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1、肠道病毒感染病例标本的处理、细胞接种和观察,湖南CDC脊灰实验室 张帆 2008.5.8,人肠道病毒简介和分类,小核糖核酸病毒科（Picornaviridae）的成员，主要 在肠道内复制, 但可感染各个系统和器官。 单正链的无包膜RNA病毒，RNA有感染性。 小球形病毒（ 30 nm）， 20面体对称结构。 衣壳有VP1-VP4四种蛋白，VP1-VP3分布在表面， VP4与内部RNA结合。 与鼻病毒不同的是，它们在酸性环境中稳定。 在胞浆增殖，有明显CPE，破胞释放。 引起多种疾病：麻痹性疾病、无菌性脑膜炎、心肌 损伤、手足口病，结膜炎，皮疹等。,电镜下的病毒形态,病毒特性,肠道病毒适合在湿、
2、热的环境下生存与传播，对乙醚、去氯胆酸盐等不敏感，75%酒精和5%来苏亦不能将其灭活，但对紫外线及干燥敏感。各种氧化剂(高锰酸钾、漂白粉等)、甲醛、碘酒都能灭活病毒。病毒在50 可被迅速灭活，但1mol浓度二价阳离子环境可提高病毒对热灭活的抵抗力，病毒在4 可存活1年，在- 20 可长期保存，在外环境中病毒可长期存活。,人肠道病毒传播方式, 粪-口途径传播: 唾液与粪便 呼吸道传播: 空气飞沫 接触传播:一般人肠道病毒在呼吸道飞沫中可存留约一至三周，而经胃肠道的粪便排泄可达到二至三个月以上。,病毒的组织培养,所有已知的人肠道病毒都可以在组织细胞培养或乳鼠中繁殖； 大部分血清型可以在1种以上的人
3、源传代细胞中生长； 但是没有哪一种细胞可以支持所有的人肠道病毒生长； 研究至今，一些血清型（如Cox A1病毒）只能在乳鼠中繁殖。,实验室检测方法,临床怀疑：夏秋季，婴幼儿、皮疹、接触、脑膜炎 实验室的检测方法包括： 1)血清抗体的变化： 血清抗体4倍变化 2)病毒培养及鉴定：理想（金标准）但费时费力， 且部分肠病毒型别不易培养 3)组织病理切片检查 4)分子生物学检测，RT-PCR，RealTime PCR，分子杂交等 5)快速抗原检测：芯片,病毒分离,诊断肠道病毒感染的最主要手段，也是金标准。 柯萨奇B组病毒和埃可病毒可以很容易地在细胞培养上生长。适合的标本有咽拭子、粪便标本，鼻拭子等，也
4、可以从脑脊液中分离到病毒。 一些柯萨奇A组病毒不容易通过细胞培养进行分离，可以通过乳鼠进行分离，但是操作比较复杂，一般实验室不常规使用这种方法。分子生物学的方法更适合这种病毒的诊断。 血清学方法 自从细胞培养已经可以用做病毒分离后，血清学方法已经不经常使用了。 中和实验，但是非常繁琐，因此，一般也不做这方面的实验。,细胞培养分离方法,1990年以前，大都都采用Vero、GMK细胞分离； 1994年以后，人结肠癌上皮细胞（Caco-2）取代了Vero细胞； 1998年人们开始用人肺系细胞（MRC-5）分离CoxA16等毒株，其敏感性与Caco-2细胞相当。 目前，大都使用人源细胞如人喉癌上皮细胞
5、（HEp-2）、人横纹肌肉瘤细胞（RD）用于病毒分离。RD细胞支持大多数柯萨奇A组病毒复制。 对一些不能在细胞上生长的病毒，可用乳鼠接种分离病毒。但埃可病毒一般不引起乳鼠发病。,标本的采集,（一）粪便标本：采集病人发病7日内的粪便标本，用于病原检测。粪便标本采集量58g/份，采集后立即放入无菌采便管内，4暂存立即(12h内)送达实验室，20以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于70冰箱。 （二）咽拭子标本：采集病人发病3日内的咽拭子标本，用于病原检测。用专用采样棉签，适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，应避免触及舌部；迅速将棉签放入装有35ml保存液（维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的采样管
6、中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，以防干燥。4暂存立即（12h内）送达实验室，20以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于70冰箱。 （三）血清标本：采集急性期（发病03d）和恢复期（发病1430d）双份配对血清用于抗体检测。静脉采集35ml全血，置于真空无菌采血管中，自凝后，分离血清，将血清置于20以下冰箱中冷冻保存。,（四）疱疹液：在手足口病的实验室诊断中，从疱疹液中分离到病毒具有很高的诊断价值，可同时采集多个疱疹作为一份标本。先用75%的酒精对疱疹周围的皮肤进行消毒，然后用消毒针将疱疹挑破用棉签蘸取疱疹液，迅速将棉签放入内装有35ml保存液（维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的采
7、样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封。所采集标本4暂存立即（12h内）送达实验室，20以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于70冰箱。 （五）脑脊液标本：出现神经系统症状的病例，要采集脑脊液标本，进行病原和抗体检测，从脑脊液中分离病毒也具有很高的诊断价值。采集时间为出现神经系统症状后3天内，采集量为1.02.0ml。采集后立即装入无菌带垫圈的冻存管中，4暂存立即(12h内)送达实验室，20以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于70冰箱。 （六）病例密切接触者的标本采集：选择典型病例所在的托幼机构、或所在村，以新发病例密切接触者为采样对象，采集单份粪便和血清标本。 （七）健康对照的标本
8、采集：选择患儿发病所在社区（村）的临近无病例的社区（村）或托幼机构。采集5岁以下的儿童单份粪便和血清标本。,手足口病,引起手足口病的主要为小RNA病毒科、肠道病毒属的柯萨奇病毒(Coxsackie virus) A组16、4、5、7、9、10 型， B组2、5型；埃可病毒（ECHO viruses）和肠道病毒71型（EV 71），其中以EV 71及Cox Al6型最为常见。 感染后引起 发热, 不适, 咽喉肿痛, 口腔、手、脚侧面及掌心、屁股出现小泡 传染性极高 病程约1周,手足口病发病机理,致病性与柯萨奇病毒类似，呈多样性，主要是无菌性脑炎、类脊髓灰质炎等中枢神经系统疾病 感染后对同型病毒可
9、产生持久免疫 诊断困难，对可疑患者可采粪便、脑脊液等标本做病毒分离和中和试验 尚无疫苗，预防以隔离为主,用于病毒分离和鉴定标本的种类,用于HFMD病毒分离的标本包括粪便、咽拭子和疱疹液，如果患者出现神经系统症状，可以采集脑脊液标本。 用于AHC病毒分离的标本主要是结膜拭子或结膜刮取物。 用于HFMD病毒分离的标本包括粪便、咽拭子和疱疹液，如果患者出现神经系统症状，可以采集脑脊液标本。 用于AHC病毒分离的标本主要是结膜拭子或结膜刮取物。 注意：虽然都是肠道病毒，但不同的病例采样的部位不同，不同的肠道病毒采用的组织培养也是不同的。,标本的处理,1、粪便标本的处理 A）所需试剂和耗材： 15ml或
10、50ml耐氯仿离心管； 1ml 或5ml吸氯仿用的玻璃吸管； 5ml和10ml吸管； 木制便签； 外螺旋盖的冻存管（5ml）； 直径大约23mm的玻璃珠； 混有抗生素的完全PBS；完全PBS液中加入PS溶液，终浓度为青霉素500单位/ml，链霉素为500g/ ml 氯仿（以乙醇作为稳定剂）。,B)粪便标本处理操作步骤：生物安全柜中操作 将离心管上标记标本号; 每一管中加入10ml 完全PBS ，2g玻璃珠，1ml氯仿; 在生物安全柜中将每一份粪便标本取大约2g加入标记好的离心管中（确认原始标本号与离心管上标记的编号一致），剩余原始标本最好留在原容器中并冻存于-20。 拧紧离心管，用机械震荡器剧
11、烈震荡20分钟。 将离心管上标记标本号;用冷冻离心机离心1500g*（约3500转）20分钟。 将每一份标本上清吸入2个有外螺旋盖的标记好的冻存管中（若上清不清澈，应再用氯仿处理一次）。 将一管粪便悬液冻存于-20作为备份，另一管存于4-8以备接种（用于当天接种细胞）。,2、脑脊液标本的处理-通常直接用于病毒分离。 3、疱疹液标本的处理-通常直接用于病毒分离。 4、咽拭子标本的处理 咽拭子要在保存液中充分搅动（40下左右），以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等，然后4条件下10000rpm离心20min，用上清接种到细胞上，如果发现有细菌污染，用滤器过滤除菌。 5、眼结膜拭子标本的处理同咽
12、拭子标本的处理。,病毒分离,标本接种和观察 A）所需试剂和耗材： 细胞培养管培养的RD细胞和HEp-2细胞； 维持液（MM）； 1ml和5ml的一次性塑料移液管,B）操作步骤： 显微镜下观察单层细胞，以确保细胞是健康的。一个健康的单层细胞会在传代后3d左右形成； 倒掉（GM），换上11.2ml（MM）； 每一份标本同时接种2支RD细胞和2支HEp-2细胞，正确标记细胞管（包括标本编号、日期、传代数）； 每一种细胞至少标记一管作为阴性对照； 每支试管接种0.2ml标本悬液，培养温度要求36（对于AHC标本病毒分离，尤其是EV70，强烈建议降低培养温度，一般可为35）； 使用倒置显微镜逐日观察并如
13、实记录细胞培养管的变化，至少一周。包括记录： CPE（1+4+）： （1+，25%; 2+, 25%50%; 3+, 50%75%; 4+, 75%100%）； 细胞毒性反应; 细胞老化或污染. 关于肠道病毒CPE：即有特征性的肠道病毒致细胞病变效应，表现为细胞圆缩、分散、胞浆内颗粒增加， 折光性增强至细胞从管壁脱落。,如果有特征性的肠道病毒CPE出现至观察到75%的细胞发生变化（3+ CPE），冻存于-20以备二次传代。同一病例二次传代的病毒分离物其滴度高于一代病毒，二代分离物可放到一起用于进一步鉴定； 第1代培养见可疑CPE至观察满7天后再继续冻融传代，待CPE稳定出现后-20或-70冻存
14、以备进一步鉴定； 如果7天之后没有CPE出现，需盲传2代继续观察。（注意：同一病例标本的不同细胞的培养物应单独传代）； 盲传2代后仍不出现CPE，则判定为阴性； 注意：盲传不可超过3代。,相关概念,A：毒性反应：如果在接种后12d内细胞快速地凋亡，这可能是由于标本中含有毒性物质而导致的非特异性毒性反应。将这些已接种标本的试管冻存于-20，融化后取0.2ml接种到同一类型细胞中（此时是第二代）。如果又出现了毒性反应，可重取原始标本用PBS稀释10倍，再次接种到同种细胞中。这时应被认为是第一代。 B：微生物污染：由于细菌污染而造成培养液混浊或细胞死亡经常使病毒造成的CPE无法确定或根本无法出现。重
15、新取原始标本，用氯仿处理，按上述步骤重新接种到新鲜细胞上。 C：盲传：有时一周之后传代细胞会老化，甚至细胞对照也出现了病变。可将已接种标本试管于-20冻存，融化后取0.2ml再接种到同一类型健康单层细胞，再观察7天。若盲传2代仍未产生CPE，即可确认此标本为阴性。,HFMD结果解释,1.RD细胞支持CA16和EV71的复制，但一般要经过2次以上传代才出现明显病变，若在使用RD细胞分离的同时再增加HEp-2细胞，可提高肠道病毒(如COXB及ECHO）分离率。 2.从HFMD患儿的脑脊液、血液、疱疹液等分离出病毒有诊断价值，但单从咽拭子或粪便中分离到病毒不能确诊。需满足以下2 个要求。才有诊断的参
16、考价值： 1）从有上述临床症状群患者的咽拭子或粪便中重复分离到同一型病毒; 2）病毒分离率远高于正常人群。 3.相同滴度的CA16和EV71在RD细胞中生长的速度不同，EV71的生长速度要快于CA16，表现为EV71感染RD细胞后出现CPE的时间比CA16早。两者在HEp-2细胞中均不繁殖。,需要注意的两个问题,A额外的传代： 在进行HFMD/AHC标本病毒分离过程中，为防止从病例中分离出的标本中有人肠道病毒漏检情况，此时接种过病毒的细胞悬液经过冻化后，可重新接种到新的健康单层细胞上以释放存在的病毒。在标本培养没有产生CPE的情况下，特别是发生毒性反应或污染时，使用新的健康细胞可能会产生可识别
17、CPE。但病毒传代不要超过3次，因为每一次操作都会增加病毒交叉污染的机会，从而产生假阳性结果。 B标本吸附到单层细胞上 方法：先将细胞生长液倒掉，用无菌PBS清洗单层健康细胞，再接种0.2ml标本悬液使其先吸附到单层细胞上。吸附过程(1h)中轻摇并偶尔旋转使接种液分布均匀，以防止周围层细胞干燥。然后再加入1ml的维持液。 优点：可检测到稍低浓度的病毒/ 减少标本的毒性反应/可使CPE提前出现。 缺点：增加病毒（和可能的细菌）交叉污染的机会，因为此方法增加了开盖/关盖的次数。 注意：当使用含有很高滴度病毒标本时交叉污染的可能性更大，所以此方法不可用于接种病毒分离物。,正常的RD细胞(人胚胎横纹肌肉瘤细胞，形态学为纺锤形及巨型多核细胞）,EV71T和CA16出现的CPE（接种后第7天）,正常的Hep-2细胞（人喉上皮癌细胞，形态学为上皮样细胞）,CA24和EV70出现的CPE（接种后第7天）,