12分子生物学研究方法.ppt

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1、第十二章 分子生物学研究方法,2,SNP概述,单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)：单个核苷酸的突变而引起的多态性。 单体型(Haplotype)：染色体上某一区域的一组相关联的SNP等位位点被称作单体型。相邻SNPs的等位位点倾向于以一个整体信息传递给后代。,3,SNP分类： 基因编码区SNP(cSNP)： 同义cSNP：SNP导致的编码序列改变并不影响蛋白质的氨基酸序列，突变碱基和未突变碱基含义相同。 非同义cSNP：碱基改变使蛋白质序列发生变化，从而影响蛋白质的功能。常是生物性状发生改变的直接原因。 基因调控区SNP(pSNP)：影响基

2、因表达量的多少。 基因间随机非编码区(rSNP)： cSNP、pSNP在功能和疾病发生、发展方面具有更重要的意义。,4,SNP检测技术,基因芯片、Taqman技术、分子信标、焦磷酸测序。 Taqman技术原理： 探针设计上，利用荧光共振能量转换(FRET)技术，探针5和3端分别用特殊的染料标记，称为供体-受体染料对或引爆-猝灭染料对。 正常情况下，由于探针5端荧光基团和3端猝灭基团紧邻在一起，供体所发荧光由于其光谱在空间上接近受体染料而被猝灭，只有当两者分离时才能检测到供体所发出的荧光。,5,6,Taqman技术的基本原理是利用Taq酶的5核酸外切酶活性，PCR反应中除了两个传统的PCR引物P

3、1、P2外，还有第三个引物P3(等位特异性Taqman探针)，含有待检测的SNP位点，特异结合在P1结合位点的下游。P3探针的5端和3端分别标有荧光基团和猝灭基团，因P3的3端被猝灭基团封阻而不能以自身为引物进行扩增。,7,PCR反应中，Taq酶以P1为引物合成新的DNA链，随着反应的进行，Taq酶接触到P3并激发其53外切酶活性，使P3从5端开始降解，最后DNA链得以延伸，而P3探针上的荧光基团和猝灭基团由于不再在一个分子上，荧光基团释放而发出荧光信号。,8,焦磷酸测序法： 核心：由四种酶催化的同一反应体系中的酶级联反应。 四种酶：DNA聚合酶(DNA poly merase)、ATP硫酸化

4、酶(ATP sulfurylase)、荧光素酶(luciferase)、双磷酸酶(apyrase)。 底物：5-磷酰硫酸(adenosine 5-phosphosulfate, APS)、荧光素(luciferin)。,9,每轮测序反应中，只加入一种dNTP，如果该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团(PPi)，PPi可最终转化为可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值，每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比，然后加入下一种dNTP，继续DNA链的合成。,10,第一步：1个特异性的测序引物和单链DNA模板结合，然后加入酶混合物(DNA

5、Polymerase、ATP硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶)和底物混合物(5-磷酰硫酸APS和荧光素Luciferin)。,11,第二步：向反应体系中加入1种dNTP，如果它刚好能和DNA模板的下一个碱基配对，则会在DNA聚合酶的作用下，添加到测序引物的3末端，同时释放出一个分子的焦磷酸(PPi)。,12,第三步：在ATP硫酸化酶作用下，生成的PPi与APS结合形成ATP。在荧光素酶催化下，生成的ATP又与荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光。通过CCD光学系统即可获得一个特异的检测峰，峰值的高低则和相匹配的碱基数成正比。,13,第四步：反应体系中剩余的dNTP和残留的少量ATP在双磷酸酶的

6、作用下发生降解。,14,第五步：加入另一种dNTP，使第24步反应重复进行，根据获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息。,15,16,SNP应用,人类基因单体型图的绘制。 SNP与疾病易感基因的相关性分析。 指导用药与药物设计。,17,cDNA差示分析法克隆基因RDA,代表性差异分析(representational difference analysis, RDA)： RDA充分发挥了PCR以指数形式扩增双链DNA模板而以线性形式扩增单链模板的特性，通过降低cDNA群体复杂性和更换cDNA两端接头等方法，特异扩增目的基因片段。,18,因试验对象(Tester)和供试探针(Driver)在接

7、受差示分析前均经一个4碱基切割酶处理，形成平均长度256bp的代表群(representation)，保证绝大部分遗传信息能被扩增。每次T减D反应中两者物质的量比要求达到1:100或更高，经2-3次重复，T群体非特异性序列几乎没有偶然逃脱的可能性。,19,20,使用Gateway技术进行克隆和表达一切皆有可能,21,通过TOPO反应将目的基因PCR产物连接到Entry载体中。,22,LR反应可将目的片段从Entry载体重组到表达载体中。Entry载体上基因两端具有attL1和attL2位点，目的载体中含有attR1和attR2位点，通过重组形成新的位点attB1和attB2，从而将目的基因亚克

8、隆到表达载体中。,23,双向电泳,等电聚焦：蛋白质在含有载体两性电解质形成的一个连续而稳定的线性pH梯度中电泳。蛋白质分子在偏离其等电点的pH条件下带有电荷，因此可以在电场中移动，当蛋白质迁移至其等电点位置时，其净电荷数为零，在电场中不移动，据此将蛋白质分离。 SDS-聚丙烯酰胺：分子质量,24,25,26,27,28,29,30,31,生物学问题的提出,实验模型的设计,实验组和对照组样品的制备,蛋白样品的IEF和PAGE电泳分离,图像扫描和初步分析,感兴趣蛋白点的切取,胰酶对脱色后蛋白质的消化,质谱的多肽指纹图、微测序分析,质谱结果的生物信息学分析和比对,新蛋白质的发现,其它实验的进一步验证

9、（western blot等）,蛋白信息的初步获得,32,蛋白质的质谱分析技术,基质辅助激光解析电离：飞行质谱仪(MALDI-TOF)。 电喷雾质谱ESI-MS：,33,从2D胶中分离得到的或其它来源的蛋白质，酶解成小肽后与基质混合，将样品混合物点到金属靶表面上并使之干燥结晶，然后用激光轰击，将呈离子化气体的待分析物从靶表面喷射出去。 离子化的气体中每个分子带有一个或更多的正电荷，这些气体肽段在电场中被加速后，到达检测器的时间由肽段的质量和其所带电荷数的比值(m/z)决定。,34,35,生物质谱的一般流程： 蛋白酶解成肽段。 肽段分离。 离子进入质谱，得到质谱图。 用计算机软件将质谱图与蛋白数

10、据库进行比对，从而鉴定出蛋白。,36,37,38,基因表达系列分析技术,基因表达系列分析(Serial analysis of gene expression, SAGE)是以DNA序列测定为基础，定量分析全基因组表达模式的技术，能够直接读出任何一种细胞类型或组织的基因表达信息。 Long SAGE；Short SAGE。,39,在转录组水平上，任何长度超过9-10个碱基的核苷酸片段都可能代表一种特异性的转录产物。 因此，用特定限制性核酸内切酶分离转录产物中具有基因特异性的9-10个碱基的核苷酸序列并制成标签。 将这些序列标签连接、克隆、测序后，根据其占总标签数的比例即可分析其对应编码基因的表

11、达频率。,40,41,42,原位杂交技术(in situ hybridization, ISH),是用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织、细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位或相对定量研究的一种手段。 分为RNA原位杂交和染色体原位杂交。,43,RNA原位杂交：用放射性或非放射性(地高辛、生物素等)标记的特异性探针与被固定的组织切片反应，若细胞中存在与探针互补的mRNA分子，两者杂交产生双链RNA，就可通过检测放射性标记或酶促免疫反应显色，对该基因的表达产物在细胞水平上做出定性定量分析。,44,荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization

12、, FISH)：首先对寡核苷酸探针做特殊的修饰和标记，然后用原位杂交法与靶染色体或DNA上特定的序列结合，再通过与荧光素分子相偶联的单克隆抗体来确定该DNA序列在染色体上的位置。 FISH技术不需要放射性同位素，实验周期短，检测灵敏度高。,45,按标记物不同又可分为直接标记法和间接标记法。 用生物素(biotin)或地高辛配体(digoxingenin)标记称为间接标记，杂交后需要通过免疫荧光抗体检测方能看到荧光信号，因而步骤较多、操作麻烦，其优点是在信号较弱或较小时可经抗原抗体反应扩大，需进行染色体定位的基因片段往往较小，因而间接标记具有其优势。,46,直接用荧光素标记DNA的方法称为直接标

13、记。由于直接标记的探针杂交后可马上观察到荧光信号，省去了繁琐的免疫荧光反应，不再需要购买荧光抗体，也由于近年来荧光素的亮度和抗淬灭性的不断改进和提高，直接标记的荧光探针越来越成为首选，其荧光强度和信号大小都易于在普通荧光显微镜下观察，操作过程中也不需要严格避光，使FISH过程变得简便而易于操作。缺点是信号不能放大。,47,48,49,50,基因定点突变技术,重叠延伸介导的定点诱变： 大引物诱变法： 重叠延伸介导的定点诱变： 使用带突变碱基的互补引物对两段目的基因序列分别进行第一轮PCR扩增。 将扩增产物进行重叠退火延伸，获得带突变碱基的完整序列。 使用该完整序列的两端引物进行第二轮PCR扩增。

14、,51,52,大引物诱变法： 将所使用的引物之一进行定点碱基突变后，作第一轮PCR扩增。 将第一轮扩增产物作为第二轮PCR扩增的引物来使用，从而使第二轮扩增的产物带突变的碱基。,53,PCR1使用正向诱变引物(M)和反向引物(R1)扩增产生双链大引物，退火与野生型基因复性，第二轮PCR时第二种退火产物可以延伸，再用正向引物(F2)扩增产生带有突变的双链DNA，F2的退火温度明显高于第一轮PCR所使用的引物M和R1，可以忽略引物M和R1所造成的干扰。,54,55,酵母单杂交系统(yeast one-hybrid system),是二十世纪90年代中期发展起来的技术，常用于研究DNA-蛋白质之间的

15、相互作用。 其特点是可识别稳定结合于DNA上的蛋白质，可在酵母细胞内研究真核生物中DNA-蛋白质之间的相互作用，并通过筛选DNA文库直接获得与靶序列相互作用蛋白的编码基因。 此外，该体系也是分析鉴定细胞中转录调控因子与顺式作用元件相互作用的有效方法。,56,将已知的特定顺式作用元件构建到最基本启动子(minimal promoter, Pmin)上游，把报告基因连接到Pmin下游，然后将编码待检测转录因子cDNA与已知酵母转录激活结构域(AD)融合表达载体导入酵母细胞，该基因产物如果能够与顺式作用元件相结合，就能激活Pmin启动子，使报告基因得到表达。,57,58,酵母双杂交系统(Yeast

16、two-hybrid system),原理： 真核生物的转录因子大多是由两个结构上分开、功能上独立的结构域组成的，即由DNA结合域(BD)和转录激活域(AD)构成。 单独的BD能与特定基因地启动区结合，但不能激活基因的转录，而由不同转录因子的BD和AD所形成的融合蛋白却能行使激活转录的功能。,59,实验方法： 首先利用基因重组技术将编码已知蛋白的DNA序列连接到带有酵母转录因子BD编码区的表达载体上。 导入酵母细胞中，使之表达带有BD的融合蛋白，与报告基因上游的启动调控区相结合，准备作为“诱饵”捕获与已知蛋白相互作用的基因产物。 将AD的DNA与待筛选的cDNA文库中不同插入片段相连接，获得“

17、猎物”载体，转化含有“诱饵”的酵母细胞。,60,实验方法： 一旦酵母细胞中表达的“诱饵”蛋白与“猎物”载体中表达的某个蛋白质发生相互作用，不同转录调控因子的AD和BD结构域就会被牵引靠拢，激活报告基因表达。 分离有报告基因活性的酵母细胞，得到所需要的“猎物”载体，获得与已知蛋白相互作用的新基因。,61,62,63,64,Far western-体外蛋白质相互作用技术,65,66,67,CFP(青色荧光蛋白)的发射光谱与YFP(黄色荧光蛋白)的吸收光谱有相当的重叠，当它们足够接近时，用CFP的吸收波长激发，CFP的发色基团将会把能量高效率地共振转移至YFP的发色基团上，引起CFP的发射荧光将减弱

18、或消失，主要发射将是YFP的荧光。,细胞内蛋白质相互作用研究-荧光共振能量转移法(FRET),68,用CFP吸收波长440nm作为激发波长，实验灵巧设计，使当蛋白质a与b没有发生相互作用时，CFP与YFP相距很远不能发生荧光共振能量转移，因而检测到的是CFP的发射波长为480nm的荧光。 当蛋白质a与b发生相互作用时，由于蛋白质b受蛋白质a作用而发生构象变化，使CFP与YFP充分靠近发生荧光共振能量转移，此时检测到的就是YFP的发射波长为527nm的荧光。,69,2000年，RNA的研究进展被美国科学杂志评为重大科技突破； 2001年“RNA干扰”作为当年最重要的科学研究成果之一，再次入选“十

19、大科技突破”； 2002年12月20日，Science杂志将“Small RNA & RNAi”评为2002年度最耀眼的明星。同时， Nature杂志亦将Small RNA评为年度重大科技成功之一。 2003年，小核糖核酸的研究第四次入选“十大科技突破”，排在第四位。 RNA研究的突破性进展，是生物医学领域近20年来，可与HGP（人类基因组计划，生物通网站注）相提并论的最重大成果之一。,70,RNAi(RNA interference, RNA)技术,RNA干扰广泛存在于植物、真菌、线虫、昆虫、蛙类、鸟类、大鼠、小鼠、猴乃至人类的几乎所有真核生物中，大肠杆菌中也存在RNA干扰现象。 双链小分子

20、RNA可高效、特异性降解细胞内同源mRNA，阻断靶基因表达，使细胞出现靶基因缺失的表型，这种现象称为RNA干扰(RNAi)。 这些双链小RNA称siRNA(Small/short interfering RNA, siRNA)。 引发RNAi的双链RNA长度必须在30nt以上，具有5-P、3-OH基团，且3端有两个突出的碱基。,71,72,miRNA,研究发现miRNA的主要功能是调节生物体内在的与机体生长、发育、疾病发生过程有关的基因的表达，而且研究人员推测这种小分子调节着人类三分之一的基因,73,MicroRNA也可以写做miRNA ，是一种2125nt长的单链小分子RNA。它广泛存在于真

21、核生物中，是一组不编码蛋白质的短序列RNA，其本身不具有开放阅读框（ORF）。成熟的miRNA，5端有一个磷酸基团，3端为羟基。,74,编码miRNAs的基因最初产生一个长的pri-RNA分子，这种初期分子还必须被剪切成约70-90个碱基大小、具发夹结构单链RNA前体（pre-miRNA）并经过Dicer酶加工后生成。,75,76,MiRNA的作用方式,miRNA基因是一类高度保守的基因家族，按其作用模式不同可分为两种：第一种以线虫lin-4为代表，作用时与靶标基因不完全互补结合，进而抑制翻译而不影响mRNA的稳定性（不改变mRNA丰度），这种miRNA是目前发现最多的种类； 第二种以拟南芥m

22、iR-171为代表，作用时与靶标基因完全互补结合，作用方式和功能与siRNA非常类似，最后切割靶mRNA；,77,MiRNA的特异性,研究表明MiRNAs在物种间具有高度的保守性、时序性和组织特异性在特定的时间、组织才会表达。 拟南芥中的miR-171仅在其花序中高水平表达，在某些组织低水平表达，在茎、叶等组织中却无任何表达的迹象； 20-24h的果蝇胚胎提取物中可发现miR-12，却找不到miR3-miR6，在成年果蝇中表达的miR-1和let-7也无法在果蝇胚胎中表达。 MiRNA表达的时序性和组织特异性暗示miRNA的分布可能决定组织和细胞的功能特异性，也可能参与了复杂的基因调控，对组织

23、的发育起重要作用。,78,相同点：,MiRNA和siRNA都是由22个左右的核苷组成； 它们都是Dicer酶的产物； 它们都会和RISC复合体结合； 它们都可以抑制靶标基因的翻译；,79,两者之间的主要差异：,起源阶段 SiRNA：通常是外源的，如病毒感染和人工插入的dsRNA被剪切后产生外源基因进入细胞（注：病毒入侵，或者是自身合成RNA中出现错误，细胞内就会产生双链RNA，来阻止这些异常基因的表达）。 MiRNA：是内源性的，是一种非编码的RNA；由miRNA基因表达出最初的pri-miRNA分子。,80,成熟过程 SiRNA：直接来源是长链的dsRNA（通常为外源）；经过Dicer酶*切

24、割形成双链siRNA,而且每个前体dsRNA能够被切割成不定数量的siRNA片段。 MiRNA：在细胞核中转录的较大的pri-miRNA经由Drosha(一种RNAse 酶) 加工成为单链pre-miRNA；接着，发夹状、部分互补的pre-miRNA在细胞质中被Dicer*（一种RNAse 酶）酶切割形成miRNA；在生物体中的表达具有时序性、保守性和组织特异性。,81,功能阶段 miRNA可抑制靶标基因的翻译，也可导致靶标基因降解，即在转录水平后和翻译水平起作用；而siRNA只能导致靶标基因的降解，即为转录水平后调控；,82,凝胶阻滞实验(electrophoretic mobility s

25、hift assay, EMSA),是体外分析DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。 原理：在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的DNA朝正电极移动的距离与其分子量的对数成反比。如果此时DNA分子与某种蛋白质相结合，那么由于分子量增大，它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，在特定电压和时间内朝正电极移动的距离也就相应缩短了，所以当某个DNA片段与细胞提取物混合之后，如果它在凝胶电泳中的移动距离变小了，就说明它可能已与提取物中的某种特殊蛋白质分子相结合。,83,84,EMSA还用于研究与蛋白质相结合的DNA序列的特异性。 通过设计一系列引入一个或数个突变碱基的放射性标记探针，运用EMSA来评

26、估这些突变对探针DNA与结合蛋白相互作用的影响，进而确定该探针DNA分子中与蛋白质直接发生相互作用的关键性碱基。,85,86,噬菌体展示(phage display)技术,原理：将编码外源蛋白或多肽的基因片段插入编码噬菌体外壳蛋白基因的下游，使外源蛋白或多肽与噬菌体外壳蛋白融合表达并组装于噬菌体表面，被展示的多肽或蛋白可保持相对独立的空间结构和生物活性，且不影响噬菌体的侵染和扩增能力，通过筛选获得特异性目标基因。该技术的优势是可将特定分子的基因型和表型统一在同一病毒颗粒内。,87,88,分别将编码不同蛋白质或多肽的DNA片段插入在基因的编码序列中，使在噬菌体颗粒的表面展现出各种不同的蛋白质或多肽，此即通常所说的随机多肽文库。 然后通过亲和层析处理，将所要分离的某种特定的目标噬菌体，例如展示具有抗体结合特性的多肽的噬菌体颗粒分离出来。,89,90,91,本章要点,SNP原理及应用。 Taqman技术。 焦磷酸测序法原理。 cDNA差示分析法克隆基因。 Gateway大规模克隆技术。 双向电泳技术。 等电聚焦电泳。 SDS-PAGE电泳。 Westerh blotting技术。,92,荧光共振能量转移技术。 原位杂交技术。 基因定点突变技术。 蛋白质的质谱分析技术。 基因表达系列分析技术。 酵母单杂交及双杂交系统。 凝胶阻滞实验。 噬菌体展示技术。 RNAi技术。,