高中生物选修一的课件集.ppt

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1、人教版高中生物选修1生物技术实践,专题1 果酒和果醋的制作,一、制作果酒果醋的微生物：,酵母菌真菌,醋酸菌细菌,二、两种微生物的分类地位,1.制作果酒酵母菌 2.制作果醋醋酸菌,控制空气的一些措施,三、繁殖方式和代谢类型,出芽生殖,二分裂生殖,四、制作原理和发酵条件的比较,酵母菌 制酒,制作果酒（前期需氧，后期厌氧）,出芽生殖， 增加酵母菌数量,产生酒精,1、若氧气、糖源充足时，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解成醋酸，其反应式：,醋酸菌 制醋,制作果醋（一直需要氧）,五、实验流程示意图,1、材料的选择与处理 选择新鲜的葡萄，榨汁前先将葡萄进行冲洗，除去枝梗。 、取葡萄500g，去除枝梗和腐烂的叶子。

2、、用清水冲洗葡萄12次除去污物。 讨论：你认为应该先冲洗葡萄还是先除去枝梗？为什么？ 应该先冲洗，然后再除去枝梗，以避免除去枝梗时引起葡萄破损，增加被杂菌污染的机会,六、实验操作,2、清洗（WHY？）,3、榨汁 将冲洗除枝梗的葡萄放入榨汁机榨取葡萄汁。 4、发酵：发酵装置如下,5、注意事项,将葡萄汁装人发酵瓶， 要留大约13的空间 (如图右图所示)，并封 闭充气口。（为什么？）,塑料瓶中不能装满葡萄液汁，应留一定空间，有利于酵母菌有氧呼吸大量繁殖形成种群优势。,防止榨汁机、发酵瓶带菌引起发酵液污染,70%酒精消毒,制葡萄醋的过程中，要适时通过充气口充气。 将温度严格控制在3035， 时间控制在

3、前78d左右。,制葡萄酒的过程中，要严格密闭， 将温度严格控制在1825， 时间控制在1012d左右，可通过出料口对发酵的情况进行。及时的监测。,专题2 微生物的培养与应用,课题1 微生物的实验室培养,.微生物的类群,微生物,原核类:,真核类,非细胞类：,细菌、支原体、放线菌、蓝藻,个体微小、结构简单,酵母菌、霉菌、食用菌,真菌：,原生生物：,显微藻类、原生生物（如：草履虫、变形虫等）,病毒、类病毒、朊病毒,微生物的共同特点：,一.微生物基础知识,1.细菌的形态,细菌主要是以二分裂的方式进行增殖（如右图）,2.细菌的繁殖,3.细菌的菌落,.定义：,单个或者少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，会形

4、成一个肉眼可见的、具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。,.特征：,大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度等。,.功能：,每种细菌在一定条件下所形成的菌落，可以作为菌种鉴定的重要依据。,几种菌落及其形态,几种菌落及其形态,4.病毒的结构,:由核酸和蛋白质构成。,病毒的结构,吸附,注入,合成,释放,组装,5.病毒的繁殖,病毒的增殖一般可分五个阶段，即： 吸附注入核酸合成核酸和蛋白质组装释放,6.病毒的营养方式,：寄生,微生物需要的五大类营养要素物质是：,.微生物需要的营养物质及功能,1.碳源 2.氮源 3.生长因子 4.无机盐 5.水,：凡是能为微生物提供所需碳元素的营养物质。,无机碳源：CO

5、2；NaHCO3等,有机碳源：糖类、脂肪酸、花生粉饼、石油等,构成细胞物质和一些代谢产物 异养微生物的能源,.概念,.来源：,.作用：,1.微生物的碳源,无机氮源：N2、NH4+、NO3-、NH3等。,有机氮源：尿素、牛肉膏、蛋白胨、氨基酸等,凡是能够为微生物提供N元素的营养物质。,主要用于合成蛋白质、核酸及含N的代谢产物。,2.微生物的氮源,.概念：,.来源：,.作用：,3.生长因子,.常见的生长因子：,.概念：,.作用：,微生物生长不可缺少的微量有机物。,酶和核酸的组成成分。,维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等。,.培养基,培养基（培养液）是由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的营养基质

6、。,1.培养基的类型和用途,2.不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方(参考教材附录内容),3.不管哪种培养基，一般都含有水、碳源、氮源、无机盐、等营养物质，另外还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质,例如:生长因子(即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物,如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及氧气、二氧化碳、渗透压等的要求。,培养基的种类,不加凝固剂,加凝固剂，如琼脂,工业生产,观察微生物的运动、分类鉴定,微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种,含化学成分不明确的天然物质,工业生产,培养基成分明确,分类、鉴定,在培养基中加入某种化学物质,以抑制不需要的微生物的生长,促进所需要的微生物的生长

7、,培养、分离出特定微生物,在培养基中加入某种指示剂或化学药品,用以鉴别不同种类的微生物,鉴别不同种类微生物,选择培养基,液体培养基,半固体培养基,固体培养基,液体培养基：,表面生长,均匀混浊生长,沉淀生长,back,半固体培养基：,(是否运动),无动力,有动力(弥散),固体培养基：菌落,分离导入了目的基因的受体细胞,几种选择培养基,加入青霉素的培养基,分离酵母菌、霉菌等真菌,不加氮源的无氮培养基,分离固氮菌,不加含碳有机物的无碳培养基,分离自养型微生物,加入青霉素等抗生素的培养基,back,血清中含有： 多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等） 多种金属离子； 激素； 促贴附物质，如纤粘蛋白、冷

8、析球蛋白、胶原等。 各种生长因子 转移蛋白 不明成分,人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。,.无菌技术,1.无菌技术的概念,无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。,消毒定义： 利用化学或物理方法，杀死部份微生物的过程。,2.消毒与灭菌的概念及两者的区别,灭菌的定义：,以化学试剂或物理方法消灭所有微生物，包括所有细菌的繁殖体、芽孢、霉菌及病毒，而达到完全无菌之过程。 灭菌与消毒技术是微生物有关工作中最普通也是最重要的技术。,煮沸消毒法：100煮沸5-6min。 巴氏消毒法：70-75下煮30min或 80下煮15min。

9、 化学药剂消毒法：用75%酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒；氯气消毒水源。 紫外线消毒。,.消毒的方法：,3.常用的消毒与灭菌的方法,灼烧灭菌 干热灭菌：160-170 下加热1-2h。 高压蒸气灭菌：100kPa、121 下维持15-30min.,.灭菌的方法：,最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌，它可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体，同时可以基本保持培养基的营养成分不被破坏。 有些玻璃器皿也可采用高温干热灭菌。为了防止杂菌，特别是空气中的杂菌污染，试管及玻璃烧瓶都需采用适宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用各种金属、塑料及硅胶帽，它们只可让空气通过，而空气中的其他微生物不能通过。

10、 而平皿是由正反两平面板互扣而成，这种器具是专为防止空气中微生物的污染而设计的。,二.实验操作(以培养大肠杆菌为例),.制备牛肉膏蛋白胨培养基,1.计算 2.称量 3.溶化 4.灭菌: 将锥形瓶放入高压蒸气灭菌锅，在压力为100kPa、温度为121，灭菌1530min。 5.倒平板: 待培养基冷却到50 左右时，在酒精灯附近倒平板。2d后观察平板，无杂菌污染才可用来接种。,倒平板操作,.纯化大肠杆菌,平板划线法和稀释涂布平板法。,微生物的接种的常用接种方法有：,1.平板划线的操作方法,平板划线的操作,一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的； 二是存留在划破处的单个细胞无法形成规则

11、的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。,2.稀释涂布平板的操作方法,4.菌种的保存,接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于4冰箱保存。,3.微生物的恒温培养,.长期保存：,甘油冷冻管藏法,.临时保藏：,三.结果分析与评价,.培养基的制作是否合格 如果未接种的培养基在恒温箱中保温12d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。 .接种操作是否符合无菌要求 如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。 .是否进行了及时细

12、致的观察与记录 培养12h与24h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同，及时观察记录的同学会发现这一点，并能观察到其他一些细微的变化。,代谢类型,光能无机营养(光能自养型),光能有机营养(光能异养型),化能无机营养(化能自养型),化能有机营养(化能异养型),光,光,无机物,有机物,无机物,有机物,无机物,有机物,二氧化碳,二氧化碳及简单有机物,二氧化碳,有机物,大多数已知细菌和全部真核微生物,硝化细菌 氢细菌,紫色非硫细菌,蓝细菌 绿色硫细菌 藻类,本课题知识小结:,课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数,一、课题背景,1、尿素的利用,尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中

13、的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。,2、细菌能利用尿素的原因,土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶,3、常见的分解尿素的微生物,芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。,4、课题目的,从土壤中分离出能够分解尿素的细菌,统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌,一.研究思路,.筛选菌株,.统计菌落数目,.设置对照,1、实例： PCR技术,启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。,原因：因为热泉温度70800C，淘汰了绝大多数微生物只有Taq细菌被筛选出来。,DNA多聚酶链式反应是一种在体外将少量DNA大量

14、复制(PCR)的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。,.筛选菌株,要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等； 方法： 抑制大多数微生物的生长 促进目的菌株的生长 结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过平板稀释等方法对它进行纯化培养分离。,2、实验室中微生物的筛选原理：,人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。,3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：,从物理性质看此培养基属于哪类？,固体培养基,在此培养基中哪些作为碳源、氮源？,碳源：葡萄糖 氮源：尿素,培养基的氮源为尿素，只有能合成脲

15、酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。,5、培养基选择分解尿素的微生物的原理,允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，叫做选择培养基,尿素,尿素,6、怎样证明此培养基具有选择性呢？,以尿素为 唯一氮源 的培养基,牛肉膏 蛋白胨 培养基,是,分离 尿素 细菌,判断该 培养基 有无选 择性,只生长尿素细菌,生长多种微生物,是,1、显微镜直接计数：,利用血球计数板(血细胞计数板），在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。,.统计菌落数目：,不能区分死

16、菌与活菌； 不适于对运动细菌的计数； 需要相对高的细菌浓度； 个体小的细菌在显微镜下难以观察；,缺点：,2.间接计数法（活菌计数法） 原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。 常用方法：稀释涂布平板法。,每克样品中的菌落数(CV)M 其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。,？,说明设置重复组的重要性。在设计实验时，一定要涂布至少3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，

17、意味着操作有误，需要重新实验。,注意事项 为了保证结果准确，一般选择菌落数在30300的平板上进行计数。 为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平板中，经涂布，培养计算出菌落平均数。 统计的菌落往往比活菌的实际数目低。,计算公式：,每克样品中的菌株数 =（CV）M,某同学在稀释倍数为106 的培养基中测得 平板上菌落数的平均数为234，那么每克样 品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液 的体积为0.1ml） ( ) A. 2.34108 B. 2.34109 C. 234 D. 23.4,B,（三）设置对照,判断培养基中是否有杂菌污染：,将未接种的培养基同时进行培养。,判断选择培养

18、基是否具有筛选作用：,完全培养基（营养成分齐全）接种后培养 观察菌落数目。,主要目的是排除实验组中非测试因素对实验 结果的影响，提高实验结果的可信度。,实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，A同学从对应的106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落。分析其原因。,原因： 土样不同 培养基污染或操作失误(或者是混入了其他的含氮物质),小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。,方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验,方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培

19、养基是否受到污染。,结果预测：如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。,实验设计,从肥沃、酸碱度接近中性的湿润土壤中取样。先铲去表层土3 cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。,“微生物的天然培养基”,一土壤取样,数量最大、种类最多,大约70%90%是细菌,取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。,二制备培养基,由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为103107。 准备牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基。每个稀释度下需要3个选择培养基，1个牛肉膏蛋白胨培养基。还需要8个灭菌试管和1个

20、灭菌移液管 。 将稀释相同倍数的菌液，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。,应在火焰旁称取土壤10g。 在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行,分离不同的微生物采用不同的稀释度 原因：不同微生物在土壤中含量不同 目的：保证获得菌落数在30300之间、适于计数的平板,（三） 样品的稀释,问题：为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？,原因：土壤中各类微生物的数量（单位：株/kg）是不同的。例如在干旱土壤中

21、的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2 185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。 结论：为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。,.取样涂布,实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。,如果得到了2个或2个以上菌落数目在30300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。,.微生物的培养与观察,在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。 选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。

22、,培养不同微生物往往需要不同培养温度。 细菌：3037培养12d 放线菌：2528培养57d 霉菌：2528的温度下培养34d。,微生物的培养与观察,操作提示,一无菌操作 1、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。 2、应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。 3、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。 二做好标记 注明培养基种类、培养日期、平板培养样品 的稀释度等。 三规划时间,三、,四.结果分析与评价 1.通过对照实验，若培养物有杂菌污染，菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出分解尿素的微生物。 2.提示：选择

23、每个平板上长有30300个菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。,1.在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。,2.测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到 伊红-美蓝 培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现黑色，通过记算得出水样中大肠杆菌的数量。,五.课外延伸,CO（NH2）2+H2O CO2+2NH3,脲酶,pH升高 指示剂（酚红）将变红,大肠杆菌呈深紫色,中心有或无金属光泽,大肠杆菌在伊红美蓝琼脂(EMB)上典型特征,本

24、课题知识小结:,专题3,植物组织培养技术,一、基础知识,（1）细胞的分化,概念：,在个体发育中，由一个或一种细胞增殖产生的后代，在形态、结构、生理功能上发生稳定性差异的过程,过程：,1、植物的组织培养的基本过程,特点：,（2）稳定性：,（1）持久性：,一般来说，分化了的细胞将一直保持分化后的状态，直到死亡,（3）普遍性：,原因：,基因在特定的时间和空间条件下的选择性表达的结果,结果：,形成不同的细胞和组织,（2）细胞的全能性,定义：,已经分化的细胞，仍然具有发育成完整个体的潜能,原理：,生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质，都有发育成为完整个体所必需的全部基因,高度特化的动物细

25、胞，从整个细胞来说，全能性受到限制。但它的细胞核仍然保持着全能性，这是因为细胞核内含有该物种遗传性所需要的遗传物质,已分化的植物细胞，仍具有全能性,实例,受精卵生殖细胞体细胞,全能性的比较:,（3）植物组织培养,细胞离体,必要条件：,一定的营养物质、激素和其他外界条件,原理:,细胞的全能性,外植体：离体的器官、组织、细胞,相关概念:,脱分化：,再分化：,细胞排列疏松而无规则,是高度液泡化的、成无定形状态的薄壁细胞,由高度分化的植物组织或细胞产生愈伤组织的过程。也叫去分化,脱分化产生的愈伤组织继续进行培养，又可以重新分化成根或芽等器官的过程,愈伤组织:,人参的愈伤组织,菠萝的愈伤组织,2、影响植

26、物组织培养的因素,（1）植物材料的选择,烟草和胡萝卜的组织培养较为容易,枸杞愈伤组织的芽诱导比较难,B、同一植物材料的年龄、保存时间的长短会影响实验结果,菊花的组织培养一般选择未开花植株的茎上部新萌生的侧枝,A、植物材料的选择直接关系到实验的成败,（2）不同的离体组织和细胞对营养、环境等条件的要求相对特殊，需配置适宜的培养基,MS培养基主要成分包括：,A、大量元素: N、P、 S 、 K、Ca、Mg等,B、微量元素:B、Mn、Cu、Zn、Fe、Mo、I、 Co等,C、有机物、植物激素,常用的植物激素：生长素、细胞分裂素和赤霉素,生长素类：,2，4二氯苯氧乙酸（2，4D）、吲哚乙酸（IAA）、萘

27、乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）,细胞分裂素类：,激动素（KT）、6苄基嘌呤（ 6BA）、玉米素（ZT）,赤霉素类：,赤霉酸（GA3）,（3）植物激素的影响,生长素和细胞分裂素作用,植物中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键性激素。在生长素存在的情况下，细胞分裂素的作用呈现加强的趋势,有利于根的分化,有利于芽的分化，抑制根的分化,促进愈伤组织生长,生长素和细胞分裂素同时使用，用量的比例对植物细胞发育方向的影响,（4）pH、温度、光照,pH控制在5.8左右，温度控制在1822。C,每日用日光灯照射12h,3、植物组织培养过程:,离体组织或细胞,植物体,细胞分裂素生长素,愈伤组

28、织,芽,根,细胞分裂素生长素,细胞分裂素生长素,植物细胞培养,不需要光,需要光,1、培育无病毒植株,2、 培养紫草愈伤组织,提取紫草素（治疗烫伤和割伤的药物以及染料和化妆品的原料）,4、基因工程中亦需用到植物组织培养的方法,4、植物组织培养的应用：,3、诱导离体的植物组织形成具有生根发芽能力的胚状结构，包裹上人造种皮，制成人工种子，可以解决有些作物品种繁殖能力差，结子困难或发芽率低等问题,二、实验操作,（一）制备MS固体培养基,MS培养基包括20多种营养成分，实验室一般使用4。C保存配制好的培养基母液来制备,1、配置各种母液,无机物中大量元素浓缩10倍，微量元素浓缩100倍，常温保存,激素类、

29、维生素类以及用量较小的有机物一般可按1mg/ml的质量浓度单独配制成母液,用母液配制培养基时，需要根据各种母液的浓缩倍数，计算用量,2、配置培养基,分装到锥形瓶中，每瓶分装50ml或100ml, 配制培养液, 调PH,培养基的分装,由于菊花的茎段的组织培养比较容易，因此不必添加植物激素,3、灭菌,分装好的培养基连同其他器械一起进行高压蒸汽灭菌,1、选材：菊花茎段，取生长旺盛的嫩枝,（二）外植体消毒,2、消毒,流水冲洗,菊花茎段用流水冲洗后可少许洗衣粉，用软刷轻轻刷洗，刷洗后在流水下冲洗20min左右, 酒精处理,用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入体积分数为70的酒精中摇动23次，持续67s

30、，立即将外植体取出，在无菌水中清洗,消毒液处理,取出后用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入质量分数为0.1的氯化汞溶液中12min，取出后在无菌水中至少清洗3次，漂净消毒液,（三）接种,污染的主要来源是空气中的细菌和孢子，接种室消毒是至关重要的。用70的酒精喷雾使空气消毒， 酒精或新洁尔灭搽洗工作台并用紫外线照射20分钟,1、接种室消毒,2、无菌操作要求,操作要在酒精灯火焰旁完成，每次使用器械后，都需要用火焰灼烧灭菌，接种后立即盖好瓶盖。,3、材料的切取和接种,4、接种注意事项,每接种一块外植体前，镊子需放入体积分数为70的酒精溶液中消毒一次，然后在酒精灯火焰上烧一遍，冷却后再接种,外植体在

31、培养基中要分布均匀，放置外植体数量根据锥形瓶的大小确定，一般胡萝卜34块，菊的茎或叶68块，也不要太少，以充分利用培养基中的营养成分和光照条件,插入时应注意方向，不要倒插。茎段、茎尖基部插入培养基利于吸收水分和养分,思考：你打算做几组重复？你打算设置对照实验吗？,答：每种材料或配方至少要做一组以上的重复。设置对照实验可以取用一个经过灭菌的装有培养基的锥形瓶，与接种操作后的锥形瓶一同培养，用以说明培养基制作合格，没有被杂菌污染。,（四）培养,接种后的锥形瓶最好放在无菌箱中培养。培养期间应定期消毒。培养温度1822，每日用日光灯光照12h,（五）移栽,移栽生根的菊花试管苗之前，应先打开培养瓶的封口

32、膜，让试管苗在培养间生长几日,1、打开封口膜,2、清洗转移,用流水清洗根部的培养基，将幼苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境下生活一段时间,（六）栽培,3、移栽,珍珠岩：固体基质型，含水量高、蓄水性强、透性好，适合栽培,幼苗长壮后，移栽到土壤中,幼苗移栽后，每天观察并记录幼苗的生长情况，适时浇水、施肥，直至开花,专题4 酶的研究与应用,课题1 果胶酶在果汁 生产中的作用,一、课题目标,1.简述果胶酶的作用； 2.检测果胶酶的活性； 3.探究温度和pH对果胶酶活性的影响以及果胶酶的最适用量； 4.搜集有关果胶酶应用的资料。,二、课题重点与难点,课题重点： 温度和pH对果胶酶活性的影响。 课题难点：

33、 果胶酶的最适用量。,三、基础知识分析,知识要点: 1.果胶酶的作用； 2.酶的活性的定义； 3.影响酶活性的因素； 4.果胶酶的用量。,(一)细胞壁的结构及作用：,作用是什么？ 特点？ 结构组成？,保护植物细胞；支撑植物细胞,弹性小；全透性,纤维素、果胶,1.果胶,植物细胞壁及细胞之间胞间层的成分,植物细胞壁以及胞间层的主要组成成分之一，它是由半乳糖醛酸聚合而成的一种高分子化合物，不溶于水。,果胶:,在果汁加工中，果胶不仅会影响出汁率，还会使果汁浑浊。果胶酶能够分解果胶，瓦解植物细胞的细胞壁及胞间层，使榨取果汁更容易，而果胶分解成可溶性的半乳糖醛酸，也使得浑浊的果汁变得澄清。,果胶酶,果胶酶

34、并不特指某一种酶，而是分解果胶的一类酶的总称，包括多聚半乳糖醛酸酶、果胶分解酶和果胶脂酶等。,果胶酶:,2.酶的活性与影响酶活性的因素,指酶催化一定化学反应的能力。酶反应速度用单位时间内单位体积中反应物的减少量或生成物的增加量来表示.,(1)酶的活性,(2)影响酶活性的因素,a.温度,b.pH,C.酶的抑制剂,.果胶酶的用量,()探究温度和pH对酶活性的影响,四、实验设计,1、设计实验方案 A、确定温度/PH梯度（5C0/ 10C0）/PH5、6、7、8 探究控制温度/PH的方法和措施 你的实验变量是什么？如何设定？ B、确定水果的种类确定制备果汁的方法 确定实验用的水果用量 确定果胶酶的用量

35、控制测定果胶酶活性的方法,()探究温度和pH对酶活性的影响,2、实验操作步骤： 制备水果泥 配制果胶酶 水果泥与果胶酶分别水浴保温 将水果泥和果胶酶混合保温 过滤出果汁 记录果汁量 改变不同的温度/PH后重复以上实验,()探究温度和pH对酶活性的影响,3、设计记录数据的表格 4、得出结论与分析： 画曲线图；最适温度/PH是,在实际的操作过程中，还需要注意下列事项：,1与其他工业用酶基本相同，果胶酶的适宜温度范围也比较宽泛，因此，可以选用10 作为温度梯度，设置的具体温度为10 、20 、30 、40 、50 和60 等，也可以尝试以5 作为温度梯度。 2苹果、橙子和葡萄等水果都可以作为反应物，

36、水果不用去皮。如用苹果为原材料，一般可按每个中等大小的苹果加水100200 mL的比例进行搅拌，获得稀的苹果泥。,3果泥的用量可以采用5 mL左右，果胶酶的用量可采用质量浓度为2%的果胶酶溶液2 mL。 4水浴时间可以为2030 min。 5过滤果汁时，漏斗中应放置滤纸。 6探究pH对果胶酶活性的影响，只须将温度梯度改成pH梯度，并选定一个适宜的温度进行水浴加热。反应液中的pH可以通过体积分数为0.1%的氢氧化钠或盐酸溶液进行调节。,()探究果胶酶的用量,探究果胶酶的用量是建立在探究最适温度和pH对果胶酶活性影响的基础之上的。此时，研究的变量是 ，其他因素都应 。,果胶酶的用量,保持不变,方案

37、：可以配制不同浓度的果胶酶溶液，也可以只配制一种浓度的果胶酶溶液，然后使用不同的体积即可。需要注意的是，反应液的pH必须相同，否则将影响实验结果的准确性。,五、结果分析与评价,根据实验数据绘制出的温度和pH对果胶酶活性影响的曲线图； 不同果胶酶用量对出汁量影响的曲线图（在浓度和体积相同的条件下）； 果胶酶最适温度、pH以及果胶酶的最适用量。,六、本课题知识小结,专题5 DNA和蛋白质技术,课题3 血红蛋白的提取和分离,主要内容： 一、基础知识 二、实验操作,一、基础知识-蛋白质分离和提取的原理, 凝胶色谱法（分配色谱法）,1、凝胶：,一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通道，由多糖类构成如葡聚糖

38、、琼脂糖）,2、概念：,根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法,3、原理：,一、基础知识-蛋白质分离和提取的原理,4、具体过程,一、基础知识-蛋白质分离和提取的原理,1、概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。, 缓冲溶液：,2、作用： 能够抵制（ ）对溶液（ ）的影响，维持PH基本不变。,外界的酸或碱,pH值,3、缓冲溶液的配制,通常由（ ）种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的（ ）就可以制得（ ）使用的缓冲液。,12,使用比例,在不同PH范围内,思考：说出人体血液中缓冲液。,NaH2PO4

39、 / Na2HPO4 H2CO3 / NaHCO3,磷酸缓冲液，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色)和科学研究其(活性),4、在本课题中使用的缓冲液？,（三） 电泳：,1.概念：,带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。,2.原理：,许多重要的生物大分子，如多肽、 核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。,3.类型:,琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳。,在电场的作

40、用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动,琼脂糖凝胶电泳示意图,4、聚丙稀酰胺凝胶电泳,（1）聚丙稀酰胺凝胶：是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N，亚甲基双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。,蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。 为了消除净电荷对迁移率的影响，可以在凝胶中加入SDS。,（2）原理：,SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的分子量。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷

41、量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。,（3）SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳作用机理:,4、聚丙稀酰胺凝胶电泳,蛋白质的提取和分离一般分为四步： （1）样品处理：包括洗涤红细胞；血红蛋白稀释；离心等操作收集到的血红蛋白溶液。 （2）粗分离：透析除去分子较小的杂质。 （3）纯化：通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去。 （4）纯度鉴定：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。,二、实验操作：样品处理粗分离纯化纯度鉴定,1. 血液有哪些成分？,2. 你认为鸟类血液和哺乳动物血液中，最好哪种血液来提取血红蛋白？为什么？,二、实验操作：样品处理粗分离纯化纯度鉴定,知识回顾,（一

42、）样品处理,1、红细胞的洗涤： 2、血红蛋白的释放： 3、分离血红蛋白溶液： 4、透析：（如何除无机盐离子和小分子有机物质呢？）,血液柠檬酸钠低速短时离心吸出上层血浆红细胞5倍体积生理盐水 缓慢搅拌10min低速短时离心吸出上清液反复洗涤直至上清液无黄色,在蒸馏水和甲苯（？）作用下，红细胞破裂释放,红细胞破碎混合液中速长时离心（2000c/min10min）滤纸过滤除去脂质分液漏斗分离出血红蛋白，得到红色透明液体。,装入透析袋并置于磷酸缓冲液中（PH为7.0）透析。,二、实验操作：样品处理粗分离纯化纯度鉴定,分离血红蛋白溶液,有机溶剂 无色透明的甲苯层,脂类物质 白色脂溶性物质沉淀层,血红蛋白

43、溶液 红色透明液体,红细胞破碎物沉淀 暗红色沉淀物,透析过程动画演示,（二）凝胶色谱操作-纯化,1、凝胶色谱柱的制作：,二、实验操作：样品处理粗分离纯化纯度鉴定,色谱柱的制作过程：准备材料加工橡皮塞 安装色谱柱,2、凝胶色谱柱的装填,装配好的凝胶柱,3、样品加入与洗脱-调节缓冲液面加入蛋白质样品调节缓冲液面洗脱收集分装蛋白质,（1）调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。 （2）滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。 （3）样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品

44、完全进入凝胶层后，关闭下端出口。 （4）洗脱：小心加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。 （5）收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功） （6）注意：正确的加样操作：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。,收集得到的纯化后的蛋白,三、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,鉴定血红蛋白纯度。,目的：,观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图5-18），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白

45、的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。,四、实验结果分析与评价,1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？,2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？,由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖2000或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时

46、要重新装柱。,如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。,3、你能观察到蛋白质的分离过程中，红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效果？,四、实验结果分析与评价,本课题作业;,1.凝胶色谱法分离蛋白质的的原理是怎样的? 2.什么是缓冲溶液?它的作用是什么? 3.电泳的作用及其原理是什么? 4.你能描述血红蛋白分离的完整过程吗? 5.与其他真核细胞相比,红细胞有什么特点?这一特点对你进行 蛋白质的分离有什么意义?,（1）计算：根

47、据色谱柱的内体积计算所需凝胶量 （2）凝胶溶胀：凝胶浸泡于蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬浮液 （3）固定：将色谱柱装置固定在支架上 （4）装填：将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。 （5）洗涤平衡：装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分洗涤平衡12小时。 装填时注意：1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。 2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。 洗涤平衡时注意：1、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。,2、凝胶色谱柱的装填,4、用SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量的方法,使用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量时，可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的电泳区带位置，用电泳迁移率和分子量的对数作标准曲线，可以测定未知蛋白质的分子量。市场上有高分子量、次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出售。,