些注射用药如生物制品、抗生素

6、、葡萄糖液和无菌水,#,14,内毒素的检测,家兔发热试验法 费时、费工、费用大、灵敏度低 鲎试剂法（Limulus assay） 鲎变形细胞溶解物试验法（Limulus amoebocyte Lysate test，LAL test） 鲎、马蹄蟹 开放性血管系统、每只采血100300ml，血清呈现蓝色，含有血蓝蛋白和外源凝集素Lectin 鲎血变形细胞裂解物可与细菌内毒素LPS和磷壁酸发生特异性和高灵敏度的凝胶化反应,#,15,鲎试剂法,#,16,类毒素（Toxoid）,将细菌的外毒素用0.30.4%甲醛溶液进行脱毒处理后，仍保留原有免疫原性（抗原性）的生物制品。 将其注射机体后，可以使机体产

7、生对相应外毒素具有免疫原性的抗体（抗毒素） 常见的类毒素 白喉类毒素 破伤风类毒素 肉毒类毒素,#,17,细菌入侵的数量,与细菌的毒力成反比例,毒力越强，引起感染所需的菌量越小,毒力越弱，引起感染所需的菌量越大,最小感染剂量 引起宿主致病所需要的最少个体数量 Salmonella typhi：108109CFU/宿主 Vibrio cholerae：106CFU/宿主 Shigella dysenteriae：7个/宿主 Yersinia pestis：几个细胞,#,18,细菌入侵的部位,各种致病菌有其特定的侵入部位,与致病菌需要特定的生长繁殖微环境有关,呼吸道感染 消化道感染 创伤感染 接触

8、感染 节肢动物叮咬感染 多途径感染,传播方式与途径,#,19,一.非特异性性免疫（先天免疫，天然免疫） 非特异性免疫机能对多种病原微生物都有一定的防御，没有特殊的选择性，有种的差异，在种内个体之间差别较小 非特异性免疫主要包括： 1.生理性屏障：皮肤、粘膜的机械阻挡；正常菌群的拮抗；血脑屏障，血胎屏障。 2.吞噬细胞： 吞噬细胞的种类：巨噬细胞和大单核细胞，中性粒细胞和嗜酸性粒细胞 巨噬细胞的功能：吞噬作用、抗癌作用、参加免疫应答、分泌活性物质（TNF、IFN、LAF等） 3.正常体液因素（补体、溶菌酶、干扰素）,#,20,第二节 寄主的免疫力,#,21,宿主的免疫防御机制,#,22,大吞噬细

9、胞,屏障机构,吞噬细胞,宿主的免疫防御机制,天然免疫,皮与粘膜,血脑屏障,胎盘屏障,小吞噬细胞,体液因素,补体,溶菌酶,乙型溶素,#,23,机体 各部位的 天然免疫成分,#,24,正常：排除和消灭侵入的病原菌 异常：对病原菌或其他物质发 生强烈反应 正常：排除自身代谢废物和无用细胞 异常：识别紊乱，导致自身免疫疾病 正常：处理突变的自身细胞 （癌细胞） 异常：引起肿瘤,免疫防御,免疫稳定,免疫监视,免疫功能,#,25,#,26,巨噬细胞伸出伪足捕获入侵的大肠杆菌,#,27,#,28,#,29,#,30,二.特异性免疫,特异性免疫是指机体在生活过程中，由侵入机体的抗原刺激形成的一种对该抗原具有特

10、异性的免疫力。 特异性免疫是后天获得的，不能遗传，特异性显著 免疫系统主要包括： 免疫器官 免疫细胞 免疫分子 体液免疫 特异性免疫 细胞免疫,#,31,（一）免疫器官,骨髓 中枢免疫器官 胸腺 法氏囊或类囊器官 淋巴结 外周免疫器官 脾脏,#,32,（二）免疫细胞,T 淋巴细胞（胸腺依赖淋巴细胞）：一种具有免疫活性的小淋巴细胞。成体中起源于骨髓，在胸腺中成熟后分布到外周淋巴器官及外周血中，执行细胞免疫功能。 B淋巴细胞（骨髓依赖淋巴细胞）：骨髓中的多能干细胞通过淋巴干细胞再分化为前细胞。前细胞在哺乳动物的骨髓中或鸟类的腔上囊中再分化成熟为B细胞。 其他淋巴细胞：K细胞、NK细胞、N细胞,#,

11、33,（三）免疫分子及其在体液免疫中的作用,.抗原（antigen ,Ag）免疫原 能刺激人或动物机体产生抗体或致敏淋巴细胞，并能与这些产物在体内或体外发生特异性反应的物质 A.抗原的两重性： 1.免疫原性（抗原性）：能刺激机体形成特异性抗体或致敏淋巴细胞的能力； 2.免疫反应性（反应原性）：能与它所产生的抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应。,#,34,半抗原无免疫原性： 不产生抗体 半抗原获得免疫原性： 完全抗原有免疫反应性： 半抗原有免疫反应性：,免疫机体,Ab,Ab,Ab,#,35,#,36,决定免疫原性的因素,分子大小：一般分子量越大，免疫原性越强 化学组成与结构：芳香族氨基酸越多，免疫

12、原性越强；分子结构越复杂，免疫原性越强。 异物性：抗原来源与宿主的关系越远，抗原性越强。具有异物性的物质分为1)异种物质、2)同种异体物质和3)改变或隐蔽的自身物质。 免疫途径：多数抗原经皮内、皮下、肌注、腹腔、吸入等途径进入体内后免疫原性最强；部分抗原口服也可。 机体应答性： 其它：如抗原的剂量、佐剂的使用，以及机体的年龄、生理状况、个体发育等多种因素有关,#,37,#,38,B. 抗原的性质 分子量大 异物性 结构复杂 特异性 C抗原的种类 （1）根据抗原的免疫性 a/ 完全抗原既有抗原性，又有反应原性。如：大多数蛋白质、细菌细胞、细菌外毒素、病毒、动物血清等 b/ 不完全抗原（半抗原）只

13、具有反应原性而无抗原性的物质。如：青霉素、细菌的荚膜多糖、小分子量的简单有机分子、大多数多糖、核酸、类脂及其降解物。半抗原和蛋白质结合，形成大分子复合物，即成完全抗原。,#,39,C抗原的种类,（1）根据抗原的免疫性 a/ 完全抗原既有抗原性，又有反应原性。如：大多数蛋白质、细菌细胞、细菌外毒素、病毒、动物血清等 b/ 不完全抗原（半抗原）只具有反应原性而无抗原性的物质。如：青霉素、细菌的荚膜多糖、小分子量的简单有机分子、大多数多糖、核酸、类脂及其降解物。半抗原和蛋白质结合，形成大分子复合物，即成完全抗原。,#,40,（2）根据抗原结构分 以细菌为例，可分为： 菌体抗原 整个菌体作为抗原 鞭毛

14、抗原 存在于细菌的鞭毛上（H抗原） 表面抗原 不同的细菌表面抗原，名称不一。 （3）根据抗原的来源不同 内源性抗原 来自自身体内的物质 外源性抗原 来自机体外面的物质，如病原性微生物、动物血清,#,41,抗原的特异性与交叉反应,抗原的特异性是指某一抗原分子只能诱导相应淋巴细胞发生免疫应答的专一性，以及某一抗原分子只能与相应抗体或致敏淋巴细胞特异性结合的专一性。其物质基础是： 抗原决定簇（antigen determinant):是存在于抗原分子的表面、决定抗原特异性的特殊化学基团。它一般由58个氨基酸残基、葡萄糖残基组成；通常一个抗原性物质含有多个抗原决定簇。 抗原结合价：指一个抗原分子上能与

15、相应抗体分子结合的抗原决定簇的总数,#,42,共同抗原：带有共同决定簇的抗原称为。 类属抗原：存在于同一种属或近缘种属间的共同抗原，称为。 异嗜性抗原：指不同种属生物之间的共同抗原。 交叉反应：由共同抗原决定簇刺激机体产生的抗体，可以和所有带有此决定簇的共同抗原起反应，这种反应称为。,#,43,.体液免疫 以抗体为主的特异性免疫，称为体液免疫 抗体：是由抗原刺激机体后而产生的能与抗原发生特异性结合的免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）。Ig主要存在于血液的血清部分，含有抗体的血清叫抗血清或免疫血清。,#,44,1.抗体的种类,人的免疫球蛋白一共有5种类型：IgG、IgA、IgM、I

16、gD、IgE。 2.抗体的结构 5种免疫球蛋白的分子结构基本相同,#,45,#,46,所有的Ig都是糖蛋白。大部分是球蛋白，少数是碳水化合物。 Ig的分子量在15万至100万之间最大的是IgM，分子量为90万 每一个Y型的抗体分子具有两个抗原的结合位点，能与两个抗原决定簇相结合。 如果某种抗原能刺激机体产生几类免疫球蛋白，其在血清中出现的先后次序的规律为： IgM、IgG、IgA、IgD、IgE,轻链,C端,#,47,三、免疫球蛋白的水解片段,木瓜蛋白酶水解IgG 得到两个相同的Fab段和一个Fc段。 胃蛋白酶裂解IgG 得到一个具有双价活性的F（ab）2段和若干个小分子多肽碎片（pFc）,#

17、,48,#,49,#,50,#,51,抗体产生的一般规律,#,52,特异性免疫的获得方式： 1.自然被动免疫 2.自然自动免疫 3.人工被动免疫 4.人工自动免疫,#,53,抗毒素,细胞免疫制剂,人工被动免疫,注射含有特异性抗体的免疫血清或纯化免疫球蛋白抗体，或细胞因子等免疫制剂，使机体获得特异性免疫力,主要生物制品,抗菌血清,胎盘球蛋白,丙种球蛋白,#,54,将疫苗或类毒素接种于人体，使机体获得免疫力的一种防治微生物感染的措施。,人工主动免疫,主要生物制品,死疫苗,活疫苗,类毒素,亚单位疫苗,DNA重组疫苗,核酸疫苗,治疗性疫苗,#,55,比较,人工主动免疫与人工被动免疫,#,56,单克隆抗

18、体：在体液免疫中，由单一抗原刺激机体，只激活一个B细胞克隆（无性繁殖细胞系）而在机体内产生的一种抗体 多克隆抗体：在正常机体内所存在的、由于多种B细胞克隆分别接触相应抗原而产生的多种抗体的总和,#,57,#,58,#,59,第三节 血清学反应 抗原和抗体之间相互作用的方式,血清学反应是指相应的抗原与抗体在体外一定条件下作用，可出现肉眼可见的沉淀、凝集现象。在微生物检验中，常用血清学反应来鉴定分离到的细菌，以最终确认检测结果。,#,60,一 血清学反应的一般特点,特异性 ：抗原抗体的结合具有特异性 可逆性 ：Ag、Ab是分子表面的结合，其复合物相当稳定，但有可逆性。 定比性 ：Ag、Ab是按一定

19、的分子比例结合的，只有比例适合时才会出现可见反应； 条件依赖性：适当的反应条件（温度、ph） 阶段性：反应可分为两个阶段，时间短，不可见；可见，时间较第一阶段长,#,61,抗体攻击抗原（中间是抗原）,#,62,#,63,三、血清学反应的类型,1）凝集反应 2）沉淀反应 3）补体结合反应,#,64,1凝集反应Agglutination,颗粒性抗原（细菌、红细胞等）与相应抗体结合，在电解质参与下所形成的肉眼可见的凝集现象，称为凝集反应（Agglutination reaction）。其中的抗原称为凝集原，抗体称为凝集素。在该反应中，因为单位体积抗体量大，做定量实验时，应稀释抗体。,#,65,）直接

20、凝集反应,颗粒性抗原如细菌和细胞与相应抗体直接结合所出现的反应，称为直接凝集反应(Direct agglution reaction)。,#,66,a.玻片凝集法,是一种常规的定性试验方法。原理是用已知抗体来检测未知抗原。常用于鉴定菌种、血型。如将含有白叶枯病菌抗体的血清与待检菌液各一滴，在玻片上混匀，数分种后若出现肉眼可见的凝集块，即为阳性反应，证明该菌是痢疾杆菌。此法快速、简便，但不能进行定量测定,#,67,一种塑料试验板,#,68,b.试管凝集法,是一种定量试验方法。多用已知抗原来检测血清中有无相应抗体及其效价。因为要测定抗体的含量，故将待检查的血清用等渗盐水倍比稀释成不同浓度，然后加入

21、等量抗原，37，24小时后观察，血清最高稀释度仍有明显凝集现象的，为该抗血清的凝集效价。,#,69,试管凝集法示意图,#,70,c. Microtiter Agglutination 微皿板（96孔板）凝集法,1) Microtiter plates are plastic and usually contain 96 wells 2) More efficient way to do assay as opposed to tubes,#,71,微皿板凝集法示意图,#,72,）间接凝集反应,将可溶性抗原（抗体）先吸附在一种与免疫无关的，颗粒状微球表面，然后与相应抗体（抗原）作用，在有电解质存

22、在的条件下，即可发生凝集，称为间接凝集反应(Indirect agglutination)。 由于载体增大了可溶性抗原的反应面积。当载体上有少量抗原与抗体结合。就出现肉眼可见的反应，敏感性很高。,#,73,2、沉淀反应,可溶性抗原与相应抗体结合，在有适量电解质存在下，经过一定时间，形成肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应（Precipitation）。反应中的抗原称为沉淀原，抗体为沉淀素。 由于在单位体积内抗原量大，为了不使抗原过剩，故应稀释抗原，并以抗原的稀释度作为沉淀反应的效价。,#,74,）环状沉淀反应：,是一种定性试验方法，可用已知抗体检测未知抗原。将已知抗体注入特制小试管中，然后沿管壁徐徐

23、加入等量抗原，如抗原与抗体对应，则在两液界面出现白色的沉淀圆环。,#,75,环状沉淀反应示意图,#,76,）絮状沉淀反应：,将已知抗原与抗体在试管（如凹玻片）内混匀，如抗原抗体对应，而又二者比例适当时，会出现肉眼可见的絮状沉淀，此为阳性反应。,#,77,四、实用血清学检测方法,除上述玻片凝集法、环状沉淀法外最常用的有琼脂扩散法、ELISA、免疫电泳法和免疫荧光法,#,78,1、琼脂扩散法,利用可溶性抗原抗体在半固体琼脂内扩散，若抗原抗体对应，且二者比例合适，在其扩散的某一部分就会出现白色的沉淀线。每对抗原抗体可形成一条沉淀线。有几对抗原抗体，就可分别形成几条沉淀线。 琼脂扩散可分为单向扩散和双

24、向扩散两种类型。 单向扩散是一种定量试验。可用于免疫蛋白含量的测定。 而双向扩散多用于定性试验。由于方法简便易行，常用于测定分析和鉴定复杂的抗原成分。,#,79,琼脂单扩散试验示意图,#,80,琼脂双扩散试验示意图,#,81,琼脂双扩散试验结果,#,82,Agar gel diffusion test,左图示抗体与样本都起反应 右图示抗体只与一个样本反应,#,83,2、 ELISA (enzyme linked immuno-sorbent assay) 酶联免疫吸附实验,1) One of the most sensitive reactions 2) Easy to set up and

25、run 3) Commonly used in diagnostic applications,#,84,现代免疫标记技术 免疫标记技术（immunolabelling technique）：是将抗原或抗体用荧光素、酶、放射性同位素或电子致密物质等加入标记，借以提高其灵敏度的一类新技术 优点：特异性强，灵敏度高，应用范围广，反应速度快，易观察，能定性、定量、定位,#,85,酶免疫测定（enzyme immunoassay,EIA） 又叫免疫酶联法，用酶标记的抗体或抗抗体来进行抗原抗体反应的技术 酶标抗体或抗抗体进行抗原抗体反应后，用酶的特殊底物处理标本，由于酶的催化作用，可使原来无色的底物通过

26、反应而显示颜色 优点： 反应产生的颜色，可用肉眼或普通光镜观察 标本经酶标抗体染色后，还可用其它染料复染： 特异性强 ； 灵敏度高 ； 可长期保存,#,86,酶联免疫吸附实验（ELISA） 一.间接法,已知抗原 封闭无关抗原 待测抗血清 酶标记抗抗血清（第二抗体） 加酶的底物，显色剂 显色，测定,#,87,酶联免疫吸附试验法（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA） （1）双抗体法（夹心法，三明治法） 检测标本中是否含特定抗原 （2）间接法 检测血清中是否含特定抗体,#,88,二.夹心ELISA,已知抗体 封闭无关抗体 待测抗原 酶标记抗体（第二抗体） 底物，显色液 显色， 测定,#,89,双抗体夹心ELISA法示意图,#,90,双抗体夹心ELISA法示意图,#,91,双抗体夹心ELISA捕获试验,#,92,