胡优敏《电生理学技术及临床应用》细胞电信号研究方法和膜片钳技术.ppt

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1、电生理学技术及临床应用,胡优敏 博士 副教授 Tel: 63846590-776542 Email: 办公室：四号楼413室,2,内容,细胞电信号研究方法 膜片钳技术及应用,细胞电信号研究方法,细胞电信号研究方法,细胞外记录 (extracellular recording): 细胞内记录 (intracellular single unit recording)： 电压钳（voltage clamp） 膜片钳（patch clamp）,工作原理：把引导电极安放在细胞的表面或附近引导细胞的电活动。活动部位的细胞去极化，未活动部位极化状态，在容积导体中两部位电位不同，电流流动，放置在细胞表面的

2、电极会记录出两者间的电位差。 优点：方便，电极不插入细胞。 特点：细胞外电位的波形 因记录细胞的不同部位而异 神经纤维外记录：,细胞外记录 Extracellular Recording, CNS神经元细胞外记录：在接受其他神经元传来的兴奋性或抑制性的信息被激活后，可在所记录神经元的被激活部位（电穴）和该神经元的其他部位（电源）间形成局部电流。 玻璃微电极: 尖端直：0.5m; 电极电组：520M; 充灌液：3mol/L KCI, 4mol/L NaCI, 2%旁胺天蓝，0.5mol/L醋酸钠溶液pH7.7;）。 钨丝金属微电极：尖端4070m, 电阻低，机械强度高，直接穿透硬脑膜，电噪声低，

3、可反复使用；,细胞外记录 Extracellular Recording,根据细胞外记录微电极处于电源或电穴的位置关系，能记录一个极性不同的电位（正或负）。 胞外电极记录的电位大小和波形会有多种变化。因此，重点分析放电频率和潜伏期，而不去比较放电的幅度。,神经纤维外纪录：,细胞外纪录 Extracellular Recording,The inhibition by MPEP was statistically significant (P 0.05 and P 0.01, two-way ANOVA),Effects of MPEP on the murine afferent discha

4、rge evoked by jejunum distension in vitro,工作原理：在膜两侧各置一个电极形成一个回路，记录膜电位（membrane potential）： EPSP, IPSP，动作电位。 优点: 准确测量膜电位的绝对值， 因膜内到膜外电阻很大, 值可高达100mV。 意义：是研究心肌细胞、神经元等基本生物物理特性的有效手段。 关键问题（成功而持久的胞内记录）： 1）稳定：排除机械和动物呼吸和循环功能引起的运动； 2）合格的玻璃微电极。,细胞内纪录 Intracellular Single Unit Recording,(Hodgkin and Huxley),20世

5、纪50年代，英国生理学家Hodgkin and Huxley 首次应用电压钳技术对枪乌贼的标本进行膜电流的测定（1963 Nobel Prize） 。,1937年，Hodgkin和Huxley在枪乌贼巨大神经轴突细胞内实现细胞内电记录，,1946年，凌宁和Gerard创造拉制出尖端直径小于1m的玻璃微电极，并记录了骨骼肌的电活动。玻璃微电极的应用使的电生理研究进行了革命性的变化。,细胞内纪录 Intracellular Single Unit Recording,由于插入神经元内胞体并记录细胞内电位的微电极技术的发展，Eccles等将微电极插入脊髓运动神经元的胞体，记录哺乳类动物脊髓的大运动神

6、经元胞内电位。 运动神经元的胞体直径70m; 微电极尖端直径0.5 m； 跨膜电位差6080mV。,图7.3：用微电极在猫脊髓运动神经元内记录的突触后电位 A.B.C:三种不同的阈下刺激(40秒扫描的叠加)； D:10次刺激引起的峰电位。,图7.12：刺激神经在单根肌纤维的终板上所诱发的电位 a. 正常终板电位和相继发生的肌肉峰电位；b,c,d,e: 箭毒进行性地阻滞肌反应; e只留下终板电位，神经肌肉传递被箭毒阻滞了。,图7.2：枪乌贼星状神经节的突触前纤维表现的动作电位和在突触后神经元诱发的局部电位。,细胞内纪录 Intracellular Single Unit Recording,分析

7、指标：RP（静息电位）、APA（动作电位幅度）、Vmax（动作电位的上升速度）、APD50（动作电位幅度下降50%时的时程）和APD90（动作电位幅度下降90%时的时程）等,单细胞跨膜电位测量的实验装置：,20世纪50年代，英国生理学家Hodgkin and Huxley 首次应用电压钳技术对枪乌贼的标本进行膜电流的测定（1963 Nobel Prize） 。 工作原理：离子流过通道所形成的离子流是形成动作电位的基础。电生理实验以电流作为刺激源，使可兴奋细胞产生兴奋，然后测定其膜电压以确定离子通道的状态。但在形成动作电位时所产生的离子流可影响膜电位，而膜电位的变化又会影响该离子的通透性的变化。

8、因而，须人为地使膜电位在一定时间内维持在一个固定水平。电压钳技术是通过插入细胞内的一根微电极人为向胞内补充电流，补充的电流正好等于跨膜流出的反相离子电流（大小相等方向相反）。 意义 ：1）确保膜通透性发生改变时，控制膜电位始终维持在指令电位的水平（不变）；2）通过电流检测装置，记录到补充入胞内的注入电流，它相当于离子电流的反相电流。这样可测定在不同膜电位水平的离子电流，从而了解膜通道的电导及功能活动。,电压钳 voltage clamp,应用：定量分析刺激与细胞后膜电导的变化。反映整个细胞膜上所有通道活动的综合结果。 不足：此项技术不能了解单个离子通道的功能活动状态。另外，牵制的面积大，包含大

9、量的随机开放和关闭的通道，形成的背景噪音也大，掩盖单一通道的微弱电流，另外，小神经元插入两个电极不容易。,电压钳装置图和电压钳实验记录的膜电流,Na+电流,K+电流, 1976年由德国Neher 和Sakmann 发明（1991 Nobel Prize）。 工作原理：同电压钳，即在人为设置电压并固定的情况下记录分析离子通道。膜片钳技术使用玻璃微电极吸管把只含1-3个离子通道、面积为几个m2的细胞膜通过负压吸引封接起来。由于电极尖端与细胞膜的高阻封接，在电极尖端下的那片膜与膜的其他部分从电学上隔离。因此，片膜内通道开放所产生的电流流进玻璃吸管，用一个极为敏感的膜片钳放大器测量此电流强度，即代表单

10、一离子通道电流。 性能：电极尖端(15m)与膜之间电阻10 9 （ G, 10G100G）的高封接（giga-seals）, 大大提高了膜片钳的可靠性和灵敏性，可测量0.06pA的电流，1m的空间分辨力和10s时间的分辨力。 意义：膜上电压依赖型离子通道有开与关两种电导状态。通道膜片钳技术可直接观察离子通道“开启”和“关闭”。,膜片钳 Patch Clamp,电压钳技术是通过向细胞内注射一定的电流，抵消离子通道开放时所产生的离子流，从而将细胞膜电位固定在某一数值。由于注射电流的大小与离子流的大小相等、方向相反，因此它可以反映离子流的大小和方向。 膜片钳技术钳制的是“膜片”，是指采用尖端经过处理

11、的微电极与细胞膜发生紧密接触，使尖端下的这片细胞膜在电学上与其它细胞膜分离。采用电压钳技术将这片膜的电位钳制在某一数值，可记录到单通道电流。从这点上看，膜片钳技术是特殊的电压钳技术。,膜片钳技术发展历史,1976年德国马普生物物理化学研究所Neher和Sakmann首次在青蛙肌细胞上用双电极钳制膜电位的同时，记录到ACh激活的单通道离子电流，从而产生了膜片钳技术。 1980年Sigworth等在记录电极内施加的负压吸引，得到10-100G的高阻封接(Giga-seal),大大降低了记录时的噪声，实现了单根电极既钳制膜片电位又记录单通道电流的突破。 1981年Hamill和Neher等对该技术进

12、行了改进，引进了膜片游离技术和全细胞记录技术，从而使该技术更趋完善，具有1pA的电流灵敏度、1um的空间分辨率和10us的时间分辨率。 1983年10月，SingleChannel Recording一书问世，奠定了膜片钳技术的里程碑。Sakmann和Neher也因其杰出的工作和突出贡献，荣获1991年诺贝尔医学和生理学奖。,Neher出生于1944年，德国人 1965年毕业于Wisconsin University 1976年在耶鲁大学医学院取得医学博士学位 此后长期从事基础医学研究,获奖者简介,Sakmann1942年出生于德国的斯图加特市 1963年毕业于Tubingen 大学，一直从事

13、电生理学方面的研究,1976年Neher和Sakmann合作发明了patch clamp技术，发现了细胞膜存在离子通道，而共同获得1991年诺贝尔奖。,1976年利用patch clamp技术,測定单一乙酰胆碱receptor通道表現的記录,在兴奋过程中离子移动数量之多，速度之快，使人们推测在兴奋时膜结构中有特殊的蛋白质通道的存在。但由于当时技术所限，未能阐明。直至1976年Neher和Sakmann首次运用一种被称为膜片钳(patch clamp)的新记录方法，记录膜结构中单一的离子通道的开放和关闭，引起的单通道离子电流和电导，从而揭开了离子通道研究的新篇章。,Neher和Sakmann的贡

14、献,Neher和Sakmann将直径15m的玻璃微电极在火上抛光，然后与经蛋白酶处理清洁的细胞表面紧密接触。电极尖端与膜之间的接触，使尖端内的小片膜与其余部位在电学上绝缘，形成50M封接，保证了电流经微电极进入测量电路。以后，Neher又作了改进，用负压轻吸微电极造成管口与膜脂质双层之间非常紧密的封接（千兆欧封接）。因此在同一钳位电压下，膜单离子通道开放和关闭引起的离子电流、电导以及通道开放的时间机率及通道的动力学特性等皆可被测定。,他们应用这套技术顺利地记录了蛙肌肉细胞上单一离子通道电流。结果显示，蛙肌肉细胞的细胞膜上一个离子通道可通过的电流约为2010-12A，换成离子数目大约是每秒通过一

15、亿个离子。此后，他们又对离子通道的运作，细胞分泌过程及通道的调节功能进行了研究。,膜片钳技术及应用,膜片钳技术（patch clamp recording chnique） 一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜上单一的（或几个的）离子通道分子活动的技术。以后由于吉欧姆阻抗封接（109）方法的确立和几种方法的创建，1980年以来，此技术已可用于很多细胞系的研究。,前 言,膜片钳技术的优势： 在于其具有0.06pA的电流测量灵敏度，1m2的空间分辨率及10S的时间分辨率。使我们通过该技术了解到某个瞬间、特定条件，细胞膜离子通透性和膜通道蛋白构型的变化，从而使其成为目前从功能角度探讨各种生理

16、、病理功能机制的最直接、理想的电生理学研究手段。 该技术的问世，为生理学、药理学、病理生理学和分子生物学的多种学科关于生命活动规律、疾病及转归机制、药物作用机制的研究开辟了广阔的前景。,膜片钳技术是用玻璃微电极吸管把只含1-3个离子通道、面积为几个平方微米的细胞膜通过负压吸引封接起来(见图)，由于电极尖端与细胞膜的高阻封接，在电极尖端笼罩下的那片膜事实上与膜的其他部分从电学上隔离，因此，此片膜内开放所产生的电流流进玻璃吸管，用一个极为敏感的电流监视器(膜片钳放大器)测量此电流强度，就代表单一离子通道电流。,膜片钳技术原理,膜片钳技术：从一小片(约几平方微米) 膜获取电子学方面信息的技术，即保持

17、跨膜电压恒定电压钳位，从而测量通过膜离子电流大小的技术。通过研究离子通道的离子流， 从而了解离子运输、信号传递等信息。,A显示出玻璃微电极接触进入至细胞中。B则是使用高级放大仪，将膜上的离子通道与微量吸管的尖端相触，以放大一部分的细胞膜。其中，微量吸管内连接了电流放大器。D表示电流通过离子通道，离子通道开启。C为通道的高度放大：细胞外覆有受体以及离子滤器。,关键设备：防震台，屏蔽笼，膜片钳放大器，倒置显微镜，信号转换和采样系统，微操纵仪，灌流系统（细胞记录槽和恒速灌流泵）以及计算机系统。 相关仪器：如电极拉制仪及抛光仪等。 标本灌流系统和微操纵仪器均放置于防震台上，防震台外用屏蔽网防止干扰。有

18、的实验中，常采用刺激器，用于控制各仪器的同步以及钳制的时间。,膜片钳技术基本设备,Automatic Patch Clamp Robot,原理：硅硼玻璃制造的芯片对悬浮细胞进行钳制。芯片上有约1m的孔，从芯片内侧用泵施以负压使悬浮细胞被吸引到开孔处而形成封接。,单通道记录（ single channel record）方式，即贴附式（cell-attached或on cell）、内膜向外式（inside-out）、外膜向外式（outside-out）等 全细胞记录（whole cell record）,后又发展了膜穿孔（Perforated patch clamp）等记录方式。,膜片钳实验技术

19、常用的记录方式,膜片钳法的各种模式图,1）细胞贴附式 (cell-attached 或on-cell mode)： 千兆欧姆封接后的状态即为细胞贴附式模式，是在细胞内成分保持不变的情况下研究离子通道的活动，进行单通道电流记录。即使改变细胞外液对电极膜片也没有影响。,图 细胞贴附记录模式中豚鼠心室肌酶解分离细胞钠通道的记录,2） 膜内面向外式 (inside-out mode)： 在细胞贴附式状态下将电极向上提，电极尖端的膜片被撕下与细胞分离，形成细胞膜内面向外模式。此时膜片内面直接接触浴槽液，灌流液成分的改变则相当于细胞内液的改变。可进行单通道电流记录。此模式下细胞质容易渗漏(washout)

20、，影响通道电流的变化，如Ca2+ 通道的run-down 现象。,3） 全细胞式 (whole-cell mode) 记录： 在细胞贴附式状态下增加负压吸引或者给予电压脉冲刺激 (zapping)，使电极尖端膜片在管口内破裂，即形成全细胞记录模式。此时电极内液与细胞内液相通成为和细胞内电极记录同样的状态，不仅能记录一个整体细胞产生的电活动，并且通过电极进行膜电位固定，也可记录到全细胞膜离子电流。这种方式可研究直径小于20m 以下的小细胞的电活动；也可在电流钳制 (current clamp)下测定细胞内电位。,4） 膜外面向外式 (outside-out mode)： 在全细胞模式状态下将电极

21、向上提，使电极尖端的膜片与细胞分离后又粘合在一起，此时膜内面对电极内液，膜外接触的是灌流液。可在改变细胞外液的情况下记录单通道电流。,5）穿孔膜片式 (perforated patch mode) ： 在全细胞式记录时由于电极液与细胞内液相通，胞内小分子能从细胞内渗漏到电极液中。为克服此缺点，可在膜片电极内注入制霉菌素 (nystatin) 或二性霉素 (amphotericin 使电极膜片形成多数导电性小孔，进行全细胞膜电流记录，故被称为穿孔膜片式或制霉菌素膜片式 (nystatin-patch mode)。又因胞质渗漏极慢，局部串联阻抗较常规全细胞记录模式高，钳制速度慢，故也称为缓慢全细胞

22、式。,制霉菌素 (nystatin) 或二性霉素(amphotericin),6）组织切片膜片钳技术（Slice patch） 过去认为，膜片钳只能在培养细胞或酶解的细胞上进行，这样得到的细胞膜表面比较光滑，才能够形成高阻封接，但缺点是组织的正常三维结构被破坏，并且对神经中枢内突触特有的传递机能的研究无法展开。于是，一些学者建立了组织切片膜片钳技术（Slice patch），就能在哺乳动物脑片制备上做全细胞记录。,1992年，在脑片膜片钳技术上，美国Ferster 实验室首次报道在在体猫的视皮层用膜片钳全细胞记录研究了视刺激诱发的兴奋性和抑制性突触后电位相互影响及节律性膜电位的变化规律。 19

23、93年，德国的Dodt和Sakmann合作，利用红外电视显微镜监视，使得膜片钳记录不但能够在神经元胞体及其树突上进行，而且可同时在这两个不同的部位作膜片钳记录。,1溶液配置 根据实验所用细胞的不同，研究通道的性质不同，以及实验方法的不同，配置相应的溶液。基本原则是保持2个平衡：渗透压平衡和酸碱平衡。 溶液分为：细胞分离或细胞培养的溶液、实验记录时灌流的溶液、实验电极中电极液等。,膜片钳技术基本操作,2细胞制备 实验所用的细胞主要分成两种：一种是快速酶解分离细胞，如分离心室肌细胞或肠系膜动脉平滑肌细胞。另一种是培养细胞，如转染后传代的HEK-293细胞株等。 另外，脑片或其它组织薄片。如神经细胞

24、切片标本，能保持神经细胞在体发育的程序及空间结构，有相对完整的突触联系。此外神经元没有受到消化酶的破坏，细胞生物活性接近生理状态。,左图：红外视野下的细胞 右图：荧光标记上的细胞 （位置：疑核）,slices,Patch clamp：DRG,DRG,3、微电极制备,1）玻璃毛细管的选择：有二种玻璃类型，一是软质的苏打玻璃，另一是硬质的硼硅酸盐玻璃。软质玻璃在拉制和抛光成弹头形尖端时锥度陡直，可降低电极的串联电阻，对膜片钳的全细胞记录模式很有利；硬质玻璃的噪声低，在单通道记录时多选用。 玻璃毛细管的直径应符合电极支架的规格，一般外部直径在1.11.2mm。内径1mm。 电极拉制仪制备玻璃微电极,

25、2）玻璃微电极的涂胶和抛光 一般是否涂胶与抛光应根据经验而定，不必强求。 在显微镜下将硅酮树脂(sylgard)小心地均匀涂敷于电极颈部靠尖端处，但电极尖端不能涂敷，然后用热吹风吹110秒，在刨光仪上使 电极尖端接近加热铂丝进行抛光处理，使微电极尖端表面变宽而光滑；同时根据电极尖端的口径的大小和实验的需要，适当掌握抛光的程度。,3）电极内液的充灌 制好的电极还需要充灌电极内液作为导电介质。使 用 前内液经过0.2m的微孔滤膜过滤以除去杂质颗粒。一般电极充灌可分灌尖（tip filling）和后充（back filling）两步。灌尖时将电极尖端浸入内液中5s即可，由于毛细管作用溶液会进入电极最

26、尖端处，然后从电极后端用细小的聚丙烯注射管插至尖端附近将溶液充至1/4长度，用手指轻轻弹除尖端残留的气泡。,4、高阻封接的形成,在倒置显微镜下，操作微操纵仪，将玻璃微电极与细胞膜表面轻轻接触，形成一个较低阻抗的接触。然后给电极尖端施加负压，使玻璃电极壁与膜之间形成了紧密接触，专业术语叫做高阻封接( Gigaohm Seal)，其电阻达109（G）以上，从而使离子不能从玻璃电极尖端与膜之间通过，只能从膜上的离子通道进出。 要保证亿欧姆封接就必须做到： 1)电极电阻适当；2)电极尖端清洁；3)电极气路通畅； 4)电极与细胞相贴宁不及而勿过之； 5)细胞膜清洁，活性好。,膜片钳的关键在于高阻抗的封接

27、 (gigaohm seal),5.资料分析,一般电学性质：通过I/V关系计算单通道电导，观察通道有无整流。通过离子选择性、翻转电位或其它通道激活条件初步确定通道类型。 通道动力学分析：开放时间、开放概率、关闭时间、通道的时间依赖性失活、开放与关闭类型等。 药理学研究： 研究的药物，阻断剂、激动剂或其它调制因素对通道活动的影响情况。 综合分析得出最后结沦,6、单通道记录需要注意的问题,高阻封接和噪声问题是单通道记录的两个重要问题。影响高阻封接形成的因素有三个：电极尖端表面、细胞膜表面和两者接触面液体。 良好的接地和屏蔽以及较高的封接电阻是单通道低噪声记录的关键所在。 细胞分离时酶消化适度，使细

28、胞膜表面清洁，没 有多余胶原等成分；电极制备后当时使用；细胞内液和细胞外液用时微孔过滤。,单通道记录实验中，降低噪声是保证实验成功的极其重要的一环。除了正确选择放大 器及记录设备以外，还应该从以下三方面加以考虑。 正确连接仪器：保证系统单点接地，消除大地环路。 排除外界干扰：首先应尽量避免靠近强辐射源(如马达、变压器等)。其次应采用铜丝网编织成的笼进行良好的屏蔽，显微镜、放大器探头、微操纵器等仪器置于笼中，前面开一小窗供实验者操作，其余各面封闭。 实验操作：细胞浴液不宜太多，电极内AgCl丝不要浸入液体太深，以免增大前级输入电容；保证电极夹持器(holder)清洁、干燥，任何溶液及灰尘的浸润都

29、会使记录噪声增大；电极的抛光和硅酮树脂涂敷处理。 尽可能提高电极与细胞膜的封接电阻，在一定范围内，封接电阻越高， 则噪声越小。通常作单通道记录时封接电阻应在5G以上。,全细胞记录可分为传统的全细胞膜片钳记录和穿孔膜片钳记录两种模式。 在高阻封接形成后，给电极以短暂的脉冲负压或电刺激打破电极内细胞膜，便形成全细胞式，这就是传统的全细胞膜片钳模式。通过电极尖端细胞膜的小孔可以用电极腔内液对细胞内进行透析，借此控制细胞内环境或向细胞内注射药物，这是其优点。 但另一方面，全细胞记录时一个难以克服的缺陷是：某些通道电流会随时间而衰减(rundown)。这主要源于电极内液与细胞内液之间存在的快速弥散作用导

30、致了与通道特性相关 的内源能量物质或活性物质的流失或洗脱(washout)所致。,在电极内液 中加入一定量的制霉菌素(nystatin)或两性霉素B(amphotericin B)，会在已形成细胞贴附模式的膜片上形成直径约为0.8nm的孔道，这种直径的孔道保证了电极和细胞内电学上的导通，这就是所谓的穿孔膜片钳记录技术。 穿孔全细胞膜片钳有效地避免了洗脱作用，胞质渗漏极为缓慢，可以长时间稳定记录；同时还具有对细胞损伤小的优点。穿孔膜片钳记录的特点是：(1)分子直径0 .8nm的离子和分子不能通过；(2)所有的单价阴离子和阳离子都可通过如Cl-、Na+等， 但阳离子较阴离子易通透。,Nystati

31、n属于非水溶性物质，而且对光和热非常敏感，在储存、配制和使用时都应保持nystatin溶液处于低温(接近0)和避光环境中，这样nystatin的活性可以保持一个星期左右。配制时，利用超声波发生器使nystatin母液在超声共振条件下快速稀稀 ，可以使nystatin颗粒分散得更细小，nystatin溶液终浓度为250g/ml，这种方法可使穿孔时间从原来的530min减少到28min。使用时，nystatin 溶液放置于有盖冰盒中。穿孔形成过程中，应将显微镜灯关闭。 虽然穿孔膜片钳操作复杂，难度也较传统全细胞膜片钳大，但由于其记录稳定性和更接近细胞生理情况，应用越来越广泛。,实验中的通道电流经膜

32、片钳放大器，由数模/模数转换器输入计算机贮存。数据分析主要由以下几个方面： 1宏观电流的分析 把多个单通道电流曲线进行叠加可得到反映全细胞某种离子的跨膜电流。或是采用全细胞记录，记录某种离子的电流。由此可分析通道的激活或失活的过程。通过激活和失活过程的分析，了解诸如用药后药物对离子通道的影响，也能分析通道的门控特性。同样，利用计算不同钳制电压下的通道电流幅值，可以作出电流-电压曲线，分析通道的整流特性、离子选择性和电压依赖性等（图）。,膜片钳实验的数据采集和分析,图. 钠离子通道在药物作用下开放模式及动力过程的改变 A正常对照； B海葵毒素ATX II (110-8 mol/L) 对通道电流的

33、影响； C海葵毒素ATX II (110-6 mol/L)的效应,图 豚鼠心室酶解分离细胞钾离子通道电流及电流-电压曲线 A在不同的钳制电位下，钾通道电流；B钾通道的电流-电压曲线,2单通道电流的分析 通道开放后，典型的通道电流呈现一种振幅相同而持续时间不同的矩形脉冲。表示通道有两种电导水平，即0和1，分别对应通道处于关闭还是开放。事实上，大多数通道不止一个关闭状态和一个开放状态，但在实验记录上能区分的仅仅是导通（开放）和不导通（关闭）两种状态。为了分析通道开放的动力过程，就需要计算通道从关闭进入开放的开放时间常数和通道从开放进入关闭的失活时间常数。从这两种常数中，分析通道有几种开放模式和关闭

34、模式，从而了解它的门控动力过程。,The opening and closing of Na+ channels upon membrane depolarization (a): The electrical potential across a patch of membrane. When the membrane potential is changed from 65-40mV, the Na+ channels pop open. (b): Three different channels respond to the voltage step. (C) A model for h

35、ow changes in the conformation of the Na+ channel protein might yield its functional properies.,具体方法如下：把单通道电流曲线连接起来，分别计算通道开放的持续时间和关闭时间，以通道开放或关闭的不同持续时间进行记数，作出直方图，对直方图进行指数衰减函数的拟合，算出拟合的时间常数。有可能在分析中需要用一次、二次或三次衰减函数进行拟合，那就分别表示通道有一个、二个或三个开放或关闭的时间常数。故此，通道就具有一个，二个或三个开放或关闭过程。通过对通道开放时间的分析，表明不同的钳制电位可影响到通道开放的动力过

36、程。,图 钠通道开放时间常数拟合 A不同钳制电压下钠通道的开放；B不同钳制电压下，钠通道开放时间常数的拟合,3电压门控通道的激活曲线和失活曲线 电压门控通道激活、失活过程中，通道的电导随膜电压改变的变化曲线，即电导-电压（G-V曲线）。通常，以电导或电流的标准化值作为纵坐标，指令电压为横坐标，G/Gmax=I/Imax 。从这两种曲线中，分析通道开放和关闭过程中电导的变化，从而了解它的门控动力过程。,1. 应用学科 目前膜片钳技术广泛应用于神经（脑）科学、心血管科学、药理学、细胞生物学、病理生理学、中医药学、植物细胞生理学、运动生理等多学科领域研究。 随着全自动膜片钳技术（Automatic

37、patch clamp technology）的出现，膜片钳技术因其具有的自动化、高通量特性，在药物研发、药物筛选中显示了强劲的生命力。,膜片钳技术的应用,2. 应用的标本种类 使用的标本种类繁多。从最早的肌细胞（心肌、平滑肌、骨骼肌）、神经元和内分泌细胞发展到血细胞、肝细胞、耳窝毛细胞、胃壁细胞、上皮细胞、内皮细胞、免疫细胞、精母细胞等多种细胞； 从急性分散细胞和培养细胞（包括细胞株）发展到组织片（如脑片、脊髓片）乃至整体动物； 从动物细胞发展到细菌、真菌以及植物细胞。 此外，膜片钳技术还广泛地应用到平面双分子层（Planar bilayer）、脂质体（Liposome）等人工标本上。,3.

38、 研究对象 研究对象已经不局限于离子通道。从对离子通道（配体门控性、电压门控性、第二信使介导的离子通道、机械敏感性离子通道以及缝隙连接通道等等）的研究发展到对离子泵、交换体以及可兴奋细胞的胞吞、胞吐机制的研究等。,4. 膜片钳技术的主要用途,膜片钳技术广泛用于研究细胞离子通道，已经成为研究细胞水平生理功能的常用技术。归纳其主要用途包括：1）可分辨单通道电流，直接观察通道开启和关闭的全过程。通过测得的单通道特征参数可鉴别通道类型，同时可验证和研究通道的开关动力学模型。2）单通道记录可以解释某些药物的作用机制，以研究特定药物对电压和递质依赖通道的影响。3）膜片钳的空间分辨率高，在中枢神经系统中可分

39、离细胞体与轴突和树突的电流；在周围神经系统中可深入了解受体的分布区域，绘制细胞表面的特定离子通道的分布图。,4）“内面向外”和“外面向内”膜片记录允许任意改变膜片内外溶液成分，分别研究单一组分对通道特征的影响，避免了其他成分的干扰。而全膜片记录可用来研究常规电压钳无法研究的小型细胞，在控制细胞内一定离子浓度的同时监测整个细胞膜的电活动。这种方法已被用于采用重组DNA技术表达的通道研究。5）膜片钳技术还可用于研究第二信使的作用。,5. 应用举例,(1) 在离子通道研究中的重要作用 应用膜片钳技术可以直接观察和分辨单离子通道电流及其开闭时程、区分离子通道的离子选择性、同时可发现新的离子通道及亚型，

40、并能在记录单细胞电流和全细胞电流的基础上进一步计算出细胞膜上的通道数和开放概率，还可以用以研究某些胞内或胞外物质对离子通道开闭及通道电流的影响等。,分辨单通道电流，直接观察通道的开闭过程； 区分离子通道的离子选择性及其门控特性(如区分电压、化学或门控性通道)，发现新的离子通道及亚型； 在记录单个通道电流()和全细胞电流()的基础上，可分别计算出细胞膜上的通道数()和开方概率()，依公式=；,用以检测某些递质能否打开通道(外面向外膜片)，或是否接受第二信使的调控(内面向外膜片)， 研究腺苷酸环化酶、多磷酸磷脂酰肌醇激酶、蛋白激酶等活性变化，以及细胞膜上信使物质二酰甘油花生四烯酸等对离子通道型受体

41、的调节机制(应用全细胞钳或外面向外膜片)； 研究受体的激活态、失活态和静息态的功能；,研究不同离子强度对通道特性的影响及细胞内信使物质如1,4,5-三磷酸肌醇、环腺苷酸(cAMP)、环磷酸鸟苷(cGMP)、Ca2+等对离子通道型受体的调节机制(内面向外膜片)。 研究药物对电压和化学内控性通道的影响。,（2）对药物作用机制的研究 通过膜片钳技术对离子通道药理学的研究可观察药物对离子通道的影响、分析药物在靶离子通道或受体上的作用位点等。这是目前膜片钳技术应用最广泛的领域，既有对西药药物机制的探讨，也广泛用在重要药理的研究上。也常用于对活性药物进行筛选。,在心血管药理研究中的应用 随着膜片钳技术在心

42、血管方面的广泛应用，对血管疾病和药物作用的认识不仅得到了不断更新，而且在其病因学与药理学方面还形成了许多新的观点。正如诺贝尔基金会在颁奖时所说：“Neher和SaKmann的贡献有利于了解不同疾病机理，为研制新的更为特效的药物开辟了道路”。,创新药物研究与高通量筛选 目前在离子通道高通量筛选中主要是进行样品量大、筛选速度占优势、信息量要求不太高的初级筛选。最近几年，分别形成了以膜片钳和荧光探针为基础的两大主流技术市场。将电生理研究信息量大、灵敏度高等特点与自动化、微量化技术相结合，产生了自动化膜片钳等一些新技术。,膜片钳技术与光学成像术的结合拓宽了膜片钳技术的应用范围。 目前广泛应用的是在用荧

43、光探针测定细胞内游离Ca2+离子浓度的同时检测离子通道的功能改变。采用共聚焦激光扫描显微镜可动态地精确测定Ca2+浓度。荧光探针可通过膜片钳电极向细胞内注入，也可通过膜片钳电极将细胞内的荧光探针抽吸稀释掉，从而测定细胞器（线粒体、内质网等）内的游离Ca2+浓度。,（3）膜片钳技术与其它技术相结合,膜片钳的膜电容检测与碳纤电极电化学检测联合运用，之后又将光电联合检测技术与碳纤电极电化学检测技术首先结合起来。这种结合既能研究分泌机制，又能鉴别分泌物质，还能互相弥补各单种方法的不足。,Eberwine等于1991年首先将膜片钳技术与RT-PCR技术结合起来运用，可对形态相似而电活动不同的结果作出分子

44、水平的解释，从此开始了膜片钳与分子生物学技术相结合的时代：基因重组技术，膜通道蛋白重建技术。 eg.在全细胞膜片钳记录下，将单细胞内容物或整个细胞（包括细胞膜）吸入电极中，将细胞内存在的各种mRNA全部快速逆转录成cDNA，再经常规PCR扩增及待检的特异mRNA的检测，借此可对形态相似而电活动不同的结果做出分子水平的解释或为单细胞逆转录多聚酶链式反应提供标本，为同一结构中形态非常相似但功能不同的事实提供分子水平的解释。,结合分子克隆和定点突变技术，膜片钳技术可用于离子通道分子结构与生物学功能关系的研究。利用膜片钳技术还可以用于药物在其靶受体上作用位点的分析。 eg. 神经元烟碱受体为配体门控性

45、离子通道，膜片钳全细胞记录技术通过记录烟碱诱发电流，可直观地反映出神经元烟碱受体活动的全过程，包括受体与其激动剂和拮抗剂的亲和力，离子通道开放、关闭的动力学特征及受体的失敏等活动。,尽管膜片钳技术发展的历史不长，但由于它能分辨通过细胞膜单个通道的电路，而多数实验都是以在特定细胞上表达的单个离子通道的性质为研究对象，因此，已得到了广泛的应用，并已取得了许多重大的进展。 通过膜片钳技术，人们才认识到膜通透性变化的本质，了解离子通道可有三种状态：开、关和失活。通道的开放是全或无式的，通道一旦打开形成的离子流幅值恒定，而只有开放时间长短的变化，因此通道开放的机率和开放的持续时间依赖于膜电位和时间。而配

46、基门控通道有关闭、开放和脱敏三种状态，配基与受体的结合和解离的过程比较慢，通道开放态和关闭态的转换比较快，另外配基门控通道还受其他配基和磷酸化的调制。,展 望,应用膜片钳技术可证明受体的存在并进行受体分型，即通过快速换液装置加相应的激动剂、拮抗剂及变构性调制剂，记录膜单通道的离子电流，并根据受体的动力学及其它特性来证明所要检测的受体。 膜片钳技术扩展了电生理技术的应用范围，如以往因技术缘故难以研究哺乳动物的小细胞或脆性很大的细胞，而今用膜片钳技术则可进行研究。 膜片钳技术与Fura-2荧光测钙技术结合，一方面以荧光强度监测细胞内Ca2+浓度的变化，另一方面以全细胞膜片钳技术同时记录同一细胞膜电

47、容的变化，进而分析研究细胞内Ca2+浓度与细胞分泌事件之间的关系。,膜片钳技术与单细胞逆转录多聚酶链式反应技术结合，一方面可对形态相似的细胞作基因水平的鉴定，另一方面可对形态相似而电活动不同的细胞作出分子水平的解释。 另外，膜片钳技术还可以揭示细胞内的信息传递、细胞生长过程，甚至包括中枢突触的复杂相互作用，相信不远的将来，这种技术在揭示生物活动奥秘中起着不可估量的作用。,1、何谓膜的被动电学特性？其值和值的含义是什么？ 其电紧张电位在体内电信号传播有何生理意义？举例说明。 2、平衡电位与静息电位有何区别？ 3、简述离子通道的一般特性和电学特性。 4、什么是通道的整流特性? 举例说明。 5、简述

48、生物电信号的特性及记录方法。 6、简述膜片钳实验技术常用的记录方式及特点。 7、膜片钳技术最大的优越性在哪里？目前主要应用于哪些领域？ 8、简述电生理研究技术的发展历史及其意义。,思考题,1、张日辉编著的实用电生理基础，北京师范大学出版社，2010 2、关兵才，张海林，李之望 主编细胞电生理学基本原理与膜片钳技术，科学出版社，2013。 3、研究生电生理技术实用教材 南方医科大学 肖中举等. 4、康华光等编著。膜片钳技术及其应用，科学出版社，2003 5、李泱主编。离子通道与膜片钳技术，甘肃文化出版社，2001 6、陈军编，李继硕校。膜片钳实验技术，科学出版社，2001 7、Textbook.Of.Medical.Physiology,.Guyton.11th.ed,.2005 7、Bretschneider F,De Weille J R. 2006. Introduction to Electrophsiological Methods and Instrumentation. Amsterdam:Academic Press.,参考资料,谢谢！,