4-蛋白质-1.ppt

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1、第三章 蛋白质(protein) (123页 第3，4，5，6，7章),第一节 氨基酸 第二节 蛋白质概述 第三节 蛋白质的共价结构 第四节 蛋白质的三维结构 第五节 蛋白质结构与功能的关系 第六节 蛋白质的性质、分离与纯化,1,2,蛋白质的概念,存在于所有的生物细胞中，是由20种氨基酸按一定的序列通过酰胺键（蛋白质化学中称为肽键）缩合而成的，具有较稳定的构象，是构成生物体最基本的结构物质和功能物质。有些蛋白质尚含有非蛋白成分。,3,第一节 氨基酸（amino acid）123页,一、氨基酸蛋白质的构件分子 二、氨基酸的分类 三、氨基酸的酸碱化学 四、氨基酸的化学反应 五、氨基酸的光学活性和光

2、谱性质 六、氨基酸混合物的分析分离,4,一、氨基酸蛋白质的构件分子,蛋白质水解 氨基酸的一般结构,5,1.蛋白质的水解,完全水解,常见蛋白质氨基酸（基本氨基酸20种） 不常见的蛋白质氨基酸几种,6,2.氨基酸的一般结构（20种基本氨基酸）,结构通式 结构特点 其它特性,7,(1)结构通式,8,构型,氨基酸的构型指碳的构型（D与L型）。 组成蛋白质的氨基酸是 L-型,9,除脯氨酸为-亚氨基酸外，均为 L-氨基酸。 除甘氨酸外, -碳原子为不对称碳原子.都具有旋光性。,(2) 结构特点,10,其它特性 124页,在中性pH时兼性离子 都有特殊的白色结晶形状，可用来鉴别氨基酸。溶点很高。 除胱氨酸和

3、酪氨酸外，一般都能溶于水。,11,二、氨基酸的分类（体内氨基酸）,常见的蛋白质氨基酸 (20种) 不常见的蛋白质氨基酸(少数几种） 非蛋白质氨基酸(150多种),12,1.常见的蛋白质氨基酸（20种，124页 表31）,13,按R基团的化学结构,脂肪族氨基酸：15种 芳香族氨基酸：3种，苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸 杂环氨基酸：2种，组氨酸、脯氨酸,14,根据侧链R基团的极性 ( 127页 表32),带正电荷的极性R 基氨基酸：3种 带负电荷的极性R 基氨基酸：2种 不带电荷的极性 R 基氨基酸： 7种 非极性 R 基氨基酸：8种,非极性氨基酸在维持蛋白质 的三维结构中起着重要作用。？,分子极性

4、？,15,按分子中氨基和羧基的数目,酸性氨基酸：2种 碱性氨基酸：3种 中性氨基酸：其余,16,根据人体能否自身合成,必需氨基酸：8种 赖氨酸(Lys)、 缬氨酸(Val)、 蛋氨酸(Met)、色氨酸(Try)、 亮氨酸(Leu)、 异亮氨酸(Ile)、 苏氨酸(Thr)、苯丙氨酸(Phe) 半必需氨基酸：2种，Arg、His婴儿期供给不足 非必需氨基酸：其余,要求记住！ 氨基酸的结构、单字符、三字符号 第125-127页,17,-C-C-CONH2,-C-CONH2,-C-COOH,-C-C-COOH,-H,-CH3,-C-OH,-C-SH,-C-C-S-C,-C-C-C-C-NH3+,Ce

5、ntral line,Aliphatic,Amide,Acidic,Imino, Circular,Basic,Sulfur,Hydroxy,Aromatic,18,2.不常见的蛋白质氨基酸 128页,是在蛋白质合成后由常见的氨基酸经修饰而来的.,19,3.非蛋白质氨基酸 129页,大多是L-氨基酸衍生物 细菌中含有多种D-型氨基酸 有一些是重要的代谢物前体或代谢中间物 （丙氨酸，鸟氨酸，瓜氨酸等）.,20,三、氨基酸的酸碱化学 129页,氨基酸的兼性离子形式 氨基酸的解离 氨基酸的等电点 氨基酸的甲醛滴定,21,1.氨基酸的兼性离子形式,两个事实 溶点高；离子晶格 能使水的介电常数增高；,2

6、2,2.氨基酸的解离,酸碱质子理论（丹麦化学家布朗斯特和英国化学家劳里于1923年提出 HA B A- + B H 氨基酸是一类两性电解质，完全质子化时多元酸,23,甘氨酸的解离(分步解离),24,解离常数 131133页 表33,解离常数pKa：表示解离基团有一半解离时的pH。 A A0 H A H 解离常数按酸性递减顺序编号为：pKa1， pKa2、 pKa3等。 氨基酸的解离常数用测定滴定曲线方法求,25,26,氨基酸的解离常数用测定滴定曲线方法求,甘氨酸的滴定曲线,27,谷氨酸的滴定（解离）曲线,28,组氨酸的滴定（解离）曲线,29,赖氨酸的滴定（解离）曲线,30,Handerson-

7、Hasselbalch公式,pH = pKa + lg（A-/ HA）= pKa + lg（碱/酸）,可计算出在任一pH条件下一种氨基酸的各种离子的比例 氨基酸的带电状况与溶液的pH值有关。,31,例：计算在pH5.0时，甘氨酸的阳离子、两性离子所占的比例？,32,生理条件下有明显的冲缓作用的氨基酸 132页,缓冲剂：能阻止由于酸或碱的加入而引起的H的变化。 组氨酸侧链咪唑基的pK为6.0,33,3.氨基酸的等电点（isoelectric point,pI,133页）,等电点： 当溶液pH低于该氨基酸等电点时，氨基酸净电荷为正，反之为负。 氨基酸在等电点时溶解度最低不同氨基酸等电点不同,34,

8、应用 根据氨基酸的电荷不同（电泳法,离子交换层析）分离混合物。 根据氨基酸的等电点不同（调节溶液pH ）分离混合物。 电泳 在外电场的作用下，带电颗粒，如不处于等电点状态的分子，将向着与电性相反的电极移动，这种现象称为。,35,等电点的计算 133页 表33,1.侧链不解离的中性氨基酸 pI = ( pK1 + pK2 )/2 2.侧链含有可解离基团的氨基酸 酸性氨基酸 pI = ( pK1 + pKR2 )/2 硷性氨基酸 pI = ( pK2 + pKR3 )/2 半胱氨酸 pI = ( pK1 + pKR2 )/2 酪氨酸 pI = ( pK1 + pKR2 )/2,36,4. 氨基酸的

9、甲醛滴定,氨基酸不能直接用酸、碱滴定来进行定量测定 -氨基中的氮原子是亲核中心，可发生亲核加成和取代反应。 与甲醛发生羟甲基化反应,37,四、氨基酸的化学反应 135页,-氨基参加的反应 -羧基参加的反应 -氨基和-羧基共同参加的反应 侧链R基参加的反应,38,1.- 氨基参加的反应,与亚硝酸反应 与酰化试剂反应 烃基化反应 生成西佛碱的反应（Schiff） 脱氨基反应与转氨基反应(见下册),39,（1）与亚硝酸反应,是范斯莱克氨基氮测定法(van Slyke amino nitrogen method)的原理,40,（2）与酰化试剂反应,用于多肽链N末端aa的标记和微量aa的定量测定。 在多

10、肽和蛋白质的人工合成中被用作氨基的保护剂。,弱碱性溶液,丹磺酰氯,41,（3）烃基化反应,首先被Sanger用来鉴定多肽或蛋白质的N末端氨基酸。,DNP-氨基酸 黄色,2,4二硝基氟苯,弱碱性溶液,DNFB或FDNB，亦称Sanger试剂,2,4二硝基氟苯DNFB或FDNB 亦称Sanger试剂,42,43,Frederick Sanger (桑格),英国化学家，在生物化学领域的贡献很大，他两次获诺贝尔奖1958和1980年；1953年确定了牛胰岛素一级结构；1975年和1977年确定了DNA的两种用酶测序的方法加减法和终止法。,44,首先被Edman用于鉴定多肽或蛋白质的N端氨基酸。 苯异硫

11、氰酸酯缩写为,与苯异硫氰酸酯 PITC,45,Edman法测定氨基酸序列,46,（4）生成西佛碱的反应,西佛碱是以氨基酸为底物的某些酶促反应的中间物。,47,2.-羧基参加的反应 第138页,成盐和成酯 成酰氯反应 脱羧基反应 叠氮反应,48,3.-氨基和-羧基共同参加的反应,与茚三酮反应 成肽反应,49,（1）与茚三酮反应,茚三酮在弱酸性溶液中与氨基酸共热，所有具有游离氨基的氨基酸都生成紫色化合物（570）。 脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应直接生成的是黄色化合物（440）。,50,（2）成肽反应,51,3.侧链R基参加的反应 140页,蛋白质的化学修饰：就是在较温和的条件下，以可控制的方式使蛋

12、白质与某些试剂起特异反应，以引起蛋白质中个别氨基酸侧链或功能团发生共价化学改变。 酪氨酸的酚基 Millon反应（红色）、Foiln反应（蓝色）、Pauly反应（橘黄） 碘化、硝化 精氨酸的胍基： 坂口反应（红色）、与环已二酮生成缩合物。 苯丙氨酸和酪氨酸的苯环： 黄色反应（黄色） 组氨酸的咪唑基： Pauly反应（棕红色） 苏氨酸和丝氨酸的羟基：成酯反应 Cys侧链上的巯基（SH）,52,Cys侧链上的巯基（SH）,CH2S此阴离子是巯基的反应形式。,53,与卤化烷生成稳定的烷基衍生物,可保护 -SH 以防被氧化。,54,Cys巯基打开氮丙啶的环,为胰蛋白酶水解肽链提供了新的位点。,AECy

13、s,55,巯基能和各种金属离子形成络合物,-SH 酶遇到重金属离子而生成硫醇盐时，将导致酶失活。,对羟基汞苯甲酸,56,与二硫硝基苯甲酸（DTNB）反应,pH8.0时，在412nm波长处有强烈吸收。可用比色法定量测定半胱氨酸的含量。,硫硝基苯甲酸,57,巯基易受空气或其他氧化剂氧化 两种氧化衍生物,形成二硫化物：胱氨酸的形成。,胱氨酸,二硫键,58,形成磺酸基：对游离的巯基具有保护作用，保护Cys巯基之间的氧化。,59,二硫键的还原（打开）,SH 与 SS 是一对氧化还原体系。 常用的打开二硫键的试剂主要有 氧化剂：过甲酸（HCOOOH） 还原剂：巯基乙醇、巯基乙酸、二硫苏糖醇等。,HSCH2

14、CH2OH,60,氧化剂：过甲酸（HCOOOH）,磺酸基,61,还原剂：巯基乙醇,游离的巯基极易被氧化，需与卤化烷试剂作用将其保护。,62,63,五、氨基酸的光学活性和光谱性质 143页,氨基酸的旋光性 氨基酸的光谱性质,64,消旋作用（外消旋物与内消旋物）,65,氨基酸的光谱性质 145页,可见光区都没有光吸收 红外区和远红外区都有吸收（200nm) 近紫外区（200nm400nm) 色氨酸280nm 酪氨酸275nm 苯丙氨酸257nm,66,六、氨基酸混合物的分析分离,分配层析法的一般原理 纸层析 柱层析 离子交换层析 气液层析 薄层层析 高效(压)液相层析HPLC,67,1.分配层析法

15、的一般原理,固定相 流动相,层析系统,固相 液相 半液相,液相 气相,68,分配定律及分配系数,混合物在层析系统中的分离决定于该混合物的组分在这两相分配系数。,69,逆流分溶原理 149页,混合物中 Y（Kd1） Z （Kd3） 计算公式 150页,70,一定量的某一溶质在一定量的溶剂系统中分配时，转移次数越多，即分溶管数越多，其分溶曲线越集中，即峰形越窄而高，这样有利于混合物中各物质的完全分离。,71,2.纸层析,支持物:纸,纸上的羟基具有亲水性，因此能吸附一层水作为固定相，而通常有机溶剂作为流动相 。 溶剂：酸溶剂系统和碱溶剂统。 原理：是根据混合物中溶质物质的极性造成的分配系数不同进行分

16、离的。,72,相对迁移率 Rf = X/Y,73,1. 点样,纸层析操作,2.展层,3.显色,4.分析,74,离子交换柱层析 152页,填充物：离子交换树脂基质（带电基团） 洗脱剂：一定pH 阳离子交换树脂与阴离子交换树脂,75,氨基酸与树脂的亲和力,取决于它们之间的静电吸引 和氨基酸侧链与树脂基质之间的疏水相互作用。,层析下来的先后顺序为： F- A L,76,77,图示,78,收集,氨基酸分析仪图解 153页,79,氨基酸的制备和应用状况,1.氨基酸的制备 从蛋白质水解液中分离提取 应用发酵法生产 应用酶的催化反应生成氨基酸 有机合成法 2.氨基酸的用途 蛋白质的基本组成 对生物体具有其他

17、特殊的生理作用， 参与许多代谢作用，不少已用来治疗疾病 用于食品强化剂、调味剂、着色剂、甜味剂和增味剂 用于饲料添加剂 调节皮肤pH值和保护皮肤的功能,80,第二节 蛋白质概述 157页,蛋白质的化学组成与分类 蛋白质的构象和结构 蛋白质生物学功能,81,一、蛋白质化学组成与分类,化学组成特点 蛋白质的分类,82,1.元素组成特点,蛋白质的含氮量接近于16% 蛋白质系数：1克氮所代表的蛋白质质量(克数，6.25) 蛋白质系数是凯氏定氮法测定蛋白质含量的基础 粗蛋白含量 样品含氮量 6.25 蛋白质含量 = 样品蛋白氮 6.25 有些还含有e/Cu/Zn/Mn等.,83,三聚氰胺,是一种重要的氮

18、杂环有机化工原料，主要用于生产三聚氰胺-甲醛树脂，广泛用于木材加工、塑料、涂料、造纸、纺织、皮革、电气、医药等行业，目前是重要的尿素后加工产品。此外三聚氰胺还可以作阻燃剂、减水剂、甲醛清洁剂等。 动物长期摄入三聚氰胺会造成生殖、泌尿系统的损害，膀胱、肾部结石，并可进一步诱发膀胱癌。,84,2.蛋白质的分类,分类依据 来源、理化性质、分子形状、化学组成、结构与功能等。 常用的分类方法 根据组成 按分子形状,85,(1)根据组成不同 （158 页，表41, 42）,单纯蛋白质 结合蛋白质（亦称缀合蛋白质） 非蛋白部分称为辅基(配体），辅基与多肽共价或非共价结合,86,(2)蛋白质的形状和大小,纤维

19、状蛋白质：轴比大于10，多不溶于水和稀盐溶液。 球状蛋白质：轴比小于10，易溶于水 膜蛋白质：不溶于水，但能溶于去污剂溶液。,87,蛋白质的相对分子质量 159页，表44,残基数目/链：单一链、两种链、三种链等。 单体蛋白质（monomeric protein） 寡聚（多聚）蛋白质（亚基之间非共价键结合） 简单蛋白质的相对分子质量110氨基酸残基数,153个,88,(3)根据营养价值分类,缺价蛋白质（不完全蛋白质） 蛋白质中缺乏某个或某些必需氨基酸。 完全蛋白质 8种必需氨基酸都有的蛋白质。 蛋白质互补作用：,89,二、蛋白质的生物学功能 160页,1.是生物体内重要的组成成分和结构成分 2.功能的多样性和复杂性 催化功能：酶 调节功能：激素、受体、毒蛋白等。 结构功能：细胞和组织的主要组成成分。 运输功能：血红蛋白、铁蛋白、载脂蛋白。 免疫功能：抗体 运动功能：肌动蛋白、肌球蛋白、纤毛、鞭毛。 储藏功能：乳液中的酪蛋白、蛋类中的卵清蛋白、植物种子中的醇溶蛋白等。 生物膜的功能：通透性、信号传递、遗传控制、生理识别、动物记忆、思维等。,90,三、蛋白质构象和蛋白质结构层次 图41,构象（conformation）分子在空间采取的特定形态。 （以X射线衍射法研究为主）,91,蛋白质结构的不同组织层次,结构组织层次：一、二、三、四级结构。 介于二和三级结构之间：超二级结构和结构域,