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1、第十二章 细胞增殖及其调控,细胞增殖：细胞物质积累与细胞分裂的循环过程,1）掌握细胞周期及其相关的概念； 2）掌握有丝分裂和减数分裂过程中的主要事件； 3）理解MPF、周期蛋白与CDK激酶以及在细胞周期调控中的作用机理。,本章重点：,第一节 细胞周期概述,细胞周期：细胞由一次分裂结束开始，经过物质积累过程，直到下一次分裂结束为止，称为一个细胞周期。在正常情况下，沿着G1 S G2 M期的路线运转。,标准的细胞周期 、时相,细胞周期的长短取决于G1期，不同细胞类型之间差异较大。,不是每种细胞都有标准的细胞周期，如早期的胚胎细胞没有G1和G2期。,表- 某些真核生物的细胞周期时间,细胞周期各时相的
2、合成活动 ：,G1是细胞周期第一个间隙，主要合成rRNA、蛋白质、脂类和碳水化合物，它为DNA合成作准备 (gap1)。 S是DNA 合成时期(synthesis phase)。组蛋白, DNA复制所需的酶。 G2是DNA合成后期至核分裂开始之间的第二个间隙(gap2)。大量合成ATP、RNA、蛋白质, 包括微管蛋白和成熟促进因子MPF等，为有丝分裂作准备。 M 是细胞分裂时期 (mitosis)。RNA合成停止, 蛋白质合成减少, 以及染色体高度螺旋化。,细胞周期检验点,细胞周期检验点是控制细胞由一个时期向下一个时期正常运转的关卡。主要包括：,G1/S检验点: 酵母中称start点，哺乳动物
3、中称R点(restriction point)，控制细胞由G1进入DNA合成期。 DNA是否损伤？细胞外环境是否适宜？细胞体积是否足够大？,S期检验点：DNA复制是否完成？,G2/M检验点：决定细胞一分为二的控制点，相关的事件包括：DNA是否损伤？细胞体积是否足够大？,中-后期检验点：纺锤体组装检验点。,终末分化细胞：不可逆地脱离细胞周 期，丧失分裂力，但保持生理活性的细 胞。,根据细胞分裂行为，将真核生物细胞分为3类：,连续分裂细胞（周期中细胞）: 在细胞周期中连续运转,休眠细胞（G0期细胞）： 暂时脱离细胞周期，不进行增殖，但可 重新进入细胞周期。,细胞周期同步化,在自然过程中发生，或经人
4、工选择或诱导致使细胞群体中细胞处于细胞周期的同一个时相。,自然同步化：,1多核体 如粘菌 2某些水生动物的受精卵 如海胆卵最初的3次分裂 3增殖抑制解除后的同步分裂：如真菌的休眠 孢子移入适宜环境，一起发芽，同步分裂。,人工同步化,选择同步化：用物理方法将处于细胞周期中同一阶段的细胞从非同步的群体中分离出来。,1）有丝分裂选择法：对数增殖期的细胞与培养皿的附着性低，振荡脱离器壁收集培养。,优点：操作简单，同步化程度高，细胞不受药物伤害。 缺点：获得的细胞数量较少（1-2%）。,2）细胞沉降分离法： 不同时期的细胞体积不同，可离心分离。,优点：可用于任何悬浮培养的细胞 缺点：同步化程度较低,诱导
5、同步化,1）DNA合成阻断法：选用DNA合成的抑制剂，可逆地抑制DNA合成。常用TDR双阻断法：,在细胞处于对数生长期的培养基中加入过量TDR，S期细胞被抑制，其它细胞继续运转，最后停在G1/S交界处。移去TDR。细胞继续运转，再次加入过量TDR。,优点：同步化程度高，适用于任何培养体系。 缺点：产生非均衡生长，个别细胞体积增大。,2）中期阻断法：利用秋水仙素等破坏微管的药物将细胞阻断在中期。 优点：无非均衡生长现象， 缺点：可逆性较差。,利用条件突变体,在正常条件下，细胞表现出正常功能，但在某些条件下，功能出现异常，表现出突变的表型，将此类突变体称为条件突变体（株）。 条件突变体（株）在限定
6、条件下培养，可获得同步化的细胞。例如芽殖酵母，裂殖酵母在限定温度下，可以停留在G2/M和G1/S交界处。,无丝分裂在整个细胞分裂过程看不到纺锤体 的分裂方式。先是细胞核拉长，缢裂成两部分，接着细胞质分裂，从而成为两个子细胞的过程。 （无染色体变化，不均等核分裂，不出现纺锤体）,第二节 细胞分裂,细胞分裂的方式：无丝分裂amitosis 有丝分裂mitosis 减数分裂meiosis,有丝分裂：有纺锤体形成和染色体的变化，染色体单体被平分到子细胞。,减数分裂：染色体复制一次而细胞连续分裂两次，有纺锤体形成和染色体的变化，子细胞染色体数为母细胞的一半。,有丝分裂过程及其主要特征：,间期：G1、 S
7、、 G2,中心体 G1期末开始复制，S期细胞含一对中心体，G2开始向两极分离，参与星体、纺锤体的形成。,染色质DNA复制,有丝分裂过程及其主要特征：,M期：前期、前中期、中期、后期、未期、胞质分裂,前期：有丝分裂开始，染色体的凝集,分裂极的确定(动粒开始装配，纺锤体开始组装，星体出现), 核仁的消失。,星体-围绕中心体向外辐射状发射的微管组成的结构。,前中期：核膜破裂到染色体列队排到赤道板之前的这一阶段。核纤层解聚，染色体进一步缩短变粗，纺锤体微管开始与动粒结合。,中期：染色体列队排到赤道板， 染色体最短最粗。,列队速度0.05-1um/秒,后期：姊妹染色体单体分离，分别向两极运动； 动粒微管
8、变短，染色体向两极运动（后 期A）；极性微管变长，两极距离变长 （后期B）。,染色体运动速度1-2um/分,后期A： 染色单体分离 后期B：两极延伸,星体微管,动粒微管,极性微管,马达蛋白与微管系统共同协作，推动染色体分离,未期：染色单体到达两极，开始去浓缩；动粒微 管消失，极性微管继续加长；核膜重新组 装，核仁出现。,胞质分裂：起始于后期，完成于末期。,动物细胞在赤道板处形成分裂沟，分裂沟收缩。,胞质分裂：植物细胞在赤道面上形成中央板，以此为基础形成细胞壁。,第三节 细胞的减数分裂,减数分裂是在有性生殖细胞（配子）形成过程中发生的染色体数目减半的一种特殊的有丝分裂方式。,一次DNA复制，两次
9、分裂，第一次是减数分裂，第二次是等数分裂。 染色体组数目减半 发生遗传重组,减数分裂的主要特点：,MEIOSIS,特点：1.同源染色体要发生交换重组。2.同源染色体组要发生随机组合。,减数分裂期I的各个时期：,前期I 细线期 偶线期 粗线期 双线期 终变期,中期I,后期I,末期I,减数分裂前间期：S期长，DNA复制不完全。,主要事件是完成同源染色体的配对，在此过程中要发生配对同源染色体间的交换重组。,细线期（凝集期）：染色体呈细线状；染色单体连接紧密，具有念珠状的染色粒；染色体的端粒同核膜相连。,偶线期：同源染色体配对，联会，二价体（bivalent） 、四分体（tetrad），联会复合体；合
10、成剩余DNA。( Zyg-DNA, 0.3%)。,联会复合体 synaptonemal complex ，SC,SC是偶线期两条同源染色体配对形成的复合结构。蛋白质和DNA片段是SC的主要组成成分。,侧成分,中央成分,粗线期：同源染色体的非姊妹染色单体间发生基因交换重组，染色体缩短变粗，合成部分p-DNA，合成专用组蛋白并置换。,双线期：重组结束，同源染色体相互排斥、开始分离，交叉开始端化，但仍有联系，不同程度解凝聚，基因转录活跃，联会复合体消失。,重组结,染色体重组-交换与交叉 在同源染色体联会期间，同源染色体要 发生断裂和重接，在此过程中发生同源 染色体间的交换，在显微镜下可见到交 叉（c
11、hiasma）。 交叉(crossover)是交换的结果。,同源染色体的交换与交叉,终变期：二价体显著变短。由于交叉端化过程的进一步发展，故交叉数目减少，同源染色体仅在端部连接。核仁开始消失，核被膜解体。,减数分裂的前期I,细线期,偶线期,粗线期,双线期,终变期,中期,减数分裂期II,中期II,后期II,末期II,前期II,描述各时相的重要事件,有丝分裂是一次细胞周期, DNA复制一次, 分裂一次,染色体由2n2n; 减数分裂是两次细胞周期,DNA复制一次,细胞分裂两次, 染色体由2n1n; 有丝分裂中,每个染色体是独立活动; 减数分裂,染色体要配对、联会、交换和交叉。 有丝分裂之前,经DNA
12、合成,进入G2期,才进行有丝分裂;减数分裂之前,DNA合成时间很长(99.7%合成,0.3%未合成),一旦合成,即进入减数分裂期,G2期长短变化大; 有丝分裂时间短,1-2小时;减数分裂时间长,20多小时,至几年。,减数分裂与有丝分裂的比较 共同点: 都是通过纺锤体同染色体的相互作用进行细胞分裂。 不同点： 有丝分裂是体细胞的分裂方式，减数分裂主要是产生配子的过程;,减数分裂的生物学意义,保证了染色体数目在世代交替中的恒定,从而保证了物种相对的稳定性。 染色体间分离时的重组,提供了遗传的多样性; 同源染色体配对时交换重组,提高了基因内、基因间重组的频率,加快了进化的速度。,细胞周期调控中的一些
13、关键问题：,细胞如何准确地复制遗传物质及传给子细胞的？ 调节细胞周期的关键调控因子是什么？ 细胞周期是如何调控的？,第四节 细胞周期调控,2001年诺贝尔生理学/医学奖得主,利兰哈特韦尔(美),保罗纳西（英）,蒂莫西亨特（英）,控制细胞周期的基因，其中一种被称为“START” 的基因对控制各个细胞周期的最初阶段具有决定性的作用。,发现了CDK（周期蛋白依赖性激酶）。,发现了调节CDK的功能物质CYCLIN.,以人细胞系HeLa和非洲爪蟾为研究代表 MPF，促成熟因子，p32+p45,以裂殖酵母、芽殖酵母为研究代表-CDC细胞分裂基因，p34cdc2 p34cdc28,以海胆卵为研究代表-Cyc
14、lin A、B、C、D， 细胞周期蛋白,细胞周期调控因子的发现和研究：,细胞融合实验 研究者：1970年，Colorado 大学的Potu Rao 和 Robert Johnson 研究方法：使用的细胞系HeLa融合 早熟染色体凝集(premature chromosome condensation,PCC ）或称染色体超前凝集。,一、MPF的发现及其作用,G1期细胞与M期细胞融合,G1期PCC为单线状，因DNA未复制。,S期细胞与M期细胞融合,S期PCC为粉末状，因DNA由多个部位开始复制。,G2期细胞与M期细胞融合,G2期PCC为双线染色体，说明DNA复制已完成,MPF的发现 成熟促进因子
15、(maturation promoting factor，MPF）,早期称为M-期促进因子(M-phase promoting factor, MPF)，是指M期细胞中存在的促进细胞分裂的因子。 非洲爪蟾和无脊椎动物的卵母细胞及早期的胚细胞也证实MPF的存在,卵细胞提取物注射实验,1,X,2,1988年Maller实验室的Lohka 将非洲爪蟾卵的MPF纯化，经鉴定由32KD和45KD两种蛋白组成(p32和p45)，二者结合表现出蛋白质激酶活性，可使多种蛋白质磷酸化。由此证明MPF是一种蛋白激酶。,1960s Leland Hartwell以芽殖酵母, 1970s Paul Nurse等人以裂
16、殖酵母为实验材料，利用温度敏感突变株，发现许多与细胞分裂有关的基因(cell division cycle gene，cdc) ：,二、P34cdc2激酶的发现与MPF的关系：,cdc2和cdc28是酵母细胞周期中重要的基因，都编码一个34KD的蛋白激酶。,-cdc2基因是裂殖酵母细胞周期中重要的基因，突变型在限定的温度下无法分裂，停止在G2/M交界处；p34cdc2 为cdc2基因编码蛋白，是蛋白激酶。,-cdc28基因芽殖酵母细胞周期中重要的基因，突变型在限定的温度下无法分裂，停止在G2/M或G1/S交界处；p34cdc28 为cdc28基因编码蛋白，也是蛋白激酶，是 p34cdc2 的同
17、源物。,-两者与相关蛋白结合，如p56cdc13 ，才具有激酶活性（ MPF中的p45 p56cdc13 ？）,- p34cdc2特异抗体识别能够MPF中的p32，并增强MPF 活性，证实p34cdc2是p32的同源物。,三、细胞周期蛋白的鉴定 1983年Timothy Hunt首次发现海胆卵受精后，在其卵裂过程中两种蛋白质的含量随细胞周期剧烈变化，故命名为周期蛋白(cyclin)。后发现各类动物来源的周期蛋白mRNA均能诱导蛙卵的成熟。 实验方法 获得同步化的受精的海胆卵细胞 在有放射性氨基酸的培养液中培养 每10分钟取一次样分离纯化蛋白质进行分析 实验结果,周期蛋白的积累和降解,周期蛋白分
18、子结构的特点和类型,特点：在细胞周期中呈周期性变化。均含有一段约 100个氨基酸的保守序列，称为周期蛋白框，介导 周期蛋白与CDK结合，形成周期蛋白-CDK复合体。,作用：激活CDK，引导CDK作用于不同的底物。,类型： G1期周期蛋白： G1表达， 在G1、 S和G1/S转化过程中起调节作用；C端含一端特殊的PEST序列。 M期周期蛋白：间期表达积累，在M期表现出调节功能；近N端含9个氨基酸组成的破坏框，参与泛素介导的降解作用。,P426 图12-34,细胞周期蛋白氨基酸序列分析 N端破坏框(destruction box),N端9个氨基酸链or C端PEST序列,周期蛋白框,在细胞周期中周
19、期蛋白和MPF的波动,P45(MPF) -周期蛋白B- p56cdc13(酵母),MPF的结构组成 Paul Nurse（1990） 是一种蛋白质激酶，由两个不同的蛋白质（亚基）组成的异质二聚体，可使多种蛋白质磷酸化: 催化亚基:p32, cdc蛋白是p32的同源物 是丝氨酸/苏氨酸型蛋白激酶 其活性有赖于周期蛋白，故蛋白称为周期依赖性蛋白激酶(cyclin-dependent protein kinases,CDKs); 调节亚基：p45,周期蛋白(cyclin)是p45 的同源物。,MPF的结构,周期蛋白依赖性激酶CDK,周期蛋白,MPF=Cdc2+CyclinB,四、CDK激酶和CDK激
20、酶抑制物,Cdc2又被称为CDK1，可将特定蛋白磷酸化，促 进细胞周期运行，被称作细胞周期引擎。 -将核纤层蛋白磷酸化导致核纤层解体、核膜消失， -将H1磷酸化导致染色体的凝缩,CDK是细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase)，与细胞周期蛋白结合才具有激酶的活性。,现有的CDK共同点：均含有一段相似的激酶 结构域，这一区域有一段保守序列，即PSTAIRE， 与周期蛋白的结合有关。,1、CDK,表12-2 某些CDK与周期蛋白的配对关系及执行的功能,CDK种类 可能结合的周期蛋白 执行功能的可能时期,CDK1（p34cdc2） A,B1,B2,B3 G2/M CD
21、K2 A,D1,D2,D3,E G1/S,S CDK3 G1/S CDK4 D1,D2,D3 G1/S CDK5 D1,D3 CDK6 D1,D2,D3 G1/S CDK7 H CDK8 C CDK12,2、CDKI,CDK inhibitor( CDKI): 细胞周期蛋白依赖性激酶 抑制因子,对细胞周期起负调控作用.,目前发现的CDKI分为两大家族:,Ink4(Inhibitor of CDK4): P16ink4a、P15ink4b、P18ink4c、P19ink4d，特异性抑制CDK4cyclin D1、CDK6cyclin D1复合物。,CIP/Kip(Kinase inhibitio
22、n protein)：P21cip1 (cyclin inhibition protein 1)、P27kip1、P57kip2等，抑制大多数CDK的激酶活性.,P21cip1抑制CDK和PCNA,P21cip1主要对G1期CDK激酶起抑制作用，还能与DNA聚合酶的辅助因子PCNA（proliferating cell nuclear antigen）结合，直接抑制DNA的合成。,G1，S期,五、细胞周期运转调控,1、G1/S 期转化与调控,- G1周期蛋白：Cyclin D 、E 或A -CDK激酶： CDK4，6，2 - G1- CDK复合体： Cyclic D- CDK4，6 (D1-3
23、, G1/S 期转化必需) Cyclic E- CDK 2 （S期启动必需） Cyclic A - CDK 2 （与DNA复制有关） -作用：参与调控G1/S期转化 -降解作用：泛素化降解途径，PEST序列,G1期，在生长因子的刺激下，cyclin D表达，并与CDK4、CDK6结合，使下游的蛋白质如Rb磷酸化，Rb释放出转录因子E2F，促进许多基因的转录，如编码cyclinE、A和CDK1的基因。（Rb：成视网膜细胞瘤蛋白，E2F：转录因子）,Cyclin D与CDK结合使Rb释放结合的转录因子E2F,在G1-S期， cyclinE与CDK2结合，促进细胞进入S期。CyclinE的抗体能使细
24、胞停滞于G1期。,2、 G2-M期转化与调控,在G2-M期，cyclinB （或 cyclinA）与CDK1结合，CDK1使底物蛋白磷酸化、如将组蛋白H1磷酸化导致染色体凝缩，核纤层蛋白磷酸化使核膜解体。,作用底物 见 430页的表12-3,M期CDK1的激活,M期CDK1的激活起始于分裂期cyclin的积累。,结合cyclinB的CDK1被Wee1/mik1激酶将CDK的Thr14和Tyr15磷酸化,被CAK激酶(CDK1- activating kinase)将Thr161的磷酸化,不具有活性，使CDK1-cyclinB(前体MPF)不断积累。,Wee1/ mik1的活性下降，Cdc25c
25、使CDK1的Thr14和Tyr15去磷酸化，去除了CDK活化的障碍。,P431 图12-38,CDK1,CDK1,CDK1,周期蛋白B/A,周期蛋白B/A,周期蛋白B/A,周期蛋白B/A,Thr14,P,Tyr15,P,Thr161,P,Thr14,Tyr15,Thr161,P,Thr14,Tyr15,Thr161,无激酶活性,无激酶活性,有激酶活性,APC,+,+,+,+,Wee1/Mik1,CAK,Cdc25c,图12-38 CDK1激酶活性综合调控示意图,CDK1的激活需要Thr14和Tyr15去磷酸化和Tyr161的磷酸化,CDK1激酶催化不同的底物（主要是磷酸化丝氨酸和苏氨酸），参与
26、细胞的多种功能。,细胞周期运转到分裂中期后，M期周期蛋白通过泛素途径迅速降解。在中期当CDK活性达到最高时，激活后期促进因子APC，将泛素连接在cyclinB上，导致cyclinB被蛋白酶体（proteasome）降解，完成一个细胞周期。,3、分裂中期向分裂后期转化中的M期周期蛋白,APC: anaphase promoting complex,26S蛋白酶体是一个大型的蛋白酶，可将泛素化的蛋白质分解成短肽。,泛素是由76个氨基酸组成的高度保守的小分子多肽，普遍存在于真核细胞，故名泛素。共价结合泛素的蛋白质能被蛋白酶体识别和降解，这是细胞内短寿命蛋白和一些异常蛋白降解的普遍途径。,26S蛋白酶
27、体由一个筒状的20S的催化核心和一个称为PA700的调节部分组成，催化蛋白质降解。,周期蛋白的泛素化降解途径 多聚泛素化作用(polyubiquitination) 泛素激活酶(ubiquitin-activating enzyme, E1) 泛素结合酶(ubiquitin-conjugating enzyme, E2) 泛素连接酶(ubiquitin ligase, E3) 促后期复合物（后期促进因子） (anaphase-promoting complex, APC),蛋白酶体的降解作用,Polyubiquitination,多聚泛素化作用,泛素激活酶,泛素结合酶,泛素连接酶,APC活性变
28、化是认识细胞分裂中期向后期转化的关键点,通过APC活性变化调控周期蛋白B的降解和有丝分裂的退出。 当MPF的活性在有丝分裂中期达到最高峰时, 它将APC磷酸化并将其激活； 接着发生周期蛋白B多聚泛素化, 引起周期蛋白B的降解； 由于周期蛋白B是MPF的一个必需亚基, 它的降解势必导致MPF的逐渐失活； 在G1期的后期,APC完全失活,使得周期蛋白B的浓度升高,同时提高MPF的活性, 以便进入下一个有丝分裂期。,中期,后期后阶段,末期,间期,前期,多聚泛素链,周期细胞中有丝分裂周期蛋白水平的调节,真核生物细胞周期调控的关键时期： 三个关键的过渡： G1期S期：Cyclic D- CDK4，6，
29、Cyclic E- CDK 2， Cyclic A - CDK 2 G2 M期： cyclinB （A）- CDK1 中期后期及胞质分裂期过渡： cyclinB的降解 两类周期蛋白-CDK复合物: G1期周期蛋白-CDK复合物 有丝分裂M期周期蛋白-CDK复合物,真核生物细胞周期调控模型,图12-11 真核生物细胞周期调控模型,在复制期始点装配DNA复制复合物,激活G1cyclin-CDK复合物,S-cyclin-CDK复合物被抑制,G1后期激活S-cyclin-CDK复合物,S期CDK复合物激活复制复合物,七、生长因子对细胞增殖的影响,单细胞生物的增值取决于营养，多细胞生物细胞的增值与细胞通
30、信有关。,生长因子：是一类与细胞增殖有关的信号物质，已知几十种，多数能促进细胞增殖，又称有丝分裂原（mitogen），如EGF、NGF。,作用方式：主要通过旁分泌作用于邻近细胞。,信号通路主要有：ras途径，cAMP途径和磷脂酰肌醇途径。如通过ras途径，激活MAPK，MAPK进入细胞核内，激活c-myc，myc作为转录因子促进cyclin D、SCF、E2F等G1-S有关的许多基因表达，细胞进入G1期。,图13-29 生长因子的作用机理,有丝分裂的生物学意义,核内每个染色体准确地复制，有规则而均匀地分配到两个子细胞的核中，使两个子细胞与母细胞具有同样质量和数量的染色体，保证了子细胞在遗传组成
31、上与母细胞完全一致。,MPF=Cdc2+Cyclin,Paul Nurse（1990）进一步证实MPF的两种蛋白P32和P45分别是Cdc2和cyclin的同源物，两者结合表现蛋白激酶活性。Cdc2为催化亚单位和cyclin为调节亚单位。,图 CDK1的激活需要Thr14和Tyr15去磷酸化和Tyr161的磷酸化,裂殖酵母 cdc25突变型,表现为抑制Cdc 2的活性;Cdc25表达不足，细胞细胞体积增大不分裂. wee1突变型,表现为促进Cdc 2的活性, Wee1表达不足，细胞很小就开始分裂了。,2、动粒与着丝粒,纺锤体-由大量微管和微管结合蛋白组装的形如纺锤状结构的细胞器。与染色体的分离有关。前期开始装配，末期去装配。,动粒是附着在着丝粒上的、与染色体的运动有关的细胞器。通常与着丝粒形成着丝粒-动粒复合体。,3、纺锤体,