大赛璐手性分析方法筛选与优化.ppt

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1、业界之最,享誉全球,手性分析方法筛选与优化,主要内容,手性色谱基础和大赛璐手性柱 涂布型正相手性分析方法开发 涂布型反相手性分析方法开发 化学键合型手性分析方法开发 常见手性分析问题与注意事项,液-液萃取法,生物催化法 不对称合成法,膜分离法,传感器法,结晶法,毛细管电泳,色谱法,手性分离方法,手性色谱技术,超临界 (SFC),气相色谱（GC）,薄层色谱（TLC）,逆流色谱（CCC）,模拟移动床 (SMB),高效液相色谱（HPLC）,色谱法,手性色谱技术,对映体纯度测定方法及其比较,几十毫克,样品用量,需要其它的手性化合物来制备非对映体,需要真实样品,手性色谱固定相法基本原理,操作简单 不需要

2、预处理 准确度高,引入手性环境是实现手性分离的前提,Daicel手性色谱柱一览表,正相 直链淀粉衍生物 CHIRALPAK AD / AD-H/AD-3 CHIRALPAK AS / AS-H/AS-3 CHIRALPAK AY-H/AY-3 CHIRALPAK AZ-H/AZ-3 纤维素衍生物 CHIRALCEL OD / OD-H/OD-3 CHIRALCEL OJ / OJ H/OJ-3 CHIRALCEL OZ H /OZ-3 CHIRALCEL OA, OB, OC CHIRALCEL OF, OG, OK CHIRALCEL CA-1,反相 CHIRALPAK AD -RH/AD-

3、3R CHIRALPAK AS RH/AS-3R CHIRALCEL OD-RH/OD-3R CHIRALCEL OJ RH/OJ-3R CHIRALPAK AY RH/AY-3R CHIRALCEL OZ RH/OZ-3R,其它 Chiral -AGP CROWNPAK CR (), () CHIRALPAK OT(), OP () CHIRALPAK WH, MA () CHIRALPAK QD-AX CHIRALPAK QN-AX,共价键合型 CHIRALPAK IA/IA-3 CHIRALPAK IB/IB-3 CHIRALPAK IC/IC-3,大赛璐固定相： USPEP中国药典,涂

4、布型正相手性柱： 手性分析方法的建立和优化,分析条件优化流程图 (1),酸性,中性,碱性,1. 确认流动相中是否使用酸、碱添加剂,配制流动相,Hex/IPA/TFA =70/30/0.1,Hex/IPA/DEA =70/30/0.1,Hex/IPA =70/30,样品,碱性样品,添加物在分离中的作用,Hex/IPA/DEA=90/10/0.1,流量：1.0mi/min. 温度：25、检测波长：（254）,流动相 Hex/IPA=90/10,Hex/IPA/AcOH=90/10/0.1,流动相 Hex/IPA=90/10,流量：1.0mi/min.温度：40、检测波长：（254）,酸性样品,（没

5、出峰 ),（无法分离 ),添加物的种类和用量,*1 主要用于1级胺 *2 主要用于1级氨基醇,Column: AY-H (4.6*150mm) Temp: 35 Flow:2.0ML/MIN Mobile phase: CO2/IPA/DEA =85/15/0.1,不同添加剂对手性分离的影响,Column: AY-H (4.6*150mm) Temp: 35 Flow:1.2ML/MIN Mobile phase: CO2/IPA/1-propylamine =85/15/0.1,对于一些特殊的样品：酸碱添加剂同时添加，优化分离,Column: OZ-H (4.6*150mm) Temp: 3

6、5 Flow: 1.0 ml/min Mobile phase:hexane/IPA/DEA(75/25/0.1),Column: OZ-H (4.6*150mm) Temp: 35 Flow: 1.0 ml/min Mobile phase:hexane/IPA/TFA(85/15/0.1),Column: OZ-H (4.6(150mm) Temp: 35 Flow: 1.0 ml/min Mobile phase: hexane/IPA/TFA/DEA(80/20/O.1/0.05),分析条件优化流程图 (2),保留时间?,长,适宜的分析时间 (10-30 min.),短,增加 异丙醇,

7、增加 正已烷,2. 配制好流动相,选择合适的手性柱,分析,分析条件优化流程图 （3）,没有分离,部分分离,3. 选择合适的手性柱,尝试别的手性柱,OK!,基线分离,继续优化分析条件,分离？,筛选结果,色谱条件 流动相： Hex./IPA/ AcOH = 90/10/0.1 流量 ：1.0ml/min. 温度 ：40 检测波长 ：UV254nm 样品 ：,选择效果最好的手性柱, 然后继续优化分析条件,分析条件优化流程图 （4-A）,部分分离,A.降低异丙醇浓度,B. 调整温度,C. 更换醇类,4.分析条件继续优化,醇浓度的影响,在多数情况下，降低醇的浓度可延长保持时间，改善分离度,Column：

8、AD, Temp.：40, Flow rate：1.0ml/min.,Hex./IPA/ AcOH =90/10/0.1,Hex./IPA/ AcOH =100/1/0.1,Sample：Flurbiprofen,部分分离,B. 调整温度,C. 更换醇类,4.分析条件继续优化,分析条件优化流程图 （4-B）,A.降低异丙醇浓度,温度的影响,Column：CHIRALPAK AD Mobile phase： Hex./IPA/ AcOH =90/10/0.1, Flow rate：1.0ml/min.,25,40,Temp.： 5,降低柱温可增大值，但会使峰形变宽 升高柱温会减少值，但会使峰形尖

9、锋,Temp.： 25 Rs: 1.99,Temp.： 20 Rs: 2.78,Temp.： 15 Rs: 3.56,温度的影响,Column: CROWNPAK CR(+) (4.6*150 mm) Mobile phase: PH=1.0高氯酸 Flow: 0.3 ml/min Sample: 苏氨酸,部分分离,C.更换醇类,B. 调整温度,4.分析条件继续优化,A.降低异丙醇浓度,分析条件优化流程图 （4-C）,由异丙醇换为乙醇-选择性增大,Hex./IPA/AcOH=90/10/0.1,IPA和EtOH有时会使峰形和值发生明显变化,Column：CHIRALPAK AD Temp.：4

10、0, Flow rate：1.0ml/min.,Sample：Flurbiprofen,Hex./EtOH/AcOH=95/5/0.1,由异丙醇换为乙醇-更好的选择性,Column: AY-H (4.6X250mm) Temp: 35 Flow:1.0 ml/min Mobile phase:hexane/IPA/DEA(90/10/O.1),Column: AY-H (4.6X250mm) Temp: 35 Flow:1.0 ml/min Mobile phase:hexane/EtOH/DEA(90/10/O.1),IA-H80I20DEA0.1-1.0mlmin-35,IA-M100DE

11、A0.1-1.0mlmin-35,OZ-H，Hexane/IPA /TFA/DEA= 80/20/0.1/0.05（v/v/v)，1.0 ml/min,极性模式-意想不到的分离效果,OZ-H，MeOH/DEA=100/0.1（v/v)， 0.8 ml/min,涂布型正相柱手性方法开发流程,根据样品性质判断是否需要往流动相中加添加物 调整正己烷/醇的比例，从而选择适当的保留时间 优化方法 流动相的醇浓度 降低醇的浓度能改善分离度，但会延长分析时间 色谱柱温度 降低柱温能增加值，但会使峰形变宽 流动相中醇的种类 改换醇的种类(IPAEtOH)，有时会使选择性发生一些变化,化学键合型多糖手性柱： 手

12、性分析方法的建立和优化,涂敷型（溶剂限制） 正相: 正己烷, 异丙醇, 乙醇 反相: 水, 乙腈, 甲醇, 乙醇, 异丙醇,在广泛的流动相条件下具有很强的手性分离能力 色谱试验过程中，用于溶解样品的溶剂没有任何限制 在各种溶剂中柱性能异常稳定,键合型（通用所有溶剂）,CHIRALPAK IA/IB/IC,CHIRALPAK IA/IB/IC研发背景,CHIRALPAK IA, IB, IC,AD,OD,New!,键合型固定相的特点,流动相组分没有任何限制 可以选用任何有机溶剂溶解样品 新的手性选择性 可以再生，寿命长 正相与反相可以在同一支柱子上实现,AD-H vs. IA,对于一些化合物，分

13、离度可能优于涂布型,分离度优于涂布型实例,Column: AD-H (4.6X250mm) Temp: 35 Flow:1.0 ml/min Mobile phase: hexane/IPA/DEA (90/10/0.1),Column: IA (4.6X150mm) Temp: 35 Flow:1.0 ml/min Mobile phase: hexane/IPA/DEA (90/10/0.1),AD-H vs. IA,由于在流动相中改善了溶解度，柱效优于涂布型,Column: AD-H (4.6X250mm) Temp: 35 Flow: 1.0 ml/min Solubility: 0.

14、5 mg/ml Mobile phase: hexane/IPA (70/30),Column: IA (4.6X250mm) Temp: 35 Flow: 1.0 ml/min Solubility: 7.0 mg/ml Mobile phase: MtBE/MeOH (80/20),AD-H vs. IA,OD-H vs. IB,更高的柱效，更好的峰形,Chromatographic Condition: Hexane/IPA, 90/10 (v/v),通过溶剂多样性优化手性分离,OD-H vs. IB,IB含水流动相,非水与水相体系通用,不同流动相体系下手性分离,CHIRALPAK IA

15、柱应用实例,IA,IB,IC柱的修复再生,IA,IB,IC柱的修复再生,IA柱的修复再生方法：,IA,IB,IC柱的修复再生,IB IC柱的修复再生方法：,键合型固定相筛选一般流程,选用比较典型的溶剂组合作为起始筛选流动相 Hexane/IPA（EtOH） Hexane/THF(DCM, EA) MtBE/ MeOH (IPA,EtOH） MtBE/ THF(DCM, EA) ACN/ MeOH (IPA,EtOH） 如果分析物的溶解度不好，优先选用溶解度好的有机溶剂作为流动相组分 使用多元流动相优化分离,多糖反相手性柱： 手性分析方法的建立和优化,RH系列反相色谱柱参数,*1 有机溶液：醇（

16、甲醇，乙醇，异丙醇）或乙腈 *2 pH7使用时，温度在525 *3 pH超过8时，使用硼酸缓冲液,新产品： AY-RH / OZ-RH,根据样品性质选择流动相,HPLC-MS: 流动相条件 1） 酸性流动相： 甲酸、乙酸 2） 碱性流动相： 碳酸氢氨（醋酸铵，甲酸铵）,RH 反相系列手性筛选一般流程,反相流动相的pH值对分离度的影响 (AS-RH ),水溶液,水溶液/CH3CN=60/40 流速：1.0ml/min.,水溶液/CH3CN=60/40 流速：1.0ml/min.,水溶液/CH3CN=80/20 流速：0.5ml/min.,0,5,10,15,mV,0,2,4,6,8,10,12,

17、14,Minutes,7.16,8.77,水,磷酸水溶液 (pH2),硼酸缓冲液 (pH9),0,5,10,15,20,mV,0.0,2.0,4.0,6.0,8.0,Minutes,4.17,4.69,0.0,2.0,4.0,6.0,8.0,0,5,10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,Minutes,30.74,36.78,有机溶剂种类对分离的影响,水/乙腈 =50/50,水/乙醇 =35/65,水/甲醇 =25/75,2-Methyl-1-tetralone,2-Phenyl-2-butanol,手性柱： CHIRALPAK AD-RH 、流速：0.5ml/mi

18、n、温度：25,反相柱分析条件优化的总结,根据样品性质选择流动相 中性，酸性样品对4种反相柱的流动相是一致的。 但是，碱性样品对OD-RH、OJ-RH的流动相和AD-RH、AS-RH的流动相是不同的。 探索适当的保留时间和流动相组成 其它优化条件 水溶液和有机溶液比例 多数情况下降低有机溶液的浓度能改善分离，但会延长分析时间。 色谱柱温度 降低柱温能增加值，但会使峰形变宽。 有机溶剂的种类 有机溶剂的种类不同，其洗脱强度也不同。有时其分离效果也发生一些变化,手性分析方法开发： 高通量、快速筛选,手性色谱柱组合筛选,手性色谱柱组合 CHIRALPAK AD-H CHIRALPAK AS-H CH

19、IRALCEL OD-H CHIRALCEL OJ-H CHIRALPAK AY-H CHIRALCEL OZ-H CHIRALPAK IA CHIRALPAK IB CHIRALPAK IC 手性色谱柱尺寸： 0.46cmI.D.15cmL,组合筛选设备,IPA,泵,紫外检测器,色谱柱自动切换阀,流动相2,自动进样器,组合筛选设备示意图,流动相1,溶剂切换阀,旋光检测器,串联旋光检测器的好处 1,1.用UV检测器只出现“峰”的时候 应用旋光检测器可确认其分离状况,2. 可确认洗脱顺序,串联旋光检测器的好处 2,若筛选没得到理想的分析条件时,调整流动相中醇的比例 更换流动相种类 调整流速 调整

20、温度 尝试其他的色谱柱,手性色谱柱使用： 注意事项与疑难解析,Daicel大部分手性柱是涂敷型产品，在市场上具有独特性。 若导入错误的溶剂(CH2Cl2、乙酸乙酯、甲苯等)，柱子会马上被破坏。 当流动相或样品溶液导入错误的溶剂时，柱压剧增，分离突然变差。 一旦错误地使用了溶剂，重新恢复柱子性能的可能性很低。 若您遇到此类分析故障，请对照出厂报告重新确认柱子的性能或与大赛璐联系,常见使用故障-溶剂错误 1,Daicel正相手性柱的流动相和样品溶液不能使用水溶液 若不小心导入水，柱子不会彻底受损。 只需要使用色谱级无水乙醇低流速将水置换出来。,常见使用故障-溶剂错误 2,将手性柱接入液相色谱仪之前

21、,所有溶剂入口,泵,泵与进样阀之间,定量环,进样阀清洗液,进样阀与柱子之间,柱子与检测器之间,检测器,使用前彻底清洗管路,1.用水将HPLC所有管路彻底清洗（去除管路的无机盐） 2.用异丙醇将HPLC所有管路彻底清洗 （去除水） 3.用流动相将HPLC所有管路彻底清洗（置换醇）。,流动相或样品溶液过滤不彻底，固体颗粒堵塞管路或柱头，会引起柱压过高。 样品中成分在柱头析出或强烈吸附，会引起柱压升高。 流速过快，会引起柱压过高，特别是当使用粘度高的溶剂， 如IPA, EtOH，流速应控制在0.1-0.3 ml/min,每种柱子有特定的承压范围，请仔细参照相应的色谱柱说明书。 彻底过滤流动相及样品溶

22、液。 样品预处理 更换流动相时，或者刚把柱子刚接上仪器的时候，逐步增加流速 仪器设定保护柱压,原因：,后果：,长期超压会引起柱头塌陷，反压上升，柱效下降。,解决方法：,压力,残留物在普通流动相中可长时间地稳定保留 用醇洗涤可除去大部分的碱性残留物 用酸洗涤也可除去碱性残留物 用碱洗涤可除去酸性残留物,如何避免“残留效应”, 欢迎您访问！,谢谢!,上海总部 地址: 上海市外高桥保税区希雅路69号16号楼5层 C部 (200131) 电话：021-5046-0086 传真：021-5046-2321 邮箱： 网址： ,北京分室 地址: 北京市昌平区生命科学园路29号中关村生命 科学园创新大厦C-座-001B室 （102206） 电话：010-8071-3195 邮箱： 网址： ,