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1、基因操作,第七章,Gene Manipulating,2019年6月22日10时2分,1,第二节,PCR 技术的原理与应用 Polymerase Chain Reaction,江黎明 2013年10月,2019年6月22日10时2分,2,PCR(polymerase chain reaction)技术是1985年由美国科学家Kary B Mullis发明的体外基因片段扩增的方法。,一、PCR技术的产生,2019年6月22日10时2分,3,PCR技术的创建,Kary B. Mullis（穆利斯（美）,1971年,Khorana等提出在体外DNA经变性,与适当引 物杂交后用DNA聚合酶延伸,克隆D
2、NA的设想。,1983年,Mullis发明了PCR技术。,1988年,Saiki等将耐热DNA聚合酶(Taq)引入PCR技。,1989年,美国Science杂志列PCR 为十余项重大科 学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年。,1993年,Mullis荣获度诺贝尔化学奖。,2019年6月22日10时2分,4,二、PCR技术的基本原理,DNA模板变性 (denature)：,95左右高温使模板DNA完全变性。,单链DNA模板与引物退火 (annealing)：,55左右引物与模板形成复合物的几率DNA分子自身的复性。,引物的延伸 (extension)：,72左右耐热DNA聚合酶在最适温度下催
3、化DNA合成反应。,2019年6月22日10时2分,5,5,Primer 1,5,Primer 2,5,5,Template DNA,PCR技术的基本原理示意图,Taq酶,Taq酶,2019年6月22日10时2分,6,2019年6月22日10时2分,7,PCR体系的5种基本组成成分,2019年6月22日10时2分,8,PCR反应循环,变性 9395C左右,延伸 酶最适温度,退火 引物Tm-5C,经过30个左右的循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。,2019年6月22日10时2分,9,思考题 1,PCR技术的主要特点,1.特异性强,2.灵敏度高,3.简便快速,4.对标本的纯度要求低,
4、2019年6月22日10时2分,10,衡量PCR好坏的参数：,特异性Specificity:最好只有目的DNA带。,真实性Fidelity:DNA序列正确。,产量Quantity:DNA带明亮。,2019年6月22日10时2分,11,思考题 2,利用特异性引物以cDNA或基因组DNA为模 板获得已知目的基因片段。,利用简并引物从cDNA文库或基因组文库中 获得具有一定同源性的基因片段。,利用随机引物从cDNA文库或基因组文库中 随机克隆基因。,用不同引物进行PCR获取目的基因：,三、PCR技术的主要用途及其衍生技术,（一）目的基因的克隆,2019年6月22日10时2分,12,(reverse
5、transcription PCR,RT-PCR),1.反转录PCR技术,特点：敏感度高、特异性强、省时等。,RT-PCR是从组织细胞中获得目的基因、对已知 序列RNA进行定性及半定量分析最的有效方法。,总RNA (或mRNA),ss-cDNA,ds-cDNA,PCR扩增,2019年6月22日10时2分,13,获取目的基因的特殊PCR技术：,RT-PCR原理,AAnA,TTnT 5,5,mRNA,反转录酶,mRNA,cDNA,3,TTnT,AAnA,核糖核酸酶H,TTnT,3,DNA poly I,cDNA,核酸酶S1,双链cDNA,3,5,3,5,5,加热变性,加入特异性引物,DNA聚合酶,
6、PCR,大量的产物,2019年6月22日10时2分,14,RT-PCR的结果举例,2019年6月22日10时2分,15,gt10/11系列 (插入型，适用于cDNA克隆),6/22/2019 10:02 PM,16,重组噬菌体,锚定PCR,末端核酸转移酶,先合成第一链cDNA后,添加一同聚物尾(polydG),与带有polydC 限制性内切位点的3锚定引物一起扩增。,2019年6月22日10时2分,17,原理：,设计“内、外” 两对引物：,2.巢式-PCR（nested-PCR）,先用外引物进行PCR反应，从模板上扩增出含有内引物扩增的靶序列的较长产物，并以此作为模板用内引物进行第二次PCR反
7、应，扩增出内侧的较短靶序列。,外引物对应的序列在模板的外侧； 内引物对应的序列在外引物的内侧。,2019年6月22日10时2分,18,第1轮PCR：1520个循环的标准扩增。,第2轮PCR：将第1轮PCR扩增产物稀释1001000倍， 作为模板进行第2轮PCR ，扩增1520个循环。,2019年6月22日10时2分,19,降低了多个靶位点扩增的可能性，因与2套引物都互补的靶序列很少。如用相同引物对作总数相同的循环，会扩增非特异性靶点。,可增加有限量靶序列(如稀有mRNA)的灵敏度，并且提高了困难PCR(如5 RACE)的特异性。,用外、内2对引物扩增，可大大提高扩增的灵敏度和特异性。,2019
8、年6月22日10时2分,20,3.cDNA末端快速扩增,2019年6月22日10时2分,21,3-RACE,2019年6月22日10时2分,22,5-RACE,5-cap,AAAAAAAAAA3,mRNA,GSP1,1.逆转录,去除RNA和GSP1,2.末端转移酶,3CCCCC,3CCCCC,3.退火，PCR,GSP2,5GACTCGAGTCGACATCGAGGGGG-3,Xho l Sal I ClaI,3. PCR,用限制性内切酶切割克隆即获得5末端片段,2019年6月22日10时2分,23,2019年6月22日10时2分,24,已知序列,未知序列,未知序列,限制酶,限制酶,连接酶,4.反
9、向PCR (reverse PCR),用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。,2019年6月22日10时2分,25,电泳,*2，3双脱氧核苷酸,*用4种不同荧光标记,DNA样品 引物、DNA聚合酶、dNTP,A,A,C,G,T,G,G,A,C,T,末端合成终止法测定DNA序列的原理,DNA自动测序结果,2019年6月22日10时2分,27,The Nobel Prize in Chemistry 1980,“for his fundamental studies of the biochemistry of nucleic acids, wit
10、h particular regard to recombinant-DNA“,“for their contributions concerning the determination of base sequences in nucleic acids“,Paul Berg,1/2 of the prize,Stanford University Stanford, CA, USA,1926 -,Walter Gilbert Frederick Sanger,1/4 of the prize 1/4 of the prize,Harvard University, Biological L
11、aboratories Cambridge, MA, USA,MRC Laboratory of Molecular Biology Cambridge, United Kingdom,1932 -,1918 -,2019年6月22日10时2分,28,（二）基因的体外突变,利用PCR技术可以随意设计引物在体外进行基因的嵌和、缺失、点突变等改造。,利用PCR技术构建重组体和突变体的方法称为重组PCR(recombinant PCR)。,特点是简单、省时；利用两对引物很容易的在DNA片段的任何位置进行点突变。,2019年6月22日10时2分,29,1. 随机突变：,应用：,策略：易错PCR（err
12、or-prone PCR）。,利用Taq DNA聚合酶等没有35校对功能的特性，在PCR扩增反应中可能掺入错误的核苷酸，产生随机错误的扩增产物。,加入ITP并限制某一种核苷酸用量，从而促进DNA聚合酶选择其它3种核苷酸或ITP，导致产物发生突变。,构建突变体文库，继而可从中筛选出具有特殊性质的突变个体,2019年6月22日10时2分,30,2.定点点突变,(1) 5端引入点突变：,(2) 序列中的点突变：,通过修饰上游引物的5端的碱基序列，可引入标记的碱基、限制性酶切位点、启动子序列等。,采用重叠延伸PCR(Overlap Extension PCR，OE PCR。,2019年6月22日10时
13、2分,31,用酶A和B消化、克隆，将突变位点引入PCR重组体。,(1) 末端引入点突变,2019年6月22日10时2分,32,EcoRI,HindIII,digest, subclone sequence,PvuII,(2) 序列中的点突变：,2019年6月22日10时2分,33,例子：S.pn的ply146aa缺失的突变序列构建,肺炎链球菌S.Pn的ply为一细胞毒性分子，其146位aa缺失后毒性大大减弱。构建突变体作为疫苗：,首先设计4个引物：(M1和M2完全重叠),P1: 5-CGGGATCCATGGCAAATAAAGCAGTAAATG-3 BamH I,P2: 5-CCGCTCGAGC
14、AAGCATTCTCCTCTCCTAGTC-3 Xho I,M1: 5-GGTCAATAATGTCCCA-AGAATGCAGTATG-3,M2: 5-CATACTGCATTCT-TGGGACATTATTGACC-3,2019年6月22日10时2分,34,以基因组DNA为模板，以P1和M1为引物扩增出ply上游片断，以P2和M2为引物扩增出ply下游片断；,2.以上下游片断为模板，以P1和P2为引物扩出全长；,3.酶切后克隆到质粒中保存。,2019年6月22日10时2分,35,A,B,3.引入大片段缺失,2019年6月22日10时2分,36,4.多位点突变,策略：多次重叠PCR,关键：重叠引物设
15、计(每对均需部分重叠，方向相反)。,2019年6月22日10时2分,37,基本操作,2019年6月22日10时2分,38,（三）DNA的微量分析,PCR技术敏感度很高，理论上只要存在1分子的模板，就可以获得目的片段，是DNA微量分析的最好方法。,实际工作中，1滴血液、1根毛发或1个细胞已足以满足PCR的检测需要。,2019年6月22日10时2分,39,（四）mRNA的含量分析,用于RNA检测的常用字方法有原位杂交、点杂交、Northern印迹杂交及核酸酶保护试验等，都难以检测低丰度的mRNA，且操作繁琐。,在敏感性方面，RT- PCR用于mRNA定量分析要远高于上述传统方法。,RT-PCR用于
16、mRNA定量分析面临的问题：,在第一步合成cDNA的反应中会造成一些误差，但是更重要和显著的误差是由PCR反应本身造成。,2019年6月22日10时2分,40,用于定量PCR分析的两种技术：,竞争性定量PCR：,在反应前加入外源标准品RNA作为内参照；须使用与样品RNA同样的引物识别序列，但产物的大小不同，以在电泳时区别开。,属反应终点分析方法，需用系列稀释标准RNA做成标准曲线，样品RNA的含量应在标准曲线范围内。,实时PCR(real time PCR)：,是近年发展起来的一种RNA微量分析技术；精确度高，结果明确，操作容易，能进行高通量检测。,2019年6月22日10时2分,41,实时P
17、CR的基本原理,在反应中引入了荧光标记分子，在反应过程中对反应过程中每一时刻的产物量进行实时分析。,不同公司的仪器和反应系统所用的荧光报告系统不同：,Molecular Probe 公司的SYBR Green 系统,Perkin-Elmer/ABD公司的TaqMan系统,Invitrogen公司的Molecular Beacons系统,2019年6月22日10时2分,42,原理:,PCR扩增时，Taq酶的5- 3外切酶活性将探针酶切降解，使探针上的荧光基团和淬灭基团分离，使荧光基团在激发光作用下发出荧光； 每扩增一条DNA链就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。,
18、2019年6月22日10时2分,43,思考题 3,1.实时荧光PCRTaqMan技术,实时荧光PCRTaqMan技术,2019年6月22日10时2分,44,TaqMan技术的优、缺点,优点：杂交效率高,2019年6月22日10时2分,45,X,2.实时荧光PCR分子信标技术,2019年6月22日10时2分,46,分子信标技术的优、缺点,2019年6月22日10时2分,47,SYBR Green I是一种只与双链DNA小沟结合的染料，当它与DNA双链结合时，发出荧光；从DNA双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱。,因此，在一个体系内，其信号强度代表了双链DNA的量。,3.实时荧光PCRSYBR G
19、reen I 技术,2019年6月22日10时2分,48,SYBR Green I荧光染料的作用原理,2019年6月22日10时2分,49,SYBR Green I 技术的优、缺点,2019年6月22日10时2分,50,荧光曲线,随着PCR反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号强度不断增加。每经过一个循环，收集一次荧光强度信号，得到一条荧光扩增曲线图,4.实时定量PCR的定量原理,2019年6月22日10时2分,51,荧光阈值,在荧光扩增曲线指数增长期设定一个荧光强度标准(即PCR扩增产物量的标准)。,阈值线,实时定量PCR的两个重要概念,2019年6月22日10时2分,52,Ct值的概念,C
20、t值的定义是PCR扩增过程中，扩增产物(荧光信号)到达阈值时所经过的扩增循环次数。,阈值线,2019年6月22日10时2分,53,模板起始浓度越高，Ct值越小,Ct值与模板起始浓度的关系,哪个样品浓度高？,2019年6月22日10时2分,54,Ct值的重现性极好,为什么用Ct值而不用终点相对荧光强度定量？,2019年6月22日10时2分,55,阈值的选择,荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可设定在指数扩增阶段任意位置上；,缺省设置一般是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。,但实际应用时要结合扩增效率、线形回归系数等参数来综合考虑,2019年6月22日10时2分,56,荧光强
21、度循环数曲线,初始模板量对数C(T)循环数标准曲线,.,未知,104,103,106,105,102,10,定量原理：利用已知起始拷贝数的标准样品作出标准曲线,通过未知样品的Ct值,从标准曲线上计算出该样品的起始浓度。,2019年6月22日10时2分,57,Unknown contains 3108 copies,首先确定未知样品的 C(t)值，借助标准曲线由未知样品的C(t)值反推出其初始量得到未知样品初始量绝对值。,2019年6月22日10时2分,58,2019年6月22日10时2分,59,2.衡量PCR好坏的参数主要有哪些？一般来说好的结果如何体现？,思考题：,3. 以TaqMan技术为例，简述实时荧光PCR的原理。,1.PCR过程中的DNA模板变性、模板与引物退火、引物延伸3步的温度设置一般大致是多少？要考虑的主要因素是什么？,