《细胞死亡判定--讲课用第四节.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《细胞死亡判定--讲课用第四节.ppt（73页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、细胞死亡判定,中南大学生物科学与技术学院 李杰 ,提 纲,细胞死亡判定意义 细胞死亡定义及判定方法 细胞死亡判定方法中存在的问题 细胞死亡判定方法使用兼谈人体死亡判定,一 细胞死亡判定意义,种子筛选,发 酵,抗癌药物筛选,二 细胞死亡定义及判定方法,细胞死亡的定义,细胞因受严重损伤而累及胞核时，呈现代谢停止、结构破坏和功能丧失等不可逆性变化，此即细胞死亡 呼吸- 代谢- 繁殖,平板计数法,1.繁殖力,克隆形成实验clonogenic assay,MPN most probable number,屏障作用,膜不对称性破坏,2 细胞膜,2.1 细胞膜完整性,显微镜观察？ 电子显微镜？,染料类别,膜
2、通透性染料 非膜通透性染料,常见膜完整性检测用染料,传统可见染料：甲基蓝、Evans Blue、 Neutral Red,传统可见染料的不足,荧光染料：PI、SYTOX、SYBR,EB & FDA,流式细胞仪应用,流式细胞仪的优点,准确 快速：一般分选速度1000个/秒 大量 多参数同时分析（形状，尺寸大小，荧光颜色及强度）,Lymphocytes:淋巴细胞,Monocytes：单核细胞,Granulocytes：粒细胞,PI & Annexin V-FITC分析细胞凋亡,问：凋亡细胞是活细胞还是死细胞？,2.2 细胞膜电位,测定细胞膜电位染料,正电荷：Rhodamine 123、Carboc
3、yanines， DiOC6(3)， DiOC2(3)， DiSC3(5) 负电荷：DiBAC(3),3. 能量相关,3.1 ATP,ATP测定方法,ATP,ADP,荧光素,加氧荧光素,荧光素酶,ATP法特点,敏感性高：可检测最少20个细胞 适用范围较广：可对实体瘤、胸腹水、血液等多种肿瘤标本进行体外药敏检测 时间短： 30-60分钟内,Tetrazolium 家族 四氮唑化合物,3.2 氧化还原脱氢酶,MTS 还原产物具溶解性,3.3 pH 梯度,检测染料,carboxyfluorescein (cF), BCECF, pyranine cSNARF-1,pH and Health,荧光素二
4、乙酯 （Fluorescein Diacetate， FDA ）,4. 酯酶,5.分子生物学技术,DNA等分子在死亡细胞中比活细胞中更快降解 长序列监测技术比短序列监测更能反映生命力,检测对象,DNA rRNA mRNA,检测方法：DNA probe,检测方法：PCR,PCR扩增方法,RT-PCR NASBA(nucleic acid sequence-based amplification,依赖性核酸序列的扩增 ) RT-SDA(reverse transcriptase-strand displacement Amplification,链替代扩增 ),细胞死亡判定方法总结,Keer &
5、Birch, 2003,三 细胞死亡判定方法 中存在的问题,现有方法存在的相关问题1,膜完整性测试：染上颜色的细胞一定是死亡细胞？ MTT, FDA：没有染上颜色的细胞一定是死细胞？,膜完整性测试,活性染料阴性细胞能否再存活？,Caron et al., 1998,问题2 ：活性染料越深生命力越强？,Resveratrol 白藜芦醇,蒽醌萜类化合物,蓼科植物虎杖,白藜芦醇的功效,天然的抗氧化剂,葡萄酒中的抗癌明星,法兰西奇迹,具有神奇抗癌效能的白藜芦醇,白藜芦醇的抗白血病作用,白藜芦醇处理细胞MTT还原活性,白藜芦醇处理细胞MTT还原活性,生长抑制细胞MTT还原活性上升原因探讨,Breeuwe
6、r et al., 1994. AEM. 60(5)1467-1472,Jochem, 1999. Marine Biology. 135:721-728,酯酶活性的存在 2.完整的细胞膜,问题3：FDA 染色中存在的问题,0 C,0 C,30 C, DES DCCD none,Energy-dependent, Carrier-Mediated extrusion,TPP none,缓冲液等对荧光强度的影响,培养基组成对荧光强度的影响,荧光影响因子,四 细胞死亡判定方法使用 兼谈人体死亡判定,以后的科研工作中该如何使用？,心肺死亡概念,脑死亡判定,全脑死亡：循环和呼吸功能的不可逆终止，或包括脑干在内的全脑功能不可逆终止 脑干死亡：为意识和认知功能的丧失是脑干上行网状结构受到破坏，必将导致患者全脑功能的丧失而死亡。 高级脑死亡：把意识功能的丧失作为诊断的关键,脑死亡男子器官即将移植时苏醒,Four months after he was declared brain dead and doctors were about to remove his organs for transplant, Zach Dunlap is on the road to recovery,离奇！,脑死亡与器官移植,谢谢！,谢 谢,EXIT,