03蛋白质化学.ppt

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1、,第3章 蛋白质化学,生命科学学院 赵丹丹,黑龙江大学 20122013 学年第一学期,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,2,本章内容,3.1 概述 3.2 蛋白质的基本结构单位氨基酸* 3.3 肽 3.4 蛋白质的分子结构* 3.5 蛋白质的性质 3.6 蛋白质及氨基酸的分离纯化与测定 本章小结 习题,3.1 蛋白质概述,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,4,一、蛋白质的来源和分布,Protein：蛋白质，来源于希腊文含义是 “最原初的”，“第一重要的” 蛋白质是生物体重要组成成分 分布广：所有器官、组织、细胞都含有蛋白质 含量高：蛋白质是动物细胞内最丰富的有机分子， 占人体干重的45%,赵丹丹,第3章

2、 蛋白质化学,5,二、蛋白质的组成,C、H、O; 一定比例的N; 少量的S; 有些蛋白质含有P、Fe、Cu、I、Zn和Mo等微量元素,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,6,各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16。,由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此，只要测定生物样品中的含氮量，就可以根据以下公式推算出蛋白质的大致含量：,100克样品中蛋白质的含量 ( g % ) = 每克样品含氮克数 6.25100,1/16%,蛋白质元素组成的特点,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,7,三聚氰胺,84/126=?,66.7%16%,C3H6N6,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,8,三、蛋白质的定义,从蛋白质化学结构的出发：

3、蛋白质(protein)是由多种氨基酸(amino acids)通过肽键(peptide bond)相连形成的高分子含氮化合物。,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,9,四、蛋白质的分类,按蛋白质的分子形状分类 纤维状蛋白质（fibrous protein） 球状蛋白质（globular protein） 按蛋白质的组成成分分类 单纯蛋白质（simple protein） 结合蛋白质（conjugated protein） 按蛋白质的生物学功能分类,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,10,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,11,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,12,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,13,五、蛋白质的生物学

4、功能,生物界蛋白质种类估计有10101012种,催化,调节,结构,运输,贮存,运动,防御和保护,支架,特殊功能,请结合教材和相关资料 自学蛋白质的生物学功能,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,14,Proteins are at the center of action in biological processes.,proteins,Motion (myosin, actin),Material transport (hemoglobin),Metabolism (enzymes),Defense (antibodies, toxins),Mechanical support (collagen

5、),Replication and repairing of genetic information (DNA and RNA polymerases),赵丹丹,第3章 蛋白质化学,15,Hemoglobin transports O2 and CO2,The red blood cells (each containing about 300 million HBs),The heme group that reversibly binds O2,With a a2b2 structure,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,16,Vertebrates use antibodies to defe

6、nd (i.e., to neutralize antigens),Antigen,Antibody (IgG: with a H2L2 structure),The antigen binding site of an antibody,defense,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,17,Muscle contraction depends on the reversible interaction between myosin and actin,Actin filament,Myosin,ATP hydrolysis,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,18,Luciferase allows f

7、irefly to emit light.,Enzyme catalysis,3.2 氨基酸 （Amino acid, Aa）,蛋白质的基本结构单位,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,20,前言: 氨基酸是蛋白质的基本结构单位,Proteins can be reduced to their constituent amino acids by a variety of methods 通过水解蛋白质来研究其结构和组成,酸水解,碱水解,酶水解,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,21,方法一 酸水解,酸水解常用于蛋白质的分析和制备 方法：5 10倍的20%HCl煮沸回流16 24小时或加压在120C水解12

8、小时 产物: L-氨基酸 优点：所用的酸可以除掉。HCl可以加热蒸发除去，当用20%H2SO4水解时,可加Ba2+或Ca2+沉淀除去SO42- 缺点：营养价值高的色氨酸全被破坏，与含醛基化合物(糖)生成腐黑质。含羟基的氨基酸（丝氨酸,苏氨酸,酪氨 酸）大部分被破坏,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,22,方法二 碱水解,碱水解法一般很少使用 方法： 6mol/LNaOH 或 4mol/L Ba(OH)2煮沸6小时 产物:水解产生的氨基酸发生旋光异构作用,产生D-型、L-型两类氨基酸,因此有外消旋现象 优点：色氨酸不被破坏,水解液清亮 缺点：丝氨酸,苏氨酸,赖氨酸,胱氨酸等大部分被破坏。因旋光异构产生

9、的D-型氨基酸不能被人体分解利用,因此氨基酸的营养价值减半,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,23,方法三 酶水解,包括：胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或糜蛋白酶及胃蛋白酶 方法：使用一些蛋白酶, 常温常压, 36 C60 C, pH28 产物: 由于水解方法和条件不同,可得到不同程度降解物 蛋白质 多肽 二肽 氨基酸 优点：条件温和,氨基酸完全不被破坏,不发生旋光异构 缺点：水解不彻底, 除了氨基酸以外, 中间产物较多,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,24,3.2.1 氨基酸的结构特征,氨基酸(Amino acid，简称Aa)是蛋白质的基本结构单位, 是具有氨基的羧酸 （脯氨酸除外） 。 存在自然界中的氨基酸

10、有500多种，但组成人体蛋白质的常见氨基酸仅有20种，且均属 L-氨基酸（甘氨酸除外）。,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,25,天然氨基酸（L-氨基酸）,1、氨基酸的结构通式,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,26,When the R- group contains additional carbons in a chain, they are designated , , , etc., proceeding out from the carbon.,R,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,27,20 种 常 见 氨 基 酸 及 简 写 符 号 （书70页）,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,28,3.2.2 氨

11、基酸的分类,方法一 组成蛋白质的氨基酸 组成蛋白质的常见氨基酸 组成蛋白质的不常见氨基酸 非蛋白质氨基酸,（ 20种 ）,方法二 必需氨基酸 非必需氨基酸,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,29,1、组成蛋白质的20种常见氨基酸分类, 根据氨基酸 R-基的酸碱性质分类 酸性2种； 碱性3种； 中性15种 根据氨基酸 R-基的化学结构分类 芳香族3种 ； 杂环3种 ； 含羟基3种； 酸性氨基酸酰胺2种 ； 含硫2种（含巯基1种）； 亚氨基酸1种 根据氨基酸 R-基团的极性分类 极性带正电荷的氨基酸 极性带负电荷的氨基酸 极性不带电荷氨基酸 非极性氨基酸,作业：精读书72-74页内容,赵丹丹,第3章 蛋

12、白质化学,30,Aa-1 酸性氨基酸 极性 带负电荷,天冬氨酸,谷氨酸,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,31,赖氨酸,精氨酸,组氨酸,Aa-2 碱性氨基酸 极性 带正电荷,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,32,Aa-3 中性氨基酸，非极性，脂肪族,甘氨酸,丙氨酸,缬氨酸,亮氨酸,蛋氨酸/甲硫氨酸,异亮氨酸,脯氨酸,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,33,Aa-4 芳香族,苯丙氨酸,酪氨酸,色氨酸,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,34,丝氨酸,苏氨酸,半胱氨酸,天冬酰胺,谷氨酰胺,Aa-4 极性，不带电,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,35,胱氨酸: 由两个半胱氨酸的巯基氧化后生 成，在动物的毛、发、角、蹄等蛋白中含

13、量多。,二硫键,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,36,碱性氨基酸 酸性氨基酸 酸性氨基酸酰胺 含羟基氨基酸 含硫氨基酸 芳香族氨基酸 杂环族氨基酸 亚氨基酸 脂肪族氨基酸, Arg, Lys, His, Asp, Glu, Gln, Asn, Ser, Thr, Tyr, Cys, Met, Phe, Trp, Tyr, Pro, Trp, His, Pro, Gly, Ala, Val, Leu, Ile,中性氨基酸,极性带正电,极性带负电,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,37,2、组成蛋白质的不常见氨基酸,在蛋白质合成后由相应的常见氨基酸修饰形成,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,38,同样具有生物活性

14、，功能不同 细菌细胞壁肽聚糖中有D-谷氨酸和D-丙氨酸； 抗生素短杆菌肽S中含有D-苯丙氨酸； 肌肽和鹅肌肽中的-丙氨酸是遍多酸的组成成分； -氨基丁酸由谷氨酸脱羧产生，是神经递质； 肌氨酸是一碳单位代谢中间物，它和D-缬氨酸是放线菌素D的结构成分； 瓜氨酸和鸟氨酸是尿素循环的中间产物。,3、非蛋白质氨基酸,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,39,4、必需氨基酸,必需氨基酸（essential amino acid）是人或动物机体自身不能合成，必需由食物提供的氨基酸 人体必需氨基酸有8种，即： 赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、 苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸 婴幼儿体内精氨酸和组氨酸为半必需氨基

15、酸 动物种类不同，其必需氨基酸也不同 (书303页),赵丹丹,第3章 蛋白质化学,40,3.2.3 氨基酸的性质,物理性质 酸碱性质 紫外吸收 化学性质,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,41,1、氨基酸物理性质,构成蛋白质的-氨基酸为无色晶体； 氨基酸晶体由离子晶格组成，熔点较高； 一般能溶于水、低浓度酸或低浓度碱中，但不溶于有机溶剂；通常酒精可把氨基酸从其溶液中析出； 除甘氨酸外都有旋光性。,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,42,2、氨基酸酸碱性质,同一氨基酸分子中含有碱性的氨基（-NH2）和酸性的羧基（-COOH），成为两性电解质 氨基酸的-COOH基可解离释放H+，其自身变为COO，释放出的H+

16、离子与-NH2结合，使-NH2基变成-NH3+，此时氨基酸成为同一分子上带有正、负两种电荷的偶极离子或称兼性离子 氨基酸的氨基和羧基的解离情况以及氨基酸本身带电情况取决于它所处环境的酸碱性,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,43,当它处于酸性环境时，由于 -COO结合H+而使氨基酸带正电荷； 当它处于碱性环境时，由于 -NH3+的解离而使氨基酸带负电荷； 当它处于某一pH值时，氨基酸所带正电荷和负电荷相等，即净电荷为零，此pH值称为氨基酸的等电点（isoelectric point），用pI表示。 氨基酸在等电点时，在电场中既不向正极也不向负极移动，由于静电作用，溶解度最小，容易沉淀。利用这一性质可

17、以分离制备某些氨基酸。,氨基酸等电点,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,44,pH=pI,pHpI,pHpI,氨基酸的兼性离子,阳离子,阴离子,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,45,氨基酸两性电解质在水溶液中，既可被酸滴定，又可被碱滴定。对氨基酸进行酸碱滴定，可计算出各种解离基团的解离常数和等电点。 解离常数pKa是一种特定条件下的pH值，即当质子供体与质子受体浓度相等时的pH值。 质子受体 pH = pKa + lg- 质子供体,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,46,Characteristic titration curve of Gly,(pKa1 + pKa2) pI = - 2,对于中性氨基酸：,

18、赵丹丹,第3章 蛋白质化学,47,Titration curve for Glu,(pKa1 + pKaR) pI = - 2,对于酸性氨基酸：,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,48,Titration curve for His,(pKa2+ pKaR) pI = - 2,对于碱性氨基酸：,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,49,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,50,Homework（1）,2已知Lys的-氨基的pKa为10.5，问在pH9.5时，Lys水溶液中将有多少份数这种基团给出质子（即NH 3和NH2各占多少）？ 51.068g的某种结晶-氨基酸，其pK1和pK2值分别为2.4和9.7，溶解于10

19、0mL的0.1mol/LNaOH溶液中时，其pH值为10.4。计算该氨基酸的相对分子质量，并提出其可能的分子式。 6求0.1mol/L谷氨酸溶液在等电点时三种主要离子的浓度各为多少？ 7向1升1mol/L的处于等电点的甘氨酸溶液中加入0.3mol HCl，问所得溶液的pH值是多少？如果加入0.3mol NaOH代替HCl时，pH值又将如何？,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,51,pH=pI,pHpI,pHpI,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,52,Phe的最大光吸收在257nm Tyr的最大光吸收在275nm Trp的最大光吸收在280nm 蛋白质含有芳香族氨基酸， 所以也有紫外吸收能力， 一般在28

20、0nm波长处， 可利用分光光度法 来测定样品中蛋白质的含量。,3、氨基酸紫外吸收,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,53,氨基酸的结构特点结构决定性质 -氨基、-羧基、侧链上的功能基团 -氨基 -羧基 -氨基&-羧基 R基 与亚硝酸反应 成盐反应 与茚三酮反应 与甲醛反应 成酯反应 成肽反应 与DNFB反应 酰化反应 酰化反应 叠氮反应 成盐反应 脱羧基反应 形成希夫碱反应 脱氨基反应,4、氨基酸化学性质,氨基酸的结构特点结构决定性质 -氨基、-羧基、侧链上的功能基团 -氨基 -羧基 -氨基&-羧基 R基 与亚硝酸反应 成盐反应 与茚三酮反应 与甲醛反应 成酯反应 成肽反应 与DNFB反应 酰化反应

21、 酰化反应 叠氮反应 成盐反应 脱羧基反应 形成希夫碱反应 脱氨基反应,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,54,（1）-氨基参与的7个反应,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,55,Van Slyke(范斯莱克)法测定氨基酸 测定生成氮气的体积 计算氨基酸的量 & 蛋白质的水解程度, -氨基与亚硝酸反应,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,56,Sorensen甲醛滴定法测定氨基酸, -氨基与甲醛反应,氨基酸的羟甲基衍生物 降低了氨基的碱性， 使pK2减少了23个单位,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,57,Sanger法测定测定肽链N-末端氨基酸残基 注：2,4 - 二硝基氟苯 2,4 - DNFB Sanger试剂,

22、 -氨基的烃基化反应（氢烃基取代） 之一： -氨基与2,4-二硝基氟苯反应,2,4- DNFB DNP-氨基酸 稳定的黄色二硝基苯氨基酸,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,58, -氨基的烃基化反应（氢烃基取代） 之二： -氨基与苯异硫氰酸酯反应,Edman法测定 肽链N-末端氨基酸残基 注： 苯异硫氰酸酯PITC 苯氨基硫甲酰PTC 苯乙内酰硫脲PTH,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,59,氨基酸+酰氯/酸酐：氢酰基取代 ，酰化 在蛋白质和多肽人工合成中，酰化试剂可作为氨基的保护剂。 丹磺酰氯可用于多肽链N末端氨基酸的标记和微量氨基酸的定量测定。, -氨基的酰化反应（氢酰基取代 ）,赵丹丹,第3章 蛋

23、白质化学,60,-氨基的成盐反应,-氨基形成希夫碱的反应,-氨基脱氨基反应,希夫碱=Schiffs base 引起食品褐变,生物体内经氨基酸氧化酶催化：-氨基 -酮基,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,61,（2）-羧基参与的5个反应,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,62,氨基酸的-羧基可以和碱作用生成盐 其中，重金属盐不溶于水。, -羧基的成盐反应,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,63,在蛋白质人工合成中可用成酯反应将氨基酸活化。 氨基酸的羧基被酯化后 羧基的化学反应性能被掩蔽或者羧基被保护 氨基的化学反应性能被加强或者氨基被活化 氨基更易起酰化反应和烃化反应。 为什么要在碱性溶液中进行？ 各种氨基酸与醇

24、所成的酯的沸点不同，成酯反应也可用于 氨基酸的分离纯化，可进行酯化反应后的氨基酸分级蒸馏分离。, -羧基的成酯反应,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,64,-羧基的酰化反应,反应能使氨基酸的羧基活化，常用于肽的人工合成。,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,65,-羧基的脱羧基反应,-羧基的叠氮反应,反应能使氨基酸的羧基活化，常用于肽的人工合成。,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,66,（3）-氨基&-羧基共同参与的2个反应,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,67, 茚三酮的反应,蓝紫色物质,黄色物质,反应是氨基酸的特异性化学反应,常用于氨基酸定性、定量测定。 反应放出的CO2可用定量法测定其体积,推测出氨基酸的量。

25、反应生成的蓝紫色化合物可在570nm波长比色测定Aa的含量，在0.550g内,Aa量与蓝紫色化合物的颜色深浅成正比。 茚三酮反应常用于Aa的纸层析、薄层层析及电泳的显色。, 成肽的反应,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,68,3.3 肽（peptide）,氨基酸肽蛋白质,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,70,肽（peptide）是氨基酸的线性聚合物，常称肽链（peptide chain）。蛋白质是由一条或多条具有特定氨基酸序列的多肽链构成的大分子。 肽键（peptide bond）是由一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而形成的酰胺键。肽键是肽和蛋白质一级结构的基本化学键。,1、肽的概念,赵

26、丹丹,第3章 蛋白质化学,71,肽键,肽键的形成,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,72,肽是由氨基酸通过肽键缩合而形成的化合物,两分子氨基酸缩合形成二肽，三分子氨基酸缩合则形成三肽,肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全，被称为氨基酸残基(residue)。,人为规定：由20个以内氨基酸相连而成的肽称为寡肽(oligopeptide)，由更多的氨基酸相连形成的肽称多肽(polypeptide)。,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,73,N 末端：多肽链中有自由氨基的一端 C 末端：多肽链中有自由羧基的一端,多肽链有两端,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,74,N末端,C末端,牛核糖核酸酶,赵丹丹,第3章 蛋

27、白质化学,75,肽链的解读从N-末端开始。 肽的命名：从肽链或蛋白质分子的N-末端开始，在每个氨基酸残基后面加“酰”字，最后一个氨基酸残基称为某氨基酸。,丝氨酰甘氨酰酪氨酰丙氨酰亮氨酸,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,76,组成肽键的4个原子(C,O,N,H)和2个相邻的C原子倾向 于共平面，称肽平面，在肽链折叠成三维结构中很重要。 限制绕肽键的自由旋转，肽主链的每个氨基酸残基 只有两个自由度：绕N-C单键的旋转和绕C-C单键的旋转。 C-N键的长度为0.133nm，比正常的C-N键（0.145nm）短， 但比典型的C=N键（0.125nm）长。 肽键中酰胺N带正电荷，羰基O带负电荷，表明肽键具有

28、永久偶极。,2、肽键共振产生结果,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,77,肽键形成刚性平面结构,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,78,谷胱甘肽,谷胱甘肽 与神经传导有关的神经肽 脑啡肽、内啡肽、强啡肽、 P物质 抗菌肽 青霉素、短杆菌肽S、放线菌素D 肽类激素 催产素、加压素、胰高血糖素、胃泌素,3、生物活性肽,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,79,谷胱甘肽(glutathione, GSH)结构,-羧基,-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,80,GSH过氧化物酶,GSH还原酶,NADPH+H+,NADP+,还原型谷胱甘肽简写为GSH,氧化型谷光甘肽简写为G-S-S-G,赵丹丹,第3章 蛋白

29、质化学,81,解毒功能。谷胱甘肽的SH-的嗜核性能可和嗜电子的毒物如致癌剂和药物等结合，从而避免这些毒物和DNA、RNA和蛋白质的结合。 细胞内重要的还原剂。 保护蛋白质中的SH-免遭氧化，以免失活 能还原细胞内产生的H2O2，使其变成H2O 跨膜转运。谷胱甘肽通过-谷氨酰循环完成氨基酸的跨膜转运。,谷胱甘肽的生物学作用,3.4 蛋白质的分子结构 （Molecular structure of protein）,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,83,蛋白质的分子质量很大，结构十分复杂。 一级结构(primary structure) 二级结构(secondary structure) 三级结构(t

30、ertiary structure) 四级结构(quaternary structure),高级结构,初级结构,一级结构是蛋白质高级结构和特异生物学功能的基础,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,84,Levels of structure in proteins,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,85,3.4.1 蛋白质的化学结构,定义：蛋白质的一级结构是指肽链中氨基酸的排列顺序。 主要的化学键： 肽键(peptide bond) 二硫键(disulfide bond) 蛋白质分子的一级结构称为共价结构,蛋白质的一级结构的测定,一级结构是高级结构和特异生物学功能的基础,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,86,1

31、953， F. Sanger（ Cambridge ） has Sequenced the first Protein Insulin,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,87,测定蛋白质中多肽链的数目,拆分蛋白质分子中的多条肽链,断裂肽链内部的二硫键,测定每一肽链的氨基酸组成,鉴定肽链的N-末端和C-末端残基,断开肽链成较小的肽段 ，分别进行分析,测定各肽段的氨基酸序列，一般采用Edman降解法,拼凑读出肽链的一级结构,蛋 白 质 测 序 步 骤,酸、碱、盐或 其它变性剂破坏 非共价键连接,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,88,N-末端二硫键打开 通常采用氧化还原法: 用过量的-巯基乙醇、处理 二硫苏糖

32、醇(DTT) 用烷化剂保护，如碘乙酸还原生成的 Cys的巯基，以防止它重新被氧化,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,89,N-末端氨基酸的鉴定 主要包括： DNFB法(Sanger法) DNP-氨基酸 苯异硫氰酸酯法(Edman法) PTH-氨基酸 二甲氨基萘/丹磺酰氯法(DNS-Cl法) DNS-氨基酸 氨肽酶法：N-端逐个肽链外切酶 C-末端氨基酸的鉴定 主要包括： 肼解法 C-末端氨基酸+(n-1)个氨基酸酰肼 羧肽酶法 C-端逐个肽链外切酶 羧肽酶A（牛） 除Pro Arg Lys以外 除Pro 羧肽酶B（猪） 只水解碱性氨基酸 羧肽酶C（柑橘) Pro 羧肽酶Y（面包）任何,赵丹丹,第3章

33、 蛋白质化学,90,断开肽链成较小肽段的方法 溴化氰(CNBr )裂解- 只切Met-COOH 用羟胺断裂- NaOH在pH9下能切Asn-Gly之间的肽键，但专一性不强，Asn-Leu及Asn-Ala键也能部分裂解。 酶水解- 不同的蛋白酶水解肽链的不同位点，包括： 胰蛋白酶 Lys-COOH, Arg-COOH 胰凝乳蛋白酶(糜蛋白酶) Phe, Tyr, Trp-COOH 胃蛋白酶 NH3-Phe, Tyr, Trp 嗜热菌蛋白酶 木瓜蛋白酶 葡萄球菌蛋白酶和梭菌蛋白酶 梭菌蛋白酶,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,91,肽段氨基酸顺序测定的方法包括Edman降解法、酶水解法、质谱法、气谱-质

34、谱联用法和核苷酸序列的推定法。 Edman降解法测定氨基酸的顺序 步骤：标记试剂苯异硫氰酸酯(PITC) 标记肽链N末端残基，生成苯氨基硫甲酰肽，即PTC多肽 酸性水解环化PTC多肽，产物： 乙内酰苯硫脲氨基酸(PTH-Aa) + (n-1)肽链 用醋酸乙酯抽提分离PTH-Aa 鉴定N-Aa (n-1)肽链重复上述标记、水解、分离和鉴定步骤， 直至完成全长肽链测序 每次可分析50个左右氨基酸残基的多肽 自动蛋白质序列分析仪的理论基础,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,92,通过对蛋白质一级结构的测定，建立 蛋白质序列库，有名的数据库包括： 美国国家生物医学基金会主持的PIR Protein Info

35、rmation Resource （蛋白质信息库） Protein Identification Resouree（蛋白质鉴定库） 美国政府支持的GenBank Gene Sequence Data Bank（基因序列数据库） 欧洲的EMBL European Molecular Biology Laboratory Data Bank（欧洲分子生物学实验室数据库）,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,93,Homework（2）,8现有一个六肽，根据下列条件，给出此六肽的氨基酸排列顺序。 （1）DNFB反应，得到DNP-Val； （2）肼解后，再用DNFB反应，得到DNP-Phe； （3）胰蛋白酶水

36、解此六肽，得到三个片段，分别含1个、2个和3个氨基酸，后两个片段坂口反应呈阳性； （4）溴化氰与此六肽反应，水解得到两个三肽，这两个三肽片段经DNFB反应分别得到DNP-Val和DNP-Ala。 9 有一个肽段，经酸水解测定知由4个氨基酸组成。用胰蛋白酶水解成为两个片段，其中一个片段在280nm有强的光吸收，并且对Pauly反应、坂口反应都呈阳性；另一个片段用CNBr处理后释放出一个氨基酸与茚三酮反应呈黄色。试写出这个肽的氨基酸排列顺序及其化学结构式。 15今有一个七肽，经分析它的氨基酸组成是：Lys、Pro、Arg、Phe、Ala、Tyr和Ser。此肽未经糜蛋白酶处理时，与DNFB反应不产生

37、-DNP-氨基酸。经糜蛋白酶作用后；此肽断裂成两个肽段，其氨基酸组成分别为Ala、Tyr、Ser和Pro、Phe、Lys、Arg。这两个肽段分别与FDNB反应，可分别产生DNP-Ser和DNP-Lys。此肽与胰蛋白酶反应，同样能生成两个肽段，它们的氨基酸组成分别是Arg、Pro和Phe、Tyr、Lys、Ser、Ala。试问此七肽的一级结构是怎样的？,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,94,蛋白质的高级结构 蛋白质的空间结构 蛋白质的立体结构 蛋白质的三维结构 蛋白质的构象 指蛋白质分子中所有原子在三维空间的排布。 包括三个层次：即二、三、四级结构,3.4.2 蛋白质的高级结构,赵丹丹,第3章 蛋白质

38、化学,95,1、蛋白质空间结构的概念,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,96,（1）蛋白质空间结构的组织层次含义,二级结构指多肽链主链折叠产生的由主链内和主链间周期性氢键维系的有规则的构象。 蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，即该段肽链主链骨架原子的相对空间位置，并不涉及氨基酸残基侧链的构象 。 三级结构(tertiary structure)是指多肽链由二级结构元件借助各种次级键主要为疏水作用构建成的总三维结构，包括一级结构中相距远的肽段之间的几何相互关系和侧链在三维空间中彼此间的相互关系。 整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。 四级结构(quater

39、nary structure)是指寡聚蛋白质中以非共价键彼此缔合在一起的各亚基形成聚集体的方式。 蛋白质分子中具有完整的三级结构的二条或多条多肽链（亚基，subunit ）的空间排布及它们接触部位的布局和相互作用。,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,97,（2）稳定蛋白质空间结构的作用力,稳定蛋白质高级结构的作用力主要是一些弱的相互作用或称非共价键或次级键，包括： 氢键(hydrogen bond) 范德华力(vander Waals force) 疏水作用(hyodophobic interaction) 离子键(electrovalent bond) 它们也是稳定核酸构象、生物膜结构的作用力。

40、此外, 二硫键在稳定某些蛋白质构象方面也起重要作用。,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,98,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,99,（3）蛋白质中肽链的空间结构原则,肽键CN具有部分双键的性质，不能沿CN键自由旋转。 由肽键中的4个原子和与肽键相邻的两个-碳原子构成一刚性平面，称为肽平面或酰胺平面(amide plane)，肽平面上各原子所构成的键长、键角固定不变。 肽链主链上的重复结构称为肽单元或肽单位(peptide unit)，它包括完整的肽键及-碳原子，即 C-CO-NH-C 肽单元旋转，就出现各种主链构象，从而使侧链R基处于不同位置，相互影响，达到一最稳状态。 环绕C N键旋转的角度为 环绕C

41、 C键旋转的角度为,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,100,Dihedral Angles 二面角,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,101,多肽链可以看成由C串联起来的无数个肽平面组成,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,102,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,103,2、蛋白质的二级结构,蛋白质的二级结构表现为多肽链中有规则重复的构象，它仅限于主链原子的局部空间排列，不包括与肽链其他区段的相互关系及侧链构象。 常见的二级结构元件有 螺旋 ( -helix ) 折叠 ( -pleated sheet ) 转角 ( -turn ) 无规卷曲 ( random coil ) 主要的化学键：氢键 ( hydrogen

42、bond ),3.4.2 蛋白质的高级结构,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,104,Secondary Structure Elements,-pleated sheet,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,105,（1）螺旋 ( -helix ),-螺旋是蛋白质中最常见、最典型、含量最丰富的二级结构元件，是1951年由美国人Pauling和Corey根据对角蛋白的X-射线衍射结果而提出来的。,Nobel prize 1954,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,106, -螺旋结构模型要点,多肽链的主链围绕 “中心轴”一圈一圈有规律地螺旋上升: 每3.6个氨基酸残基上升一圈，沿螺旋轴方向上升0.54nm，称为螺

43、距，每个氨基酸残基绕轴旋转100,沿轴上升0.15nm (又称3.613螺旋)。 每个氨基酸残基的N-H与其前面第4个氨基酸残基的C=O间形成相邻螺旋圈之间的链内氢键。氢键的取向几乎与螺旋中心轴平行(氢键的4个原子位于一条直线上)，是维系-螺旋的主要作用力。 氨基酸残基的R-基侧链在螺旋的外侧。如果侧链不计在内，螺旋的直径约为0.6nm。 天然蛋白质中的-螺旋大多数是右手螺旋，每个-碳的和分别在-57和-47附近。此外，还有左手螺旋、 310螺旋、螺旋。,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,107,If N-terminus is at bottom, then all peptide N-H bon

44、ds point “down” and all peptide C=O bonds point “up”. N-H of residue n is H-bonded to C=O of residue n+4.,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,108,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,109,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,110,phi(deg) psi(deg) H-bond pattern - handed alpha-helix(3.613) -57.8 -47.0 i+4 pi-helix (4.418) -57.1 -69.7 i+5 310 helix -74.0 -4.0 i+3,赵丹丹,第

45、3章 蛋白质化学,111, 影响-螺旋形成和稳定的因素,氨基酸的组成和排列顺序。 不带电荷的多聚Ala，能自发地卷曲成-螺旋； 以下情况不能形成-螺旋： 多聚Lys、Glu不能形成-螺旋，而以无规卷曲形式存在; 肽链中Pro处产生“结节，螺旋被中断或拐弯； 侧链有较大的R基，如Asn、Leu造成空间位阻。,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,112,（2）-折叠（ -pleated sheet ）,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,113,-折叠与-螺旋相比较，它具有以下特点：,肽链几乎是完全伸展的重复性结构； 肽链主链呈锯齿状，按层平行排列，肽平面排成折叠形式，-碳原子位于折叠线上，称为折叠片，包括平行式

46、（paralle，都是NC或CN ）和反平行式（antiparalle）； -折叠中每条肽链称为-折叠股或股（-strand），相邻肽链肽键上的-CO-与-NH-形成链间氢键，以维持片层间结构的稳定； 肽链的侧链R-基团都垂直于折叠片的平面，并交替地从平面上下两侧伸出。平行式中-碳的和值(分别为-119和+113左右)比反平行式中的（分别为-139和+135左右）小很多。 在两种折叠中，反平行式结构更稳定。 折叠存在于纤维状蛋白和球状蛋白中。,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,114,Parallel less stable,Anti-parallel more stable,赵丹丹,第3章 蛋白质

47、化学,115,某些蛋白质分子结构中螺旋与折叠可以互相转变。例如，加热 可使螺旋转变为折叠。,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,116,Homework（3）,12某一蛋白质分子具有-螺旋及-折叠两种构象，分子总长度为5.5105cm，该蛋白质的相对分子质量为250 000。试计算该蛋白质分子中-螺旋及-折叠两种构象各占多少？（氨基酸残基平均相对分子质量以100计算）。 16(1) 计算一个含有78个氨基酸的-螺旋的轴长。 (2) 此多肽的-螺旋完全伸展时有多长？ 17某一蛋白质的多肽链除一些区段为螺旋构象外，其它区段均为折叠片构象。该蛋白质相对分子质量为240 000，多肽外形的长度为5.06105cm。试计算螺旋占该多肽链的百分数。（假设折叠片构象中每氨基酸残基的长度为0.35nm）,赵丹丹,第3章 蛋白质化学,117,（3）-转角(turn),球状蛋白质的多肽链必须有弯曲、回折和重新定向的能力，才能生成结实、球状的结构。多肽链自身180回折的形成依赖-转角（-turn），或称-弯曲（-bend）或发夹结构（hairpin structure）。 -转角是一种简单的二级结构元件，是非重复性结构。 Pro和Gly