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1、第三章 高效液相色谱分析,高效液相色谱法：以气相色谱为基础，在经典液相色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法,一、HPLC与经典LC区别 二、HPLC与GC差别 三、高效液相色谱仪流程图 四、特点及应用,一、HPLC与经典LC区别,主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段,1经典LC：仅做为一种分离手段 柱内径13cm，固定相粒径100m 且不均匀 常压输送流动相 柱效低（H，n） 分析周期长 无法在线检测 2HPLC：分离和分析 柱内径26mm，固定相粒径10m（球形,均匀装柱） 高压输送流动相 柱效高（H，n） 分析时间大大缩短 可以在线检测,二、HPLC与GC差别,相同：兼具分离和分析
2、功能，均可以在线检测 主要差别：分析对象的差别和流动相的差别,1分析对象 GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品， 高沸点、挥发性差、热稳定性差、 离子型及高聚物的样品不可检测 占有机物的20% HPLC：溶解后能制成溶液的样品， 不受样品挥发性和热稳定性的限制 相对分子质量大、难气化、热稳定性差及高分子 和离子型样品均可检测 用途广泛，占有机物的80%,2流动相差别 GC：流动相为惰性气体 组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用 HPLC：流动相为液体 流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、 改善分离度增加了因素，对分离起很大作用 流动相种类较多，选择余地广 流动相极性和pH值
3、的选择也对分离起到重要作用 选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 可以增大分离选择性,3操作条件差别 GC：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小） 提高柱内填料装填的均匀性,减小粒度,三、高效液相色谱仪流程图,灵敏度高，重复性好、线性范围宽、死体积小以及对温度和流量的变化不敏感,高效液相色谱仪的色谱柱,4.6mm或3.9mm,球形填料,不规则形填料,510m,空柱管: 200-300元 国产填料 国产装填 = 800-1000 元 进口填料 国产装填 = 1200-1500 元 原装 进口柱 = 2400-3000 元,HPLC 柱 = 空柱管 + 填料(分离介质),价格
4、?,高效液相色谱仪的生产厂家,Waters,Agillent,Shimadz,Perkin Elmer,Varian,大连依利特公司,北京东西电子研究所,制造商,高效液相色谱仪LC-2010HT 岛津（香港）有限公司,新一代液相色谱Alliance,Alliance,返回,四、HPLC的特点和应用,“三高” “一快” “一广”,高柱效(n=3万片/米), 柱效高（远高于一般LC） 高灵敏度(紫外检测器最小检出量达纳克级) 高压(150*105350*105Pa) 分析速度快 应用范围广泛（可分析80%有机化合物）,HPLC应用,医药方面：生物组织 、血样、尿样分析，药剂组 分测定，药物生产控
5、制，药代研究。 生化方面：主要用于氨基酸、蛋白质、酶、糠尿。 食品方面：果汁，饮料，酒类等中的添加剂。 环境方面：饮用水，废水中质量标准的控制。 大气、土壤污染研究,正常对照组Fig 2 (control group) 诱导后3天组(Hydrocephalus ofthe3day),诱导后8天组 (Hydrocephalus of the 8day) 诱导后4月组(Hydrocephalus of the 4 month),狗脑积水不同时期脑组织中肌酸、磷酸肌酸及磷酸腺苷酸的含量变化,Cr,Cr,Cr,Crp,Cr,Crp,Crp,AMP,AMP,AMP,AMP,ADP,ADP,Crp,ADP
6、,ATP,ATP,ATP,ATP,ADP,HPLC法分析心脏衰竭过程中黄连素对心脏能量的保护作用,标准色谱图 心肌样品色谱图,Cr,Crp,AMP,AMP,Cr,Crp,ADP,ADP,ATP,ATP,标准品色谱图 对照组色谱图 FDP组色谱图,Crp,Crp,Crp,ATP,ATP,ATP,HPLC法分析人的心脏换瓣术中1，6-二磷酸果糖 对高能磷酸复合物含量的影响,HPLC法分析大鼠脑缺血再灌注后肌酸、腺苷和三磷酸腺苷的含量变化,标准色谱图 脑组织样色谱图,ATP,ATP,ADO,ADO,Cr,Cr,HPLC法分析经缺血预处理后大鼠移植肝脏中三磷酸腺苷的含量变化,肝组织样色谱图 标准色谱图
7、,ATP,AMP,AMP,ATP,ADP,ADP,健康人空白血清色谱图 给药后人血清色谱图,HPLC法测定健康人血清中的头孢唑啉(CEZ),CEZ,HPLC法测定肺癌患者血清中维生素A、维生素E番茄红素、 -胡萝卜素,标准色谱图 血清样色谱图,VA,VA,VE,VE,L,L,HPLC法测定中草药提取物中紫杉醇的含量,对照品色谱图,样品色谱图,紫杉醇,紫杉醇,1,2,3,4,5,大鼠尿中83-1除草剂及其代谢产物的HPLC分离图,空白尿样 染毒尿样,*,1,大鼠肝微粒体中叶枯灵及其代射产物分离的HPLC色谱图,a,b,a. 对照组 b.样品组,大鼠肝灌流中叶枯灵、代谢产物及其内标的色谱图,(7)
8、,*,*,*,二、食品、药物的分析,1,3,2,3,1,1,3,5,5,5,4,蕹菜 冬苋菜 对照品,HPLC法测定9种蔬菜中的类胡萝卜素,HPLC法测定中药辛弗林的含量,标准品色谱图,样品色谱图,辛弗林,辛弗林,HPLC法测定血清中延胡乙素的血药浓度,样品色谱图,对照品色谱图,延胡乙素,延胡乙素,对照品色谱图,样品色谱图,HPLC分析银杏叶提取物中懈皮素及总黄酮的含量,懈皮素,懈皮素,山萘酚,异鼠李素,MECC分离中药黄芩中六种黄酮类成份,P106：解：二者都是根据样品组分与流动相和固定相,相互作用力的差别进行分离的。 从仪器构造上看，液相色谱需要增加高压泵以提高流动相的流动速度，克服阻力。同时液相色谱所采用的固定相种类要比气相色谱丰富的多，分离方式也比较多样。气相色谱的检测器主要采用热导检测器、氢焰检测器和火焰光度检测器等。而液相色谱则多使用紫外检测器、荧光检测器及电化学检测器等。但是二者均可与MS等联用。 二者均具分离能力高、灵敏度高、分析速度快，操作方便等优点，但沸点太高的物质或热稳定性差的物质难以用气相色谱进行分析。而只要试样能够制成溶液，既可用于HPLC分析，而不受沸点高、热稳定性差、相对分子量大的限制。,