3酶与辅酶.ppt

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1、1,第四章 酶和辅酶,第一节 概述,第二节 酶的化学结构与催化活性,第三节 酶的作用机理,第四节 影响酶促反应的因素,第五节 酶工程简介（自学）,第六节 维生素和辅酶,本章重点和难点、复习思考题,2,一 酶的概念,二 酶的作用特点,1与一般催化剂的共性,2作为生物催化剂的特点,三 酶的分类与命名,1习惯命名,2. 系统命名,第一节 概述,3. 其它习惯归类命名法,四 酶分离提纯与活力测定,1. 分离提纯(自学）,2. 酶活力测定,3,一 酶的概念 1926年, Summer: 脲酶结晶酶是活细胞产生的具有特殊催化能力的蛋白质，是生物催化剂。 2 拟酶(核酶): 1981年，Cech(USA)发

2、现四膜虫的rRNA前体有催化活性，自我剪切和拼接形成有生物功能的26S rRNA。 3 脱氧核酶：具催化活性的DNA。,4,5,4 抗体酶(abzyme,催化抗体 )： 一类具催化能力的免疫球蛋白称为抗体酶或催化抗体 。 1980s.Lerner发现某些抗原与抗体结合时才转位到抗原分子的表面, 这种现象类似于酶与底物诱导契合。 Tramontano 等用一种在结构上与某些酯类水解反应的过渡态相似的化合物用为半抗原制备单克隆抗体。此抗体能使酯的水解反应加速1000倍。,6,一般认为： 酶是生物体内活细胞产生的、能催化热力学上允许进行的化学反应的催化剂 化学本质：绝大多数为蛋白质，少数为核酸。 生

3、物细胞都产生自己所需的酶。 生物体中各种代谢反应都需特殊的酶参加。,7,二 酶作用的特点 1 与一般催化剂的共性, 在反应前后本身不发生质和数量上的变化。 能加速反应达到平衡点，但不改变平衡 只能催化热力学上允许发生的化学反应, 不能催化本身不能发生的化学反应。 都能降低反应所需要的活化能。 用量少而效率高。,8,2 作为生物催化剂的特点, 酶是蛋白质组成，具有蛋白质的一切属性。 能使蛋白质变性的因素如高温、强酸、强碱、重金属离子、紫外光等因素都会使酶丧失活性,而无机催化剂在高温等条件下也不失效。,9, 酶的催化效率高 酶催化反应的反应速度比催化反应的速度要高108-1020倍 易变性 使蛋白

4、质变性的理化因素(强酸、 强碱、重金属、高温、紫外线、超声波、剧烈振荡等)均可影响其活性。 酶活性的可调节性 有些酶的催化活性与辅因子有关。除去辅因子后酶失去活性。,10, 作用底物的专一性/特异性: 酶对其作用的物质(底物、substrate)有严格的选择性。 酶的专一性实质上是酶分子对底物分子的识别。 不同的酶所表现的专一性在程度上有很大的差别，主要取决于酶的活性中心的构象和性质。,11,酶专一性,结构专一性,立体异构专一性,相对专一性,绝对专一性,键专一性,基团专一性,旋光异构专一性,几何异构专一性,12, 结构专一性：对底物分子化学结构的特殊要求 绝对专一性: 只作用于一种底物（脲酶只

5、作用于尿素） 相对专一性: 作用于一类化合物或一种化学键. * 键专一性:如酯酶, -COOR * 族专一性(基团专一性): 胰蛋白酶只水解Lys、 Arg的-COOH参与的肽键。,13, 立体异构专一性: 对底物化学结构的立体构型有要求和选择. 旋光异构专一性: L-氨基酸氧化酶只能氧化L-氨基酸。 几何异构专一性：延胡索酸酶只作用于延胡索酸(反-丁烯二酸), 而不能作用于顺-丁烯二酸。,酶作用的专一性机理,14,三 酶的分类与命名 1 习惯命名 根据作用的底物命名,如淀粉酶分解淀粉、酯酶分解酯等。 根据催化的反应性质命名，如催化脱氢的酶叫脱氢酶，催化转氨基作用的酶叫转氨酶。 根据底物及催化

6、的反应性质命名.如琥珀酸脱氢酶催化琥珀酸脱氢氧化。,15, 根据酶的来源命名。 来源于胃的蛋白酶叫胃蛋白酶，来源于胰脏的叫胰蛋白酶。 惯用命名法比较好命名,但缺乏系统性;酶常常重复，一酶多名或一名多酶。,16,2 系统命名 Enzyme Commission(酶学委员会,EC)： 酶的名称应明确表明：酶的底物及催化反应的性质。 包括：底物及反应类型, 若有多种底物都应表明, 用“:”分开。若底物是水时可以略去。名称最后加一个“酶 ase” 字 如: 乙醇脱氢酶系统命名为: 乙醇:NAD+ 脱氢酶,17, 6大类: 1、2、3、4、5、6 根据底物中被作用的基团或键的特点，每一大类又可分为若干亚

7、类, 1、2、3、 每一亚类可分为若干亚亚类， 酶在亚亚类中的排号 酶的分类编号由4个数字组成, 每个数字间用“.”分隔, 编号之前都要用EC. 如: EC4.2.1.2, 分类与编号:,18, 酶的6大类:, 第一大类:氧化还原酶类, 第二大类:转移酶类, 第三大类:水解酶类, 第四大类:裂合酶类, 第五大类:异构酶类, 第六大类:合成酶类,19, 第一类: 氧化还原酶类(Oxido-reductases） 包括: 脱氢酶,氧化酶,过氧化物酶,加氧酶, 羟化酶等。,乙醇脱氢酶：催化乙醇脱氢 乙醇:NAD+ 氧化还原酶(EC1.1.1.1),20, 第二大类: 转移酶类(transferase

8、) 催化分子间基团的转移，通式：AX+B=A+BX,如 氨基转移酶、甲基转移酶、磷酸转移酶等。,如：谷丙转氨酶(Glutamate-Pyruvate transaminase, GPT）：催化氨基从Ala转到a-酮戊二酸的酶。,21, 第三大类:水解酶类 利用水分子使底物分子共价键断裂, 即催化水解的酶类. 通式：R-R+ H2O RH + ROH 如淀粉酶, 蛋白酶类等,22, 第四大类: 裂合酶类(lyases) 能催化一种化合物分裂为几种化合物，或由几种化合物合成一种化合物。,裂解反应大多是从底物上移去一个基团而形成双键的反应或其逆反应。 通式为：A-B=A+B,包括: 醛缩酶、水化酶、

9、脱羧酶及脱氨酶等。,23, 第五大类: 异构酶类（isomerase) 催化各种同分异构体(即分子式相同，而结构式不同的化合物)间的相互转变, 即促进分子内部基团的重新排列, A = B,包括几种不同类型： 异构酶：如葡萄糖-6-磷酸异构酶，G6P到F6P。 易向酶:催化不对称碳原子上的基团易向. 变位酶:催化分子内基团的易位. 消旋酶：D-氨基酸消旋酶使D-aa变为 L-aa 分子内氧化还原酶 分子内转移酶,24,25, 第六大类:合成酶类(synthetase)或连接酶(ligases)。 催化两种物质(双分子)合成一种物质的反应，这种合成反应一般是吸能过程。因而通常有ATP等高能物质参加

10、反应。 通式可写成为： A + B + ATP = A-B + ADP + Pi (AMP+PPi),谷氨酰胺合成酶(GS，glutamine synthetase) 催化谷氨酰胺的合成。 NH3 + Glu + ATP Gln + ADP + Pi + H+,26,3 其它习惯归类命名法 按酶蛋白(催化反应时的组合方式）分 单体酶(monomeric enzyme): 只有一条肽链组成，大多数属于水解酶类，如蛋白酶、胰蛋白酶、核糖核酸酶、 溶菌酶等。 寡聚酶(oligomeric)： 由相同或不相同的两条以上亚基构成的，不是以共价键连接，彼此之间很易分开。 多酶复合体(multienzyme

11、 complex)： 是由几种酶彼此嵌合形成的复合体，能催化一系列反应连续进行。例如脂肪酸合成酶、丙酮酸脱氢酶系.,27, 按酶含量稳定性分 恒态酶: 参与代谢和物质转化的基本组成的酶, 含量一般相对恒定, 其活性仅受基本反应动力学系统本身和组成因素的调节 调节酶: 在代谢和物质转化起调节作用的酶, 含量和组成因机体的机能状况而不同. 如共价调节酶(酶原激活、磷酸化与脱磷酸化等)、 别构酶、 同工酶、多功能酶。,28, 按合成特点分： 组成酶(结构酶): 诱导酶:在诱导时合成的酶 按作用位点分： 胞内酶：包括结合酶和溶酶 胞外酶:,29, 酶的组成分类 简单蛋白酶(单成分酶): 只由蛋白质成分

12、，由蛋白质起催化功能 结合蛋白酶(双成分酶): 除蛋白质部分外，还含有非蛋白组分的这种酶，也叫全酶(holoenzyme)。 全酶 = 酶蛋白 + 辅助因子.,30,四 酶的分离提纯及活力测定 1 分离提纯（自学） 目的: 研究酶的理化性质(结构、功能、生物学功能等)；酶的鉴定；作为生化试剂或药物。 步骤: 材料的选择与预处理,31, 细胞破碎 抽提:低温, 缓冲溶液, 分离与提纯: 方法有盐析、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀、离子交换法等 注意: 操作应在低温条件下; 加入EDTA螯合剂以防止重金属使酶失活; 加入少量巯基乙醇以防止酶蛋白-SH被氧化;不能过度搅拌以免产生大量泡沫使酶失活; 等等

13、,32, 保存：将酶制品进一步浓缩,结晶,干燥,以便保存. 一般应在-20以下低温保存。 保存浓缩的酶液,用硫酸铵沉淀或硫酸铵反透析法使其浓缩. 冰冻干燥: 先低温结冰再减压使水分升华. 浓缩酶液加入等体积甘油后可于-20以下较长时间保存.,33,2 酶活力测定 酶活力(酶活性, enzyme activity): 酶催化一定化学反应的能力, 通常以最适条件下它所催化的化学反应的速度来表示. 酶催化的反应速度愈大, 酶的活力愈大。反之亦然。 酶促反应速度: 习惯上是根据某酶在最适条件下,单位时间内催化底物减少的量或者产物的生成量来表示。,34, 反应速度测定原理: 终点法 即反应进行一段时间后

14、中止反应，再用理化方法来测定底物或产量的变化量。 动力学法 即连续测定反应过程中产物、或反应物、或辅酶的变化量，直接测定酶反应的初速度.,35,斜率=浓度/时间, 酶活力的主要测定方法 分光光度计法 荧光法 同位素测定法 电化学方法：pH测定法、(氧)电极法 旋光法 气体检测法,36, 酶活力的表示方法 活力单位(active unit):在最适条件下，单位时间内酶促消耗底物的量或生成产物的量。 1活力单位 (国际单位，U)：酶在最适条件（最适pH，最适底物浓度, 25) 1分钟催化1微摩尔底物转化为产物所需的酶量: 1 Kat: 每秒钟转化1 mol底物所需的酶量。 1 Kat= 6107

15、U,37,酶的比活力(specific activity)： 每毫克酶蛋白所具有的酶活力单位数, 一般用“酶单位数/mg蛋白”来表示. 表示酶的纯度，比活力愈高，表示酶愈纯。 酶转换数(turnover number) Kcat: 酶被底物饱和时，每秒钟、每个酶分子转换底物的微摩尔数，也称酶的分子活性(molecular activity). Kcat= K3, 即酶将底物转换成产物的效率。,38,第二节 酶的化学结构与催化活性,一、酶的化学组成与类别,1单纯蛋白酶类,2结合蛋白酶类,二、酶的结构与功能,1活性中心与必需基团,1酶的变构效应,2同工酶,3酶原的激活,6固定化酶(自学）,三、酶结

16、构与酶活性调节,4酶的化学修饰调节,5酶分子的聚合和解聚,39,一 酶的化学组成及类别 1 单纯蛋白质酶类(simple protein): 只含氨基酸，酶活性仅仅决定于它的蛋白质结构, 如酯酶, 脲酶等。 2 结合蛋白质酶类(conjugated protein): 全酶 = 酶蛋白(apoenzyme, 脱辅酶)+ 辅助因子(cofactor),40, 辅助因子 辅酶(coenzyme): 与酶蛋白结合较松驰，用透析法可能与酶蛋白分离的辅助因子。 辅基(prosthetic group): 与酶蛋白结合较紧密,用透析法不能除去的小分子物质称为辅基。, 辅助因子类型 金属离子:Zn2+、 F

17、e2+、K+、Cu2+、Na+、 Mn2+ 金属有机化合物, 如CytC的为铁卟啉 小分子有机化合物, 如NAD, FAD等,41, 酶蛋白: 单体酶：只有一条多肽键,分子量在13000- 35000之间,一般是水解酶 寡聚酶：由2个以上的亚基组成,亚基之间由非共价键相连，亚基可以是相同的，也可以是不同的，分子量在35000-几百万. 多酶复合体：由几个酶有组织的聚集在一起形成有一定结构的复合体。,功能上相互配合,一个酶的产物是第二个酶的底物，如丙酮酸脱氢酶系、脂肪酸合成酶系。有利于一系列反应的连续进行，有利于提高酶的效率，便于机体对连续反应的调控。,42,43,二 酶的结构与功能 1 酶的活

18、性中心与必需基团 必需基团: 在反应过程中酶与底物的接触只限于酶分子的少数基团或较小部位,其中有些基团若经过化学修饰(如氧化、还原、酰基化、烷基化等)使其改变,则酶的活性丧失。 酶的活性中心: 酶分子中直接和底物结合，并和酶催化作用直接有关的区域。,44, 单纯蛋白质酶类: 活性中心就是酶分子在三维结构上比较靠近的少数几个氨基酸残基或是这些残基上的某些基团。 它们在一级结构上可能相距甚远，甚至位于不同的肽链上，通过肽链的盘绕、折叠而在空间构象上相互靠近。 对于需要辅因子的酶: 辅酶或辅基(或它们分子上的某一部分结构)往往就是活性中心的组成部分。,45,46, 活性中心的两个功能部位: 结合部位

19、: 底物与酶分子结合的部位，由一些参与底物结合的有一定特性的基团组成，决定酶的专一性。 可有各种亚位点，分别与底物不同部位结合。 催化部位: 底物的敏感键在此处被打断或形成新的键, 从而发生一定的化学变化，由参与催化反应的基团组成，决定酶的催化能力。 一个酶的催化位点可以有多个。,47, 活性中心特性: 多为一凹穴，穴内基团多数是非极性,仅含有少数几个极性基团，形成一个疏水的微环境。凹穴的非极性环境对酶促反应的进行非常有利。 活性中心的常见基团： SerThr的-OH, His的咪唑基、Cys的巯基、 AspGlu侧链羧基。 活性中心的基团均属必需基团，但必需基团还包括活性中心外对维持酶空间构

20、象的必需基团。 只有酶活性中心的功能基团处于适当的空间位置，酶才具有活性.,48,49,The active site pocket lies just below and to right of Ser195,S,S,S,S,Active site: Ser195, His57,Asp102,Chymotrypsin (胰凝乳蛋白酶),50,Chymotrypsin (胰凝乳蛋白酶),Trypsin (胰蛋白酶),51,Carboxypeptidase A (羧肽酶 A),52,溶菌酶的活性中心,为一种黏多糖溶解酶，能液化细菌细胞壁，革兰阳性菌细胞壁构成的不稳定性多糖类物质，使肽链断裂成可溶

21、解的小分子可溶性粘肽，从而杀死细菌。,53,三 酶结构与酶活性调节 1 酶的变构效应 别构(变构)酶: 具有多个亚基，分子表面除具有活性中心外, 还有调节位点的酶. 一个或多个调节位点, 调节位点间，调节位点与活性位点间在空间上通常是分开的。 一般为分支代谢的第一个酶。 寡聚酶。含有二个或二个以上亚基。,54, 别构效应: 调节物与调节位点结合使别构酶构象改变，使酶活性中心对底物的结合和催化作用受到影响，从而调节酶的反应速度和代谢速度。,55, 别构酶的动力学不遵循米氏方程，而呈S形曲线。,56, 别构效应物: 引起别构效应的调节物 正效应物, 负效应物(使酶性下降) 大多数为寡聚酶: 催化亚

22、基(具活性中心), 调节亚基. 同促效应: 调节物就是底物 异促效应: 调节物不是底物, 两者结合在 不同的部位上。 同促-异促效应: 受底物分子和调节物分子 的调节.,57, 别构酶活性调节的机理(自学) 序变模型: 多个亚基依次分别与底物(调 节物)结合，构象依次发生改变. 紧张型(T型) 松驰型(R型) 齐变模型:别构酶或者全部呈T态(不利于 结合底物)， 或者全部是R态(利于结合底 物), 每个亚基都同步发生这种改变 紧张型(T型)松驰型(R型),58,59,60,天冬氨酸转氨甲酰酶 （ATCase)： 六个催化亚基形成二个三聚体， 六个调节亚基形成三个二聚体。 有六个催化位点和六个调

23、节位点。 CO2+Gln+ 2ATP氨甲酰磷酸 + 2ADP + Pi + Glu（合成酶） 氨甲酰磷酸 +Asp Pi + 氨甲酰天冬氨酸 (ATCase) - - - - CTP(反应终产物) CTP是ATCase的别构抑制剂，ATP是它的别构激活剂。, 例子(自学),61,62,Six catalytic subunits (C), Six regulatory subunits (R),T,R,63,64, 当底物只有氨甲酰磷酸和Asp，天冬氨酸转氨甲酰酶 (ATCase)的反应动力学曲线为S型。 表明底物开始时与酶结合力不高，一旦结合后引起酶分子构象发生变化而使酶分子上其它的Asp结

24、合部位对Asp的亲和力增强，从而加快反应。即发生正协同效应。 当反应体系中有CTP时，CTP与ATCase的调节亚基结合酶分子后变成对底物亲和力低的构象，从而使酶与后续Asp的亲和力减弱，反应速率下降，S型曲线右移。,65, 当体系加入ATP时，ATP与酶的调节亚基结合后使酶构象变成与底物亲和力高的形式，从而与Asp的亲和力增强，反应加快，S型曲线左移。 当ATP的浓度使酶饱合时曲线呈双曲线，别构效应消失。,66,ATP使酶饱合,+ ATP,无ATP或CTP 只有底物,+ CTP,CO2 + Gln + 2ATP氨甲酰磷酸 + 2ADP + Pi + Glu（合成酶） 氨甲酰磷酸 +Asp P

25、i + 氨甲酰天冬氨酸 (ATCase),67,Flash,68,2 同工酶(isoenzyme): 催化相同化学反应， 但其酶蛋白本身的分子结构、理化性质不完全相同的一组酶。 LDH(乳酸脱氢酶, 四聚体) 乳酸 + NAD+ 丙酮酸+NADH+ H+ H4、H3M、 H2M2、 HM3、M4 (H、M为其两种亚基),69,70, 分类(自学) 原级同工酶: 酶蛋白或不同亚基由不同基因编码. 多基因座同工酶: 由不同基因座的基因编码。 复等位同工酶: 由不同等位基因编码。若为纯合子材料的，则可能只有一种亚基，但也可形成多聚体。 次级同工酶: 酶蛋白在合成后经不同修饰反应而产生不同分子形式。,

26、71,3 酶原的激活 酶原(zymogen) : 有些酶在细胞内合成或初分泌时没有催化活性, 这种无活性状态的酶前身物. 酶原激活: 无活性的酶原在一定条件下能转变成有活性的酶。 酶原分子内肽链的一处或多处被切去部分肽段后使分子构象发生一定程度的改变, 从而形成酶的活性中心.,72,73,4 酶的化学修饰与活性调节 通过共价键形式连接一个基团或去掉此基团使酶活性改变。 能对外界刺激做出更迅速的反应，对外界信号具有级联放大作用，保证了细胞对外界信号的持续反应。 如：磷酸化/去磷酸化，核苷酰化/去核苷酰化,74,5 酶分子的聚合和解聚 酶与一些小分子调节因子结合从而引起酶的聚合和解聚，使酶在活性和

27、无活性形式间相互转化。 乙酰CoA羧化酶：柠檬酸、异柠檬酸促进其聚体体，成为活性形式。 4个不同亚基 原体 多聚体(有活性),75,6 固定化酶(自学) 水不溶酶固相酶： 是指水溶性酶经物理或化学方法处理后，成为不溶水的但具有酶活性的一种酶的衍生物，在催化反应中它以固相状态作用于底物（酶工程内容）。,76,第三节 酶的作用机理,一、中间产物学说,二、酶作用的专一性机理,1锁钥学说,2诱导契合学说,三、与酶高效性有关的机理,1“邻近”、“定向”效应,5酶活性中心为低介电区域,4酸碱催化,3共价催化,2张力学说,77,一 酶催化的中间产物学说 Brown（1902）和 Henri（1903） 一个

28、化学反应能够进行，首先参加反应的分子要相互碰撞，但是仅有碰撞还不一定能导致化学反应的进行 活化分子: 所含能量达到或超过一定限度的能参与化学反应的分子。在一个化学反应体系中，活化分子越多，反应就越快。 3. 活化分子所含有的能参加化学反应的最低限度能量称为化学反应的能阈或能障。,78,4 活化能: 底物分子转化成活化分子所需要的能量, 即活化分子比一般常态分子所多含的能量。 增加活化分子数的途径:, 加热或光照, 直接使分子获能而成活化分子。 降低能阈, 间接增加活化分子数。,5 酶催化作用的实质: 降低反应的活化能, 使化学反应在较低能量水平上进行, 从而加速化学反应. E(酶)+SES(中

29、间产物) EPE + P(产物),79,酶的活性中心与底物分子间形成多个次级键,如氢键、离子键、疏水键， 这样就形成ES复合物. 由于E和S结合， 致使S分子内某些敏感键发生极化而被削弱，产生不稳定的过渡态, 进而导致旧键断裂新键形成, 形成EP复合物，最后释放出P和E。 在酶促反应的两步中，每步需要的活化能(b和c)都较小，比非酶反应需要的活化能(a)大大降低，故反应能加速进行。,80,81,82,83,84,过氧化物酶(peroxidase) H2O2 + AH2 2 H2O + A(AH2:供氢体） 酶： 吸收光谱645、586、548、498, 红褐色 加入H2O2 : 561、 53

30、0.5, 呈红色 加入AH2: 吸收光谱645、586、548、498, 红褐色 这表明形成了 酶 H2O2中间复合物.,Case 2,85,二 酶作用专一性的机理 1 锁钥学说(E Fisher， lock-key theory): 底物分子或底物分子的一部分象钥匙样,专一地楔入到酶的活性中心部位, 就是说底物分子进行化学反应的部位与酶分子上有催化效能的必需基团间具有紧密互补的关系.,86, 局限: 底物与酶结合时酶分子的某些基团常发生明显变化. 酶的构象时时发生变化. 酶常常能催化可逆反应, 它很难酶与底物和产物结构都非常吻合。,87,2 诱导契合学说(1960s,Koshland, in

31、duced-fit theory): 酶的活性部位在结构上具有可塑性和弹性. 当S与E的这一部位结合时可使E的构象发生变化，其构象发生有利于底物结合的变化，使有关基团正确排列和定向，使之与底物结合而催化反应进行。 X-衍射分析的实验证明了酶与底物结合时，确有显著的构象变化。 反应过程中酶活性中心构象的变化是可逆的。,88,induced model,89,The induced conformational change in hexokinase,a single polypeptide chain, two major domains,返回概述,90,三 与酶高效性有关的因素,根本原因是酶

32、使反应活化能大大降低.,1 底物与酶的“邻近”及“定向”效应 “邻近”效应: 底物进入酶的活性中心, 提高该区域中底物的浓度(可高出一万倍) 。反应速度与底物浓度有一定的正比关系。 底物聚集使底物分子间反应基团互相接近,从而降低了进入过渡态所需的活化能。,91,“邻近”效应,邻近效应与定向作用,92, “定向”效应: 专一性底物向酶蛋白活性中心靠近时： 诱导酶蛋白的构象发生改变,使反应所需的基团正确排列定位; 同时也促进底物分子中参加反应的基团在活性中心对着特定的基团几何地定向，形成一种诱导契合的结构，进入过渡态。,93,2 张力学说: 酶与底物结合后，使底物分子中的敏感键因牵拉而发生“变形”

33、(或张力)，从而使底物更易于破裂。, 底物的诱导使酶构象发生改变，产生一种“牵 引力”而使底物敏感键变形而断裂。, 酶与底物结合后，酶中某些基团可使底物的 敏感键的某些基团的电子云密度增加或降 低， 产生一种电子张力，使底物发生变形。,电子张力,94,3 共价催化: 通过共价键底物与酶形成一个不稳定的E-S复合物, 它很快转化为活性自由能大为降低的过渡态中间物, 从而大大提高反应效率。, 亲电催化: 酶或辅酶因子中的亲电基团(如NH3+、Fe3+、Mg2+、Mn2+ )攻击底物分子中富含电子、带部分负电荷的原子，形成过渡态。,95,共价催化,酸碱催化,96, 亲核催化: 由酶分子中具有一个非共

34、用电子对的亲核基团攻击底物分子中缺少电子且具有部分正电荷的原子，单方面提供电子，与该原子形成共价键，从而产生不稳定的过渡中间物，大大提高底物反应速度。 酶分子中至少存在三类能作亲核试剂的基团：咪唑基(His)、巯基(Cys)、羟基(Ser、Thr)。,97,4 酸碱催化 狭义的酸碱催化剂, 即H+及OH-根离子，由于酶反应的最适pH一般在中性，所以H+及OH-不太多，在酶反应中的重要性比较有限。 广义的酸碱催化剂: 质子供体为酸，质子受体为碱。 质子供体:-COOH、-NH3+、His的咪唑基、-SH、-OH。 质子受体：-COO-、-NH2, 咪唑基,98, 咪唑基: 是强的亲电基团, 是有

35、效的酸碱功能基团，pH约为6.7-7.1，在生理pH时一半为广义酸，一半为广义碱，能有效在进行酸碱催化。 供出和接受质子的速度很快，因此很多酶的活性中心都有His残基。,99, 影响酸碱催化反应速度有两个因素： 酸碱强度： 咪唑基的解离常数约为6.0。在生理pH的条件下，一半以酸形式存在另一半以碱形式存在。 咪唑基是质子供体、质子受体在酶反应中发挥催化作用，是最有效最活泼的一个催化功能基团。 功能基团供出质子或接受质子的速度： 咪唑基供出或接受质子的速度特别快. 虽然组氨酸在大多数蛋白质中含量很少，但一般的活性中心都有咪唑基。推测很可能在生物进化过程中，它不是作为一般的结构蛋白成分，而是被选择

36、作为酶分子中的催化结构而存在下来的。,100,101,5 酶的活性中心为低介电区域（非极性区） 酶的催化基团被低介电环境所包围。构成疏水的微环境，可排除极性的水分子。底物分子的敏感键和酶的催化基团间作用能被加强，有助于加速酶反应。 极性的水对电荷往往有屏蔽作用。, 介电常数: 已烷1.9，乙醇80，水80，HCN116,102,不同的酶，起主要影响因素可能是不同的, 各自都有其特点。可以分别受一种或几种因素的影响。,Generalization,103,第四节 影响酶促反应的因素,一、底物浓度对酶促反应的影响,1反应速度与底物间的关系,2米氏公式,3米氏常数的意义,4米氏常数的测定（自学）,二

37、、酶浓度对酶促反应速度的影响,三、pH对酶促反应速度的影响,四、温度对酶促反应速度的影响,五、激活剂对酶促反应速度的影响,六、抑制剂对酶促反应速度的影响,104, 如果继续加大底物浓度，曲线表现为零级反应, 趋向一个极限。说明酶被底物所饱和, 所有的酶都有此饱和现象。,一 底物浓度对酶促反应速度的影响 1 反应速度与底物浓度间的关系 在E、PH、温度等条件恒定时, 在反应最 初一段时间内反应速度保持恒定，表现为 一级反应。, 随着浓度的增加, 反应速度不再按正比升高。在这一阶段，反应表现为混合级反应。,105,106,107,2 米氏公式： 酶促反应中底物浓度和反应速度关系 1913 Mich

38、aelis and Menten 提出米氏公式，1925年Briggs和Haldane修正。,108,K1、 K2、 K3分别代表各反应的速率常数。 生成ES的V1= K1ES, ES分解速度V2=K2ES + K3ES 当反应达到平衡时, V1=V2, 此时 K1 ES = K2 ES + K3 ES,109, E、ES很难测定。 总E： Et = E + ES E=Et ES,110, 因为酶促反应速度V由有效的酶浓度, 即ES络合物的浓度决定, 故 V = K3 ES,111, 若反应体系中的S极大, 使酶完全饱合时, 所有E均以ES形式存在, 即Et=ES, 此时达到最大反应速度Vma

39、x, Vmax = K3 Et. 米氏方程(Michaelis-Menten)为:,112, 在底物浓度较低时， KmS， 此时反应速度与S成正比，符合一级反应。 当SKm时，V = Vmax, 反应速度与底物浓度无关， 符合零级反应。,113,3 米氏常数(Km)的意义: 当V=1/2Vmax，S= Km。 Km：当酶反应速度达到最大反应速度的一半时的底物浓度. 单位与底物浓度单位相同：mol L-1。 Km是酶的特征常数之一。 只与酶的性质有关，而与酶浓度无关。不同的酶，Km值不同。如脲酶为:25m mol/L, 苹果酸酶为0.05m mol/L。,114,115,如果一种酶有几种底物，就

40、有几种Km值，Km值最小的底物称该酶的最适底物。Km值还受pH及温度影响。因此Km值作为常数是在一定条件下而言的。 当K2K3时，1/Km可以近似地表示酶对底物亲和力的大小。 1/Km愈大，Km愈小，达到最大反应速度一半时所需浓度就愈小，亲和力就越大(酶和底物)。 Km值随不同底物而异的现象可以帮助判断酶的专一性，并有助于研究酶的活性中心。,116,4 米氏常数的测定(自学): 1/V = 1/Vmax + Km/ (Vmax S) (y= b + ax) 双倒数作图法: 实验时选择不同的S, 测定其相应的V, 求出两者倒数, 以1/V对1/S作图绘出直线, 斜率= Km/Vmax。,117,

41、Lineweaver -Burk plot,118,Eadle-Hofstee plot,119,二 酶浓度对酶反应速度的影响 1 如果S足够大, 足以使酶饱合, 则V与E成正比. 2 当S维持不变时, V E,120,三 pH对酶活性的影响 1 典型pH - V曲线是钟罩形。 酶表现最大活力时的pH值称为酶的最适pH，pH对不同酶的活性影响不同。 2 各种酶在一定条件下都有一定的最适pH。 大多数酶的最适pH在5-8之间，植物和微生物的最适pH多在4.5-6.5左右，动物体内的酶最适pH在6.5-8.0左右。 例外:胃蛋白酶的最适pH为1.5，麦芽中提取的-淀粉酶在pH3.3时仍具有活性。,

42、121,122,3 酶最适pH不是常数, 受酶的纯度, 底物种类和浓度, 缓冲液种类和浓度等的影响. 4 pH影响酶活力的机理: pH对不同的酶和底物的影响不同，对其酶促反应速度的影响也就不同. 过高过低的pH会改变酶的活性中心的构象，或甚至改变整个酶分子的结构使其变性失活。 影响酶和底物的解离。 影响酶分子的构象。,123,四 温度对酶促反应的影响 1 酶是一种蛋白质，易受高温变性。因此酶促反应速度与温度高低很有关系。 2 当温度比较低时，增加酶促反应的温度，反应会逐渐加快。在一定条件下，酶在某一温度下表示出最大活力，反应速度最快，这个温度称为该酶的最适温度。 如果再增加反应的温度，则反应速

43、度随着温度的增加而变小。,124,最适温度,125,3 在最适温度之前, 温度每升高10，反应速度增加的倍数: 反应的温度系数(Q10)。 大多数酶的Q10=1-2，一般化学反应为2-3。 4 不同的酶对温度的敏感程度不一样，大部分酶在60以上变性。 但也有少数淀粉酶能耐受较高温度，如细菌淀粉酶在93下活力最高，从麦芽里提出的淀粉酶(-淀粉酶)在70条件仍然具有活性。 5 最适温度不是酶的特征物理常数，也不是固定值，而与酶作用时间的长短有关。酶在较短时间内可忍受高温, 作用时间愈长最适温度愈低。,126,五 激活剂对酶反应速度的影响 1 Activator的作用 Activator: 能提高酶

44、活性的物质。 作用: 使已有活性的酶的活性进一步提高(主要是一些离子或简单有机物) 。 激活酶原(主要为离子或蛋白质分子)。,127,2 无机离子的激活作用与类型: 类型 作为酶的组成成分, 参与了催化反应中的电 子传递, 如抗坏血酸氧化酶中的Cu2+。 某些金属离子作为某些酶的辅助因子,如NR 中Mo6+ 。 与酶蛋白侧链基团结合, 稳定其活性构象. 有些金属离子通过生成螯合物，在酶与底物 结合中起桥梁作用，如羧肽酶中的Zn2+、精氨 酸酶的Mn2+。,128, 无机离子可分为三类: 金属离子: 如 K+、Na+、Mg2+、Zn2+ 阴离子: -淀粉酶受Cl-激活 H+,129,3 简单有机

45、分子的激活作用 某些还原剂, 如还原型谷胱甘肽(GSH)和半胱氨酸(Cys)将一些酶的活性中心的-S-S-还原成活性-SH, 进而提高酶活性。 EDTA(乙二胺四乙酸)作为金属离子螯合剂，能除去酶中的重金属杂质，解除抑制。 胰蛋白酶原:被小肠粘膜所分泌的肠激酶作用, 水解下一个六肽后就被激活成具有催化活力的胰蛋白酶。,130,六 抑制剂对酶反应速度的影响 1 Inhibitor (I): 使酶必需基团或酶活性部位中基团的化学性质改变从而降低酶的活性甚使酶的活性完全丧失，但不引起酶变性的物质。 抑制剂对酶的作用称为抑制作用。,131,2 抑制作用的类型,抑制作用,4 可逆抑制,3 不可逆抑制,5

46、 一些重要的抑制剂(自学),132,3 不可逆抑制作用(irreversible inhibition) （自学）: 抑制剂以共价键的方式与酶的某些必需基团不可逆结合, 不能用透析法除去抑制剂而恢复活力, 只能用化学方法从酶分子上移去而恢复活力. 异丙基氟磷酸能够与胰凝乳蛋白酶或乙酰胆碱酯酶活力中心Ser残基形成稳定的共价键因而抑制酶的活性。,133, 非专一性不可逆抑制: 抑制剂可作用于酶分子上一类或几类基团，或作用于几类不同的酶. 有机磷化物：敌敌畏、1605、对硫磷、沙林(Sarin)等抑制某些蛋白酶及酯酶活力，与酶分子活性部位的Ser 的OH结合，使酶失去活性。, 专一性不可逆抑制:

47、专一地作用于某一种酶的活性部位的必需基团而导致失活。,134,有机汞(对氯汞苯甲酸)、有机砷化合物：作用于-SH，抑制含巯基的酶. 重金属盐：Ag+、Cu2+、Hg2+、Pb2+、Fe3+的重金属盐在高浓度时能使酶蛋白变性失活。 烷化剂(碘乙酸、DNFB等)：可使酶蛋白-NH2、-SH、-S-O-、 咪唑基、COOH等烷化. 青霉素：与糖肽转肽酶活性部位的Ser的OH结合，使酶失活。 氰化物、硫化物和CO：与酶中金属离子形成稳定的络合物。,135,4 可逆抑制作用(reversible inhibition): 抑制剂以非共价键的方式与酶蛋白(活性中心或非活性中心)可逆结合, 能用透析、凝胶过

48、滤等方法除去抑制剂。, 竞争性抑制(自学), 非竞争性抑制(自学), 反竞争性抑制(自学),136, 竞争性抑制(competitive inhibition): 抑制剂的化学结构与底物相似，因而竞争性同酶活性中心结合, E+SES P, E+I EI. 抑制强弱取决于抑制剂与底物的浓度比例, 增加底物浓度消可除抑制作用.,可逆抑制作用,137,138,139,加竞争性抑制剂,140,竞争性抑制,141, 如: 琥珀酸脱氢酶能催化琥珀酸脱氢生成反丁烯二酸,与底物琥珀酸结构相近似的丙二酸、草酰乙酸或戊二酸均可作为琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂。 竞争性抑制： Km变大, Vmax 不变,可逆抑制作用,142, 非竞争性抑制： 酶能同时与底物和抑制剂, 即酶结合抑制剂后并不防碍酶与底物的结合. E+S+IESI P I同E和E