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1、实验五 碱性磷酸酶米氏常数的测定,一、目的要求,1.学习分光光度法测定的原理和方法 2.学习和掌握米氏常数（Km）及最大反应速度（Vm）的测定原理和方法，测出碱性磷酸酶在以对硝基苯酚磷酸为底物时的Km 和Vm值。,二、原理,一、分光光度法的基本原理及方法 （一）利用吸收光谱对物质进行定性分析 1原理,2主要方法： （1）比较吸收光谱曲线 （2）比较最大吸收波长 蛋白质的最大吸收波长为280nm，核酸的最大吸收波长为260nm。 1.苯丙氨酸 2.酪氨酸 3.色氨酸,（3）比较吸光度的比值 纯DNA,（二）利用吸收光谱对物质进行定量分析 1原理 Beer-Lambert（比尔）定律： T=I/I
2、0 A=lg1/T=lgI0/I A=KCL 其中：T为透光率；A为吸光率；I0为入射光强度；I为透射光强度； K为吸收系数；C为溶液浓度；L为溶液光程的厚度,2常用方法 （1）标准曲线法 OD或 浓度 标准曲线与样品的测定条件必须一致。,（2）标准管法 CX/AX=CS/AS，已知CS，测定AS、AX，可求得CX。 （3）摩尔吸光系数法 C=A/（为L=1cm，C为1 mol/L时的吸光系数，也称为摩尔吸光系数。,(三)米氏常数的测定原理,酶促反应v-S曲线 v S 推导出米氏方程为： 其中S为底物浓度；v为初速度；Vm为最大反应速度；Km 为米氏常数,米氏常数Km是酶的一个基本特征常数，它
3、包含着酶与底物结合和解离的性质。特别是同一种酶能够作用于几种不同底物时，米氏常数Km往往可以反映出酶与各种底物的亲和力的强弱。 测定Km和Vm，可通过作图法求得。 最常用的Lineweaver-Burk双倒数作图法。这个方法是将米氏方程转化为倒数形式，即： 以1/v对1/S作图，可得一条直线,1/v 1/Vm -1/Km 1/S 本实验测定碱性磷酸酶催化对硝基苯磷酸钠盐(pNPP)水解的Km和Vm. 反应式：pNPP+H2O pNP+HPO42- 无色 黄色 可通过分光光度法测定产物pNP的含量，求出反应速度v。,三、试剂与器材 试剂： 0.5mol/mL pNP 、10 mmol/L pNP
4、P、20 mmol/L MgCl2、0.1 mol/L 碳酸钠碳酸氢钠 pH 10.1缓冲液、0.1 mol/L NaOH、6 mg/mL碱性磷酸酶酶液 器材：恒温水浴锅、722分光光度计,四、分光光度计的使用,1722型分光光度计的外形,2.仪器操作键介绍 “方式设定”键（MODE）：用于设置测试方式 “100%T/0ABS”键：用于自动调整100.0%T(100.0透射比)或0ABS(零吸光度) “0%T”键：用于自动调整零透射比 “波长设置”旋钮：用于设置分析波长,3.样品测试操作 打开电源开关，使仪器预热20分钟 用“波长设置”按钮将波长设置在您将要使用的分析波长位置上 打开样品室盖，
5、将挡光体插入比色皿架，并将其推或拉入光路 盖好样品室盖，按“0%T”键调透射比零 取出挡光体，盖好样品室盖，按“100%T”调100%透射比 按“方式键”（MODE）将测试方式设置为吸光度方式(A) 将参比溶液和被测溶液分别倒入比色皿中 打开样品室盖，将盛有溶液的比色皿分别插入比色皿槽中，盖上样品室盖 将参比溶液推入或拉入光路中，按“100%T”调零A 将被测溶液拉入光路中，此时，显示器上所显示是被测样品的吸光度参数 实验完成后，关闭电源，洗净比色皿，并盖好盖布。,返回,返回,返回,五、操作方法,（一）对硝基苯酚标准曲线的制作 取5支试管编号,0号一支,17号各二支,按下表操作： 管 号 0
6、1 2 3 4 5 6 pNP含量 (mol) 0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.5mol/mL pNP (mL) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 H2O (mL) 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 Na2CO3-NaHCO3 (mL) 各管加入1.0 mL 20 mmol/L MgCl2 (mL) 各管加入0.2 mL 0.1 mol/L NaOH (mL) 各管加入2.0 mL OD 405 nm 以对硝基苯酚的绝对量(mol数)为横坐标，OD405nm值为纵坐标，绘制标准曲线。求出pNP的克分子消光系数()值。,
7、(二）测定 15支试管，1-5做两组平行测定管，01-05作为空白对照。 No. 1 2 3 4 5 底物终浓度S (mM ) 0.5 0.75 1.0 1.5 3 10 mmol/L pNPP（mL ） 0.1 0.15 0.2 0.3 0.6 蒸馏水（mL ） 0.5 0.45 0.4 0.3 0 碳酸盐缓冲液（mL ） 各加1.0 mL 20 mmol/L MgCl2 （mL ） 各加0.2 mL 预热 混匀，37，5分钟 酶液（mL ） 测定管各加0.2 mL酶液 反应时间 37，精确反应10分钟 0.1 mol/L NaOH（mL） 各加2 mL 酶液（mL ） 空白管各补加0.2
8、mL酶液 OD405,（三） 数据处理 各管在722分光光度计测定波长405nm的OD值(OD405nm)。从对硝基苯酚标准曲线上查出OD405nm相当于产物对硝基苯酚的含量(mol数),计算出各种底物浓度下的初速度vo（单位以molL-1min-1表示），取倒数1/v填入表内。以1/v对1/S作图，求出酶催化pNPP水解的米氏常数Km和最大反应速度Vm。,六、 注意事项 取液量一定要准确。 反应时间一定要精确。 加酶前后一定要将试剂混匀。 空白对照一定要先加NaOH，后加酶。 测定OD405时要以各自的空白调零点。 移液管或取液器的使用 比色杯的使用,返回,返回,七、思考题 (1) 试说明米氏常数Km的物理意义和生物学意义。 (2)为什么说米氏常数Km是酶的一个特征常数而Vm则不是？,