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1、第十九章 基因工程导论,本章学时数：3-4学时 本章重点：1.基因工程原理和方法 2.转基因技术及应用,遗传工程,广义的遗传工程 指的是用遗传学手段来改造或重组生物的遗传特性的技术，包括杂交、细胞工程、染色体工程、蛋白质工程和基因工程等。 狭义的遗传工程 仅指基因工程。,基因工程,Gene engineering 指用类似工程设计的方法，人为地在体外将核酸分子插入质粒、病毒或其他载体中，构成遗传物质的新组合，并将它转移到原先没有这类分子的寄主细胞中扩增和表达。 DNA重组技术是基因工程的基础。,重组DNA技术,Recombinant DNA technology,1972年，Berg发明。 定
2、义：指在体外将不同来源的DNA进行剪切和重组，形成嵌合DNA分子，通过载体系统，将之导入宿主细胞，使其扩增表达从而使宿主细胞获得新的遗传性状。 步骤：1. 分离制备目的基因或特定的DNA片段 2. 目的基因与载体连接，构建重组DNA分子 3.重组DNA分子引入宿主并扩增表达。,质粒DNA,提取,酶切,细胞,连接，形成嵌合质粒,在大肠杆菌中扩增,DNA重组技术,基因工程的基本内容和技术,基因工程的核心技术是分子克隆 主要内容： 从复杂生物体基因组中，分离带有目的基因的DNA片段或用化学方法合成基因。 将目的DNA片段与能够自我复制并具有选择标记的载体分子在体外连接，形成重组DNA分子 将重组的D
3、NA分子引入到适宜的受体细胞中进行扩增 从繁殖的大量细胞群体中筛选和鉴定，以获得重组DNA分子的受体细胞的克隆 从所筛选的受体细胞克隆提取已扩增的目的基因后，或再将其克隆到表达载体上，导入寄主细胞，以便在新的背景下实现功能表达，生产人们所需的物质，或将已扩增的目的基因作进一步的分析研究。,基因工程的基本技术,核酸研究技术 核酸提取技术 核酸鉴定技术 核酸测序技术 核酸人工合成技术等 培养技术 微生物培养技术 动植物细胞培养技术 转化技术 筛选技术等等,限制性核酸内切酶,限制性内切核酸酶restriction endonuclease，简称限制酶restriction enzyme 可识别DNA
4、链的特定碱基顺序并在特定位置将DNA链切断，形成平切或错切端口的水解酶。 限制酶的命名规则： 通常用细菌学名（属名和种名）、菌株名、特征和发现的顺序缩写表示。如EcoRI是从含R质粒的大肠杆菌中分离的第一个限制性内切酶。,三类限制酶的主要特性,限制酶的共性：只降解双链DNA分子；各有特定的核苷酸序列识别特异性；酶活性需要镁离子的激活 根据结构、切割位点和识别序列间的距离不同和酶激活所需辅助因子的差异等，可以将限制酶分为三类,II型限制酶的基本性质,R=A 或 G Y=C 或 T M=A 或 C K=G 或 T S=C 或 G W=A 或 T H=A 或 C 或 T B=C 或 G 或 T V=
5、A 或 C 或 G D=A 或 G 或 T N=A 或 C 或 G 或 T,修饰酶,修饰酶 内切酶对自身的DNA也有可能的破坏。 修饰酶识别特定的顺序并将其甲基化，保护不被限制性内切酶作用。,DNA的限制酶分析和物理图谱,DNA连接酶,DNA连接酶(ligase)是一种能够催化DNA中相邻的3OH和5磷酸基末端之间形成磷酸二酯键并把两段DNA拼接起来的核酸酶。 连接酶催化反应的最适温度是37。 连接酶把两个具有粘性末端的DNA分子连接在一起的方式称作“粘接”，而使平末端的双链DNA分子彼此连接的方式则称为“端接”。连接酶也用于连接化学合成的衔接物(linker)，这有助于体外合成人造基因。,反
6、转录酶,反转录酶（reverse transcriptase,RT）是一类很独特的DNA聚合酶，以RNA为模板来指导DNA的合成。 1970年首先在RNA病毒中发现，由反转录病毒的pol基因编码。 现在常用的反转录酶由和两条多肽链组成， 肽链的羧基端具有反转录酶活性，而氨基端有RNaseH活性； 肽链具有以RNA-DNA杂种分子为底物的53脱氧核酸外切酶活性。,反转录酶的应用,以mRNA为模板合成cDNA 克隆基因 制备探针,目的基因的分离或制备,人工合成目的基因 当RNA的碱基顺序或蛋白质的氨基酸顺序已知时，用特定的仪器进行合成。 目的基因分离 富含G/C对的基因 加热后用SI核酸酶切除单链
7、，离心得到双链片段。 易得到mRNA的基因 用polyT柱分离mRNA，在反转录酶作用下合成cDNA，除去RNA，用DNA聚合酶下合成双链。 并非严格意义上的基因。 PCR扩增 进化中DNA保守性很强，不同生物同一功能基因的顺序大部分相同，设计引物PCR扩增。,目的基因的获得,PCR扩增获得目的基因,http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=Nucleotide,载体 vector,分子克隆的载体应具备的条件： 在细菌中增殖，可以在菌株间传递，也可以转化菌株。 含有酶切位点，最好是对多种限制酶都有单一切点，切点不在复制原点内。 含有抗性基因（具备对重
8、组体容易检测的选择性遗传标记）。 其他 包括质粒、噬菌体和病毒,载体 vector,分类： 克隆载体，以繁殖DNA片段为目的的载体。如pBR322及其衍生质粒。 穿梭载体，既能在真核细胞中复制又能在原核细胞中复制的载体。 表达载体，用于使克隆的外源基因在宿主细胞内表达的载体。需要有强启动子和终止子；转录在诱导时进行，产生的mRNA具有AUG和SD。,构建重组DNA,质粒载体,基本性质 共价闭合的环状双链DNA分子，大小从1kb到200kb不等，常带有特殊的基因。 含有复制子，可独立复制但依赖宿主的酶系 松弛型复制质粒和严紧型复制质粒 具有转移特性，接合型质粒（自主转移质粒）和非接合型质粒 具有
9、不相容性,质粒载体的构建,早期用天然质粒，有局限性 改造 改变大小 引入适当的选择标记 改变限制酶的切割位置 增加合适的酶切位点,pBR322的结构,4362kb 有HindIII、BamHI、Sal I、Pvu II、Cal I、AvaI和EcoR1单一切点 有Ampr和Tetr基因,pBR322的构建,噬菌体载体,噬菌体是迄今为止研究得最为详尽的一种大肠杆菌双链DNA噬菌体。它的DNA分子两端各有由12个核苷酸组成的粘性末端，两者互补可形成COS位点(cohesive end site)。,柯斯质粒载体,柯斯质粒(cosmid)是人工构建的带有粘性末端cos的一类质粒，其主要组成有质粒的复
10、制起始区和抗药标记、一种或多种限制酶的单一切点以及DNA的COS区小片段(约20至数百个碱基对)。 因而这类质粒兼具噬菌体和质粒的优越性，又具有高容量的克隆能力，容纳外源DNA的长度可达45 kb左右。,单链DNA噬菌体载体,真核基因克隆的载体,植物 用于植物基因转移的病毒载体 质粒载体 动物 病毒载体 人工染色体,用于植物基因转移的病毒载体,多种植物病毒经过改造后可用作载体。,质粒载体,Ti 和Ri等,动物病毒载体,改造后失去毒性的动物病毒,人工染色体,artificial chromosome 一些真核基因过于庞大不能作为单一片段克隆到噬菌体载体或质粒中 P1噬菌体人工染色体(p1arti
11、ficial chromosome，PAC) 细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome，BAC) 酵母人工染色体(yeast artificial chromosome，YAC),酵母人工染色体YAC,以酵母作为构建人工染色体的材料，是由于其基因组很小，约为114mb，且其中极少内含子，没有重复序列和假基因。其基因行为和表达方式基本上与高等生物类似，如复制、重组、染色体分离等等，因而是研究真核生物分子遗传学的重要实验模型。 近年对有关酵母染色体的主要组分：着丝粒、自主复制序列(autonomously replicating sequence，ARS)及端
12、粒的研究又较清楚，并被分离和克隆出来，其功能区已缩小到数百碱基对，这些对研究高等生物染色体的结构与功能也是极为有利的。,基因组克隆,用限制性内切酶切割整个基因组DNA，把所得的大量基因组DNA片段与载体连接，然后转化到细菌中去，让宿主菌长成克隆。由此而得的克隆中每个细胞的载体上都包含有特定的基因组DNA片段。这样的一套克隆便称作基因组克隆，而这些克隆中的一套基因组DNA片段则叫做基因组文库(genomic library)。,基因组文库 genome library,将某种生物的基因组DNA用限制性内切酶切割后分别与载体组合构建一系列重组质粒，转移到细菌中，通过细菌增殖保存基因片段，形成多个基
13、因克隆。 在得到的克隆数目多到可以把该生物的全部遗传信息都包含在内时，这些克隆的总体就称为基因组文库。,基因文库,cDNA文库的构建和应用,cDNA基因文库(cDNA library)是指以 mRNA为模板，在反转录酶及其他一系列酶的催化作用下所获得的双链cDNA，经与适当载体连接并转化到寄主细胞内进行扩增，由此而构成包含着相应基因编码序列的一群克隆。 与基因组DNA克隆不同，用作cDNA克隆的真核mRNA，其间隔序列早已在拼接过程中被删除，而由这种成熟mRNA为模板转变而来的DNA基因，自然也不含有非编码序列。 cDNA克隆除以 mRNA为起始材料这一优点外，其构建比较简易可行，而且由于每一
14、个cDNA克隆都只含有一种mRNA序列，这样在选择中出现假阳性的概率也就较低,基因工程技术的应用,基因工程技术的应用,生物合成 基因结构与定位 RFLP 基因治疗 环境治理 分子标记,生物合成,目的基因在细菌中的表达，产生人们需要的蛋白质。 1977，Boyer将编码人体脑激素的基因转移到大肠杆菌中，使细菌合成了人体生长激素释放抑制因子。 发酵法生产的成本得到大大降低,植物基因工程与农作物育种,动物基因工程与畜禽品种改良,借助基因工程技术把外源目的基因导入生殖细胞、胚胎干细胞和早期胚胎，并在受体染色体上稳定整合，使之经过各种发育途径得到能把外源目的基因传给子代的个体，即转基因动物(transg
15、enic animal)。,基因工程技术与医学研究,基因治疗,1990年，首例基因治疗 将有功能的基因插入病毒基因组中，感染体外培养的淋巴细胞，筛选转基因表达细胞进行扩增，然后注回患者体内，可以保持一段时间的效果，达到目的。,转基因技术及应用,农杆菌介导法,根癌农杆菌含有致瘤质粒（Ti质粒），在T-DNA区有反向重复顺序，可以与宿主相应区域发生重组整合。 步骤： 1.构建重组Ti质粒，导入农杆菌 2.农杆菌与受体植物共培养 3.筛选转化后代 4.分子检测,其他转化方法,植物病毒介导法 种质系统介导法 花粉管通道法 生殖细胞浸泡法 子房注射法 ,其他转化方法,物理的方法 电激法 基因枪法 超声波
16、法 激光微束法 显微注射法 化学的方法 PEG法 脂质体介导法,动物转基因技术及应用,1.受精卵原核显微注射法 2.胚胎干细胞介导法 3.反转录病毒转移基因,基因分离新技术,转座子标签技术 转座子插入引起突变，表明插入位点的基因发生变化。tagging 基因组消减技术 基因敲除技术,分子标记,又称遗传标记（genetic marker），指可以追踪染色体、染色体的某一片段、某个基因或某一特定DNA序列在家系中传递轨迹的任何一种遗传特性。 包括： RFLPs RAPD AFLP SNP VNTR、STS、EST,限制性片段长度多态性RFLP,Restrict fragment length po
17、lymerphism 进化过程中碱基突变导致酶切位点变化，从而产生限制性片段（RF）在长度和多少上的差异，反映了不同个体在DNA上的差异。 RF以共显性方式遗传，没有表型效应，如果知道某种性状与一定限制性片段连锁，则可以判断后代中该性状的有无。,RFLP,产前诊断,对于某些先天性遗传疾病，严重影响人的生活，可以通过RFLP的产前诊断避免畸形儿或患病儿的出生。 从羊水细胞或绒毛膜细胞提取DNA，进行酶切和电泳、与父母的RFLP进行比较分析，确定。,亲子鉴定和犯罪证据,子女获得来自父母的特异性RFLP，通过比较可以判定子女与成年人（父母）的血缘关系。 RFLP的个体差异性，通过犯罪嫌疑人的DNA与犯罪现场得到的样品DNA的比较，从分子上提供确切的证据。,DNA证据,亲子鉴定,随机扩增多态性DNA （RAPD）,Random Amplified Polymorphism DNA 用较短的引物（10-30nt），将基因组DNA进行扩增，经琼脂糖电泳分离，染色或放射自显影显示多态性。,RAPD扩增结果,扩增片段长度多态性（AFLP）,Amplified Fragment Length Polymorphism DNA经双酶切后，形成分子量不等的随机RF，用特定的接头连接在两端，通过引物与接头序列的识别，经PCR扩增后，聚丙烯酰胺电泳分离。形成特异的条带。,作业,