生物反应工程生物工程反应2.ppt

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1、生物工程反应,姜 梅 2010.10,第3章 微生物反应动力学,本章的重点 细胞反应过程计量学有关概念及计算； Monod方程的意义及计算； 本章的难点： Monod与米氏方程相同点与不同点； 基质消耗动力学。,微生物培养的特点,A. 优点： 微生物常能分泌或诱导分泌有用的生物化学物质，容易筛选出分泌型突变株，微生物的生长速率快，微生物的代谢产物的产率较高等。 微生物反应是生物化学反应，通常是在常温，常压下进行，并且同一设备可生产多种产物； 原料来源丰富； 易于生产复杂的高分子化合物和旋光性物质； 除产生反应产物外，菌体自身也可是产物，可能成为富含维生素，蛋白质和酶等的有用产物； 通过菌种改良

2、，有可能使同一生产设备的生产能力大大提高。,B.缺点,底物不可能全部转化成目的产物，副产物的产生不可避免。这样，目的产物的提取与精制就很困难，这正是造成目前发酵行业下游操作落后的原因之一。 微生物反应是利用活的生物体进行目的产物生产的反应，因此，产物的获得除受环境因素影响外，也受细胞内因素的影响，并且微生物菌体易发生遗传变异，因此，实际控制相当困难。 原料是农副产品，所以受价格变动影响大。 生产前的准备工作(开发新菌种，扩大培养等)量大，且花费高，相对化学反应器而言，反应器效率低。对于好氧反应，因为要通氧，故增加了费用，且氧的利用率不高。 具有较高的BOD值，需进行处理。,3.1细胞反应过程计

3、量学 含细胞的体系作为暗箱,3.1.1 微生物反应过程的质量平衡 假设： A. 物质平均分子式：CHXOYNZ B. 基质：有机碳源： CHmOn 无机氮源：NH3 C. 产物：完全反应： CO2、H2O 不完全反应（厌氧或兼氧）： CHUOVNW（胞外） D. 电子受体分子态氧（O2） E：细胞的一碳反应摩尔质量定义为含有1mol碳原子的细胞质量。,方程： 碳源+氧+氮源=菌体+有机化合物+CO2+H2O CHmOn+aO2+bNH3=cCHXOYNZ+dCHUOVNW + eH2O +fCO2 原则： A. 平均分子式： B. 元素：C、N、H、O平衡 C. 呼吸商:,原则,D.还原度：

4、（胞外产物的反应，质子-电子平衡） 该组分中每1mol碳原子的有效电子数当量数。 有效电子数： 1mol碳源完全氧化时，所需氧的摩尔数的4倍, 如：C6O12H6 的摩尔数64=24（6mol O2） a. C=4，H=1，N= -3，O= -2，P=5，S=6 O2 =-4 b. NH3、H2O 、 CO2为 零.,CHmOn+aO2+bNH3=cCHxOyNz+dCHUOVNW + eH2O +fCO2,细胞X：rX=4+x-2y-3z 基质S： rS=4+m-2n 产物P： rP=4+u-2v-3w 质量平衡： rS -4a=c rX +d rP,a=2.394 b=0.085 c=0.

5、564 d=1.436 e=2.634,1,例2推断分子式,3.1.2细胞反应过程的得率系数,得率系数: 对碳源等物质生成细胞或其他产物的潜力进行定量评价。最常用的几种得率系数有下述几种： 细胞得率或生长得率YX/S 对元素的细胞得率YC、YX/O 对能量的细胞得率Y-ave 、 YKJ、 YATP,细胞得率或生长得率YX/S,YX/S（细胞/基质：g/g、g/mol) 微分细胞得率 同一菌种，同一培养基，好氧培养的YX/S 比厌氧培的大得多； 同一菌株在基本、合成和复合培养基中培养所得 YX/S的大小顺序为复合培养基、合成培养基和基本培养基。 不同碳源培养基， YX/S不同,几种微生物的菌体

6、得率,宏观得率与理论得率,当细胞生长的同时，还伴有其他反应如代谢产物的生成时，则所消耗的基质一部分用于细胞的生长，一部分用于生成代谢产物。 S= SG （生长）+ SR （产物） 宏观得率 理论得率 Y*X/S YX/S,对元素的细胞得率YC、YX/O,YC碳同化细胞的过程的转化效率。 YC小于1，为0.40.9 XC、SC单位质量细胞和单位基质中所含的碳元素量 YX/O,例3求例题2中酵母细胞(CH1.75N0.15O0.15)的YX/S和YX/O。,解：由细胞得率定于及例2 ，有,对能量的细胞得率Y-ave 、 YKJ、 YATP,Y-ave：基质完全氧化失去1 mol有效电子时的细胞得率

7、。（g/g 、 g/mol） YATP ：消耗1 molATP所获的干菌体克数。 （g/mol） YKJ：1KJ基质燃烧热产生细胞干重得率. （g/KJ） YKJ=Y-ave/109.0,部分菌体得率与产物得率,例4,例4,3.2 细胞生长的非结构动力学,3.2.1细胞反应过程主要特征 细胞是反应过程的主体 细胞反应过程的本质是复杂的酶催化反应体系 细胞反应与酶催化反应也有着明显的不同 酶本身不能进行再生产；细胞自己能进行再生产 ；在细胞反应过程中细胞的形态、组成、活性都处在一动态变化过程。,3.2.2环境对细胞生长的影响,细胞种类和来源 外环境 营养物质的种类和浓度,环境的pH,、温度、剪切

8、力等,温度,温度,pH,细菌：6.5-8.0 霉菌和酵母：4-6,渗透压 好盐细菌：30%NaCl 耐糖酵母：70%蔗糖溶液 溶解氧（solved oxygen,DO） 光 光氧型微生物、藻类和植物细胞 剪切力,综合因素,3.2.3 细胞生长动力学的描述方法,A.理想的微生物生长模型应具备下列4个条件： 要明确建立模型的目的。 明确地给出建立模型的假定条件，这样才能明确模型的适用范网。 希望所含有的参数，能够通过实验逐个确定。 模型应尽可能简单。,B. 模型分类,结构模型和非结构模型 是否考虑细胞组成变化（均衡生长） 确定论和概率论 是否考虑细胞群体中的个体变化 与细胞的浓度有关 分立模型和非

9、分立模型 是否考虑细胞群体个体差异,最理想情况： 不考虑细胞内部结构； 各种细胞均一； 细胞群体做为一种溶质 A,细胞之间无差异，是均一的，细胞内有多个组分存在 B,不考虑细胞内部结构； 各种细胞不均一 C,实际情况： 细胞内多组分； 细胞之间不均一 D,均衡生长,均衡生长,非结构模型,结构模型,平均细胞的近似,平均细胞的近似,C.反应速率,细胞的生长、基质的消耗和产物生成的变化情况，要描述这种变化，采用绝对速率和比速率两种定义方法。 绝对速率(又简称为速率) :表示为单位时间、单位反应体积某一组分的变化量。 比速率:单位浓度细胞(或单位质量)为基准而表示的各个组分变化速率,D.倍增时间td与

10、关系,倍增时间与世代时间不同,例以乙醇为惟一碳源进行产气气杆菌培养，菌使浓度X0=0.1kg/m3，培养至3.2h，菌体浓度为8.44kg/m3，如果不考虑延迟期，比生长速率一定，求倍增时间td,3.2.4无抑制的细胞生长动力学,A. Monod方程：细胞的生长为均衡式生长，细胞的比生长速率与限制性基质浓度的存在着关系。 a.假设： 细胞的生长为均衡式生长，细胞生长的唯一变量是细胞的浓度； 培养基中只有一种基质是生长限制性基质，而其他组分为过量，不影响细胞的生长； 细胞的生长视为简单的单一反应，细胞得率为一常数。,B.Monod方程,Ks饱和常数（g/L）比生长速率是最大比生长速率是一半时的限

11、制性基质的浓度。 max微生物的最大比生长速率（s-1) c.Monod方程适用范围： 适用于细胞生长较慢和细胞密度较低的环境。 如果基质消耗速率过快，则极有可能产生有害的副产物；在细胞浓度很高时，则有害的副产物可能更多。因此，人们又提出另外一些无抑制的细胞生长动力学。,式中Cs0基质初始浓度； Kso无因次初始饱和常数。 其他方程,若干常见微生物 max与Ks值,d.与S关系,与S关系,d 与S关系,当限制性基质浓度很低时，SKs，此时若提高限制性基质浓度，可以明显提高细胞的生长速率。此时有：细胞比生长速率与基质浓度为一级动力学关系。,d.分析,当SKs时， =max，若继续提高基质浓度，细

12、胞生长速率基本不变。此时细胞比生长速率与基质浓度无关，为零级动力学特点。,c. 当S处于上述两种情况之间，则与Cs关系符合Monod方程关系。,rX,例乙醇为唯一碳源进行面包生产，获得如下数据： 求和Ks。,解：由图可知： =0.18(h-1) Ks=0.029kg/m3),例采用合成培养基，在1m3生物反应器中进行大肠杆菌分批培养，菌体的生长变化利用Monod方程描述，已知max=0.935h-1，Ks=0.71kg/m3，基质初使浓度50kg/ m3 ,菌体X0= 0.1 kg/m3，YX/S=0.6kg/kg,（以细胞/基质），求当80%的基质已反应时所需时间。,解：当80%的基质反应时

13、， S=50（1-80%）=10 kg/m3 Ks=0.71kg/m3 则 （1） YX/S=0.6kg/kg 恒定，生成菌体量 （S0-S）YX/S=40 0.6=24（kg) 当t=t0, t=t时，菌体量有0.1增至24 kg，对（1）积分,b. Monod与米氏方程的比较：,相同：形似； 在一定条件下使用。 Monod方程往往必须在具体条件下进行适当修正。 不同： Monod方程经验表达式；而米氏方程数学推导式 。 细胞利用营养成分的过程与单一酶促反应过程不同，因前者与细胞的生理、营养、代谢有关。,不同：,酶在反应完成后，其数量保持不变(假定不失活)，但微生物反应完成后细胞量却发生变化

14、(自催化反应)。 米氏方程是反应速率与底物浓度之间的对应关系，而Monod方程表明了比生长速率与限制性基质浓度之间的对应关系。比生长速率不直接参与反应，是一系列生化反应的间接结果。 如果在细胞生长中蛋白质合成是限制因素，则两式趋于近似。 米氏常数的大小，表明了酶对底物亲和力的强弱，Ks的大小则表明 细胞对限制性基质的依赖性的大小。,逻辑方程 ：,式中(1-x)综合描述了因营养物质匮乏和有毒代谢物积累等各种限制和抑制细胞生长的因素。,适用于营养成分复杂、生长限制因素不清楚的情形。在生态学和间歇发酵动力学广泛应用。,其他,不同方程所获得的菌体浓度与时间的变化关系,3.3基质消耗动力学,3.3.1基

15、质消耗表达方法 A.基质消耗速率仅用于维持细胞生长 基质消耗速率 基质比消耗速率,B.基质消耗速率用于维持细胞生长和 维持代谢的消耗,基质消耗速率 基质比消耗速率 -=g(),C.基质消耗速率用于产物的消耗,a.与能量偶联同B b.与能量间接偶联 基质消耗速率 基质比消耗速率,与能量关系,3.3.2氧的消耗速率,A.消耗速率仅用于生长 B.消耗速率用于生长和代谢,关系,3.4代谢产物的生成动力学,模型类型：相关、部分相关、非相关 3.4.1相关模型： 产物是细胞能量的代谢的结果 rP=Yp/xrx=-YP/SX 乙醇、葡萄糖酸、乳酸 曲线：变化趋于同步，rP,max，max同步,模型类型：相关

16、、部分相关、非相关,变化曲线,3.4.2部分相关模型 产物是能量代谢的间接结果； rP=rX+x , = + 柠檬酸、氨基酸 曲线：， 3.4.3非相关模型 产物的生成与细胞的生长无直接关系 rP = x ，= 抗菌素、微生物毒素 曲线,例证明下列反应速率动力学为= + 的形式。,相对分子质量： 180 46 44 各物质中的含碳量： vs=0.40 vp=0.52 vCO2=0.27 CO2的生成量为不考虑有其他产物生成时，反应系统的碳平衡式为 0.40（-）= vs+0.52+0.270.957 （vs为单位质量菌体中的含碳量，为常数） 0.40（-）= vs+0.788 又有 其中m维持

17、常数 YG无维持代谢的细胞最大得率，常数 因此， 故证明乙醇发酵反应速率动力学符合= + 的形式，其中、为常数。,其中， m、YG、vx为常量，则上式可写为 = + 的形式。,模型,3.5 细胞死亡动力学,3.5.1细胞死亡动力学 营养细胞 对数死亡动力学 V D 积分 k d是温度函数，,kd,芽孢死亡动力学,菌体循序死亡模型（非对数） R S D 积分,kr,ks,3.5.2 灭菌原理,微生物灭菌的原理来源于细胞死亡动力学，对于不同的细胞其死亡难易程度不同。一般来说营养细胞容易被杀死，而芽孢则因有致密的外皮和干燥的内含物，难以致死。因此，在设计灭菌操作时，总以芽孢为灭菌对象，只要杀死了芽孢

18、，其他杂菌也一定能杀灭。同时要考虑灭菌的同时，减少培养基有效成分的损失。由于温度变化对营养成分破坏的影响，明显小于芽孢的热死亡，因此，多采用高温、瞬时的灭菌方法。 通常认为细胞浓度10-4个/ml为无菌。,灭菌原理,根据动力学分析。微生物受热死亡时的活化能一般比营养成受热分解的活化能大得多，因此，当温度升高时，微生物的死亡速率的增加要比营养成分破坏速率的增加大得多。,例为了发酵，采用蒸汽对分批发酵罐中液体培养基进行灭菌，已知其含有杂菌的初始浓度为108个杂菌/L。细胞死亡速率可用一级动力学表示。根据要求，最终可以接受的含杂菌浓度为10-3个杂菌/L。现假定该杂菌为嗜热脂肪芽孢杆菌，已知其热死活

19、化能为283kJ/mol,阿累尼乌斯常数为1036.2s-1。若处理的培养基为1m3，试求分别在80、121和140进行灭菌时，各需要多长时间？,解：由题意可得：,第4章 微生物反应器操作,微生物反应器 一般由反应器、空气系统、检测系统、阀门、管道和附属设备组成。 实罐灭菌时，蒸汽可从进气口、排料口和取样口进入，从其它口排出，即所谓“三进四出”或“三进五出”,物流： 空气 蒸汽 水 物料（补料） 检测： pH T 溶氧 消泡,气生式发酵罐,由喷嘴、升管和降管组成，利用喷嘴功能和流体在发酵罐的重度造成循环流动来实现发酵液的搅拌混合和溶氧（图3）,41 微生物反应器操作基础,按是否供养，分厌氧和好

20、氧。好氧分为 (1)液体表面培养(如使用浅盘)； (2)通风固态发酵； (3)通氧深层培 操作方式而言，深层培养可分为： (1)分批式操作 。 (2)反复分批式操作 (3)半分批式操作 (4)反复半分批式操 (5)连续式操作,4.2 分批操作,简单的过程，培养基中接入菌种以后，没有物料的加入和取出，除了空气的通入和排气。整个过程中菌的浓度、营养成分的浓度和产物浓度等参数都随时间变化,对于初级代谢产物，在对数生长期初期就开始合成并积累，而次级代谢产物则在对数生长期后期和稳定期大量合成。,分批操作的优缺点,优点 操作简单，周期短，染菌机会少，生产过程和产品质量容易掌握； 缺点 产率低，不适于测定动

21、力学数据,4.2 分批操作,4.2.1 生长曲线 迟缓期 特点：细胞质量浓度在一段时间内无明显增加的这一阶段。 延迟期的时间一般由实验确定 对数生长期 细胞生长速率与细胞浓度是一级动力学关系。 一定,当t=tlag时，令X=X0，积分，有,减速期 ：在减速期内，细胞生长速率与细胞浓度仍符合一级动力学关系，即： X KdX 但其中 值受到基质浓度的限制。 静止期 细胞的纯生长速率为零。 X KdX=0,衰退期：,底物消耗尽 X=Xstexp(kdt) Monod方程变为 S=0,4.2.2 状态方程,培养过程的代谢参数： 、 、 、DO、DCO2、 P、S、X 基质： 菌体： 产物：,O2： C

22、 O2：,t=0时， S=S0，X=X0，P=0， = 0 ， =0 = 0 ， = ， =,例以甘油为基质进行阴沟气杆菌（Aerobacter cloacae)分批培养。时间t=0时，X0=0.1g/L，S0=50g/L。反应方程式可以用Monod方程表示，max=0.85h-1，Ks=1.2310-2g/L，YX/S=0.53g/g(以细胞/葡萄糖计），若不考虑诱导期和死亡期，求培养6h的菌体浓度。,解：由菌体得率定义，代入已知数值，有 （1） 因此，基质浓度与菌体浓度有如下关系 （2） 由（1）式变形可得 （3）,因为 （4） 将（3）式代入（4）中，整理 积分，得 (5) 将已知条件代

23、入（5），得 X=16g/L,4.2.3 反复分批培养操作,设培养液体积V（一定），培养液取出率，滤液取出率 ，培养液加入量( + )V=F 则，根据物料平衡 菌体 XiV=XfV- XfV 产物 P iV=P fV-(P fV+ P fV) 生产能力,反复分批培养操作,例 在有氧条件下，杆菌在甲醇上生长，在进行间歇培养时得到结果如表所示：,试求： （1） max值。（2） Yx/s值。（3） 细胞质量倍增时间td值。（4） 饱和常数KS值。（5） 在t=10h时比生长速率值。,解：由题意可得,小结:,原始数据: X、S、P、t 数据处理： 对细胞动力学，变换为线性方程， 作图计算细胞动力学参

24、数Ks和 由细胞动力学参数 Ks和 ，计算底物消耗动力学参数和产物动力学参数。,小结：,根据实验绘图X、S、P-t 判断对数生长期，利用 ， 积分 形式 绘图 和 ， 得直线，直线斜率,4.3流加操作,在分批培养过程中补入新鲜的料液，以克服营养不足而导致的发酵过早结束的缺点。 在此过程中只有料液的加入没有料液的取出，所以发酵结束时发酵液体积比发酵开始时有所增加。在工厂的实际生产中采用这种方法很多。,特点,优点 ：在这样一种系统中可以维持低的基质浓度，避免快速利用碳源的阻遏效应；可以通过补料控制达到最佳的生长和产物合成条件；还可以利用计算机控制合理的补料速率，稳定最佳生产工艺,即能够任意控制反应

25、液中基质浓度。,缺点： 由于没有物料取出，产物的积累最终导致比生产速率的下降；由于有物料的加入增加了染菌机会。,4.3 流加操作,目的：可以减缓基质对细胞生长的抑制；实现细胞高密度培养提高生产能力。 解决的核心问题：流加什么和怎么流加 流加方式：无反馈控制 定流量流加 指数流加 最优量流加 有反馈控制 间接 直接 定值 程序,根据控制参数,根据底物浓度情况,反应液体积变化,4.3.1 无反馈控制的流加操作,若基质流加量=基质消耗量，得Xmax dS/dt0， 若S、X近似恒定， dX/dt0， =F/V=D,定流量流加操作,dV/dt=F=定值，t=0, S=S0, X=X0, V=V0 微生

26、物成线性增长 菌体恒算 t=t，,指数流加操作,定值 ，S为常数，dX/dt=0 在拟稳定条件下， 培养液体积 V=V0exp(t) 菌体量 XV=X0V0exp(t) 流量 F=F0exp(t) 流加,4.3.2 有反馈控制的流加操作,发酵过程中一边补入新鲜料液一边放出等量的发酵液，使发酵罐内的体积维持恒定。 一般地，达到稳态后，整个过程中菌的浓度，产物浓度，限制性基质浓度都是恒定的。,4.4 连续式操作,分类： CSTR(continuous stirred tank rector) 恒化器法（chemostat):基质流速一定 恒浊器法（turbidstat):细胞浓度一定 营养物恒定法

27、(nutristat):培养基的成分 细胞浓度一定 CPFR(continuous piug flow rector):多用于酶反应 应用：单细胞培养、面包酵母、小球藻,连续培养的优缺点,优点：控制稀释速率可以使发酵过程最优化。发酵周期长，得到高的产量。由于D，通过改变稀释速率可以比较容易的研究菌生长的动力学。,缺点：菌种不稳定的话，长期连续培养会引起菌种退化，降低产量。长时间补料染菌机会大大增加。,4.4.1恒化器法连续操作 4.4. 1.1单级连续培养培养基只有一种限制成分,状态方程 变化量=流入量+生成量-流出量 菌体 基质 产物,培养系统,培养系统,F培养液流入与流出速度，L/h。,稀

28、释率,分析 稳定操作的条件：dX/dt=0，即=D 自平衡能力稀释率 判断 A. D ， dX/dt 0,X ,S =D B. D ， dX/dt 0,X , S =D 根据这一特点调节生长环境，考察微生物的生长特性,X、S、P与 D的关系,冲馈现象,A. 定义：当D增大到某一数值max时，S迅速增大，X迅速下降至零，这种在稳定状态丧失所有生物体的现象就叫冲馈现象。 B. 原因：基质在反应器内停留的时间太短，以至菌体来不及生长繁殖，基质已流出反应器外。,Dcri临界稀释率：菌体浓度为零的稀释率。 可测定max 。 若S in KS D= max,菌体产量DX,产物量DP,最高产物产率的稀释率,

29、最高产物产率：DmaxXmax,例、葡萄糖为限制性基质进行呼吸缺陷性酵母发酵突变株的单级连续培养（恒化器法）。请给出存在乙醇有抑制和无抑制两种情况下稀释率D与菌体浓度X 、基质浓度S与产物（乙醇）浓度P的关系。已知原料中不含产物乙醇（P=0)，S0=10g/L。,解：稳定状态下，X的关联式为： 对于产物抑制，由表查得抑制方程动力学为,（1）,将已知数据代入（1）（3）式，计算相应的X、S和P值，结果见图,（3）,无抑制 有抑制,（2）,例求青霉素连续发酵稳定状态下最大菌体生成速率(DX)max及此时的D、X和S。已知（菌体生长可用monod方程表达）S0=30g/L, YX/S=0.45, m

30、ax=0.18h-1,KS=1.0g/L,解：将数值代入 得,4.4.1.2具有反馈的单级连续培养,特点；提高系统内的稳定范围，减小冲洗现象出现的几率；使发酵罐在菌体较高的情况下运作，有利于菌体的繁殖、生长和提高发酵产物的产率。 衡算,g菌体浓缩系数（1） r在循环反应液的比例（0） （返回的反应液与供给的新鲜液的体积比）,D为“外部”稀释率，对于反应器本身，还要用一个“内部”稀释率D的概念，它等于D加上rD，,有反馈的单级或多级连续培养中，稳态下的稀释率都高于比生长速率。这与常规单级连续培养（保持）不同。前者流入反应器的培养液体积要相对多一些。这一方法在生物法废水处理过程之一的活性污泥法中普

31、遍采用，因为其有利于提高除污能力。,理论上，反馈操作使菌体产率增大，但实际运用并不尽然。反应液中菌体的浓度取决于收率和底物消耗的数量，即 因此，无其它限制因子时，微生物菌体浓度在一定范围内受底物浓度的制约。如果采用控制底物浓度的方法来控制菌体浓度，可使无反馈反应系统中的菌体浓度达到反馈条件时的菌体浓度的同样数值，此时，反馈对于提高菌体产率并不显示优越性。相反，由于分离后反应液中菌体浓度降低，对菌体生产（如面包酵母生产）反而不利。,对于具有反馈的单级系统来讲，还要考虑排出反应液中菌体的浓度。菌体分离装置处的菌体恒算式为,所以， 即菌体产率等于比生长速率与 的乘积。 由于具有反馈时的 大于无反馈时

32、的 ，因此， 反馈使反应器的产率增加了 倍。,所以，从菌体分离装置处流出的菌体浓度为,4.4.1.3 多级CSTR串联,A. 分类 单流多级串联：后级对前一级无影响（无循环） 多级多流：第二级相同 D独立、前后级不影响 带循环多级串联：D之间有关系（优点：基质利用充分转化率高、操作复杂）,B单流多级串联系统,假设一般进料、稳态操作； 各级CSTR体积相同； 每一个反应器为全混流，各反应器内无返混； 各反应器操作条件相同，得率为常数。 方程建立,X：,S：,，D,应用 解决不同生产阶段有不同生产要求的矛盾； 若不是细胞本身，而是细胞分泌（次级代谢产物） 单罐连续发酵不如双罐串联 解决快速生长和营

33、养充分利用矛盾； 充分利用基质,4.4.2 恒浊器法连续操作, max操作 X保持一定，进行反馈控制（F变量） 测定参数，通过pH、CO和S进行控制 理想X（细胞流变仪），初期通过光电装置测定浊度.,4.4.3 固定化微生物反应器的连续操作,由于微生物固定于载体上，不受操作上“冲出”想象制约，流加基质的流量可适当增大（D范围 ） 能够在一定程度上避免悬浮液微生物连续反应中最为危险的杂菌污染问题 单细胞悬浮液微生物的反应速率几乎不受物质传递的影响，但固定化微生物反应速率却受到物质传递的影响。,4.5 其他模型,4.5.1最简单的结构模型两室模型 Williams于1967年提出的两室模型(two

34、 compartmental model)。 两室模型将细胞分为两部分：合成室(synthetic compartment)，简称K室，由RNA和前体物质等组成；遗传室(structural-genetic compartment)，简称G室，由DNA和蛋白质等组成。单位体积细胞中K室和G室的密度分别记为 和 。,细胞完全由K室和G室组成。因此细胞的密度c为 c=k+G 将反应器体积和反应体系中的细胞总体积分别记为VR和VC,则反应体系中细胞的质量浓度X与细胞总体积的关系为 X= cVc/VR,细胞内G室质量的加倍(即DNA复制完成)是细胞分裂的充分必要条件，也就是说，从宏观上看细胞的数量与反

35、应体系中G室的质量(GVC)成正比。,假设,K室、G室和细胞外环境中底物的关系图,在细胞内,K室按一定的速率转化为G室，反应速率与K室和G室在细胞中浓度的乘积(KG)成正比。,细胞吸收底物将其转化为K室组分，该反应的速率与反应体系中的细胞浓度(X)和底物浓度(S)成正比，底物转化为细胞组分的得率系数为YX/S;,特点,描述间歇生长的迟滞期，以及在生长过程中因细胞尺寸的变化导致细胞生物量的增加与细胞数目增加的不同步现象。,Williams两室模型模拟的间歇生长过程 （接种用的细胞是对数生长期末期的细胞）,细胞分裂,4.5.2最简单的分立模型细菌成熟模型 1971年，Blanch和Rogers提出

36、了菌龄分布模型,短杆菌肽S（细菌次生代谢产物） 内容：1）细胞群体按菌龄人为地分为两类，即不成熟细胞(X1)和成熟细胞(X2)，两类细胞的元素组成和大小完全相同 。,不成熟细胞X1,产物,Monod方程,老化过程,成熟细胞X2,X=X1+X2,内容,1）新生细胞按一定的速率转化为成熟细胞(这个过程称为老化过程或成熟过程)，一个成熟细胞可以通过分裂繁殖形成两个新生细胞。细胞老化的速率与新生细胞的浓度成正比。成熟细胞的分裂速率则用Monod方程描述。 2）假设限制性底物完全消耗在成熟细胞分裂为新生细胞的过程中，也就是说限制性底物被完全用来合成新的生物量，每次细胞分裂需要消耗的底物量恰好足以合成一个

37、新细胞。 3）非生长偶联型产物的生成速率与成熟细胞的积累速率成正比。,菌龄分布模型拟合短杆菌S发酵过程,细胞生长曲线符合Monod方程描述。,第5章 动植物细胞培养的动力学,5.1动植物培养的特点：,动植物细胞培养与微生物培养性能的对比,A.优点 1. 可以利用细胞融合技术，由融合动物细胞即杂交瘤细胞，生产任何一种结构完全相同的抗体即单克隆抗体。这也是广泛开展动物细胞培养研究的原因。 2. 明显地表达产物。,B缺点： 1.培养其组成复杂，价格昂贵，反应过程成本高，主要用于高附加值产物的生产。 2.生长速率慢，易被微生物污染。 3.代谢废物阻碍细胞生长。 4.承受机械冲击能力差（细胞个大无臂，对

38、环境敏感）。 5.设备放大是一新课题，不能完全按照微生物反应过程的经验。,C产品大致可分为4大类： 疫苗干扰素；单克隆抗体；遗传重组产品。,5.1.2植物细胞培养的特点： 1937年前后，法国和美国科字家分别成功地进行了胡萝卜和烟草的组织培养。 紫草悬浮培养物生产紫草宁、人参皂苷、花青素、长春花碱、黄连素、抗癌药物紫杉醇和烟草细胞的大量培养等,植物培养细胞具有如下特点：,细胞个大（10100/m）并且细胞壁是以纤维素为主要成分，耐拉不耐扭，因此，抗剪切能力低； 与动物细胞培养类同，生长速率慢，为防止培养过程中染菌，需加抗生素； 细胞培养需氧，而培养液黏度大，且不能强力通风搅拌； 产物在细胞内且

39、产量低； 培养的植物细胞常生长成各种大小的团块(从几个细胞到几百个细胞)，增加了悬浮培养的难度等。 植物细胞具有坚固的细胞壁，通常次级代谢产物不分泌到胞外，而包含在细胞内。因此，要得到大量次级代谢产物，就必须进行高密度培养。,5.2生长模型与培养条件,5.2.1 动植物细胞的生长模型 碳源与生长模型 烟草细胞分批培养 Monod方程 呼吸与生长模型 烟草细胞 胞内物质与生长模型 微生物培养中，把细胞内RNA含量作为描述其生长速率的指标。且随微生物比生长速率的增加，RNA含量增大。在植物细胞的培养中也有类似的报道。 吉田等在进行人参细胞培养中发现，在对数生长期，细胞的RNA含量显著增大。 RNA

40、=36+25,综上所述，动植物细胞生长动力学的研究，在很大程度上是借鉴于微生物反应动力学理论。,5.2.2动植物细胞的培养操作,A 植物细胞的培养操作 植物细胞所处状态为悬浮培养法与固定化植物细胞培养法 操作方式又分为分批式、反复分批式和连续式培养 B动物细胞培养的方法 非贴壁依赖性细胞的培养。来源于血液、淋巴组织的细胞，许多肿瘤细胞（包括杂交瘤细胞）和某些转化细胞属于这一类。 贴壁依赖性细胞的培养，大多数动物细胞，包括非淋巴组织的细胞和许多异倍体体系的细胞属于这一类型，,大规模动物细胞培养工艺流程,培养技术,动物细胞大规模培养与实验室培养相比，培养条件更严格，控制难度更大，其培养方法可概括为

41、： 悬浮培养 固定化培养 微载体（Microcarrier）培养法,细胞悬浮培养法,动物细胞在培养液中呈悬浮状态生长繁殖的培养方法谓之悬浮培养法。其培养方式有 批量法 半连续法 连续法 适用于培养确立细胞株、杂交瘤细胞、肿瘤细胞、血液细胞及淋巴组织细胞，用于大量生产疫苗、-干扰素、白介素等药品。 此法不适于包括二倍体细胞在内的正常组织细胞的培养。,细胞悬浮培养法的优点,可连续收集部分细胞进行移植继代培养，传代时无需消化分散，免遭酶类、EDTA及机械损害。 细胞收率高，并可连续测定细胞浓度，还有可能实现大规模直接克隆培养。,培养过程中，为确保细胞呈单颗粒均匀悬浮状态，需采用搅拌或气升式反应器，以

42、较低搅拌速度及一定速度通入含5CO2的无菌空气，保持细胞悬浮态并维持培养液溶解氧。 此外不同细胞悬浮条件亦异，为使细胞不致凝集、成团或沉淀，在配制培养基的基础盐溶液中不加钙和镁离子。间歇或连续更换部分培养液，可维持pH值，若使用HEPES缓冲盐溶液时尚可不必连续通入含5CO2空气。,悬浮培养的反应器,气升式反应器 笼式通气搅拌罐 中空纤维管 陶质矩形通道蜂窝状生物反应器,固定化培养法,动物细胞限制或定位于特定空间位置的培养技术谓之细胞固定化培养法。动物细胞几乎都可采用固定化方法培养。固定化方法有： 吸附法（所用载体有陶瓷颗粒、玻璃珠及硅胶颗粒 ） 包埋法 （将细胞包埋于琼脂、琼脂糖、胶原及血纤

43、维等海绵状基质中）,固定化培养优点,细胞可维持在较小体积培养液中生长； 细胞损伤程度低； 易于更换培养液； 细胞和培养液易于分离； 培养液中产物浓度高，简化了产品分离纯化操作。,固定化培养装置,多层平板装置 螺旋卷膜培养器 多层托盘式培养器 卷带式培养器 中空纤维及流化床式培养器,中空纤维培养器优点,细胞生长密度高，可达l08个毫升以上，细胞处于接近生理状态的理化梯度中； 营养物质可有效分布，代谢废物可及时排除； 细胞培养可达数月，易于实现连续培养； 细胞分泌的蛋白质浓度高。产品纯度可高达60一90；利于降低成本； 反应器体积小并可用于培养多种细胞。,微载体培养方法,将动物细胞吸附于微载体表面

44、，在培养液中进行悬浮培养，使细胞在微载体表面长成单层的培养方法称为微载体培养法或微珠培养法。 制备微载体的材料主要有： 葡聚糖（DEAESephadex A50及A25 ） 塑料 明胶 玻璃 纤维素,微载体 贴壁培养,对细胞无毒性； 比较好吸附特性条件改变可以脱吸； 轻微搅拌即可均匀悬浮（d1=1.03-1.10）； 比面积大；1g，50006000cm2； 显微镜下透明，便于观察。 材料：交联葡聚糖、纤维素、聚丙烯酰胺、明胶、硅橡胶等。,灌流培养系统,灌注培养是把细胞接种后进行培养，一方面连续往反应器中加入新鲜的培养基，同时又连续不断地取出等量的培养液，但是过程中不取出细胞，细胞仍留在反应器

45、内，使细胞处于一种营养不断的状态。 微小均质系统，如灌流悬浮细胞培养，微载体系统； 巨大均质系统，如把细胞包埋在微小球或凝胶中； 非均质系统，如边灌流边用过滤膜将细胞加以固定。,第6章 传递过程,本章的重点：双膜理论和动态 法测定kLa； 本章的难点：氧传递的传质 速率方程建立。,6.1 氧的传递过程 6.1.1氧的传递,意义 在发酵过程是一至关重要的问题，这是因为，不仅微生物对氧的摄取量甚多，氧对微生物的生长、生存十分重要。而且，氧在培养基中的溶解度又很低，因此必须重视。 特点 微生物不能直接在空气中摄取氧气，空气中的氧气，只有溶解于培养基中后方能被微生物摄取。,氧传递过程,从通入空气及至被

46、微生物摄取，其间氧的传递将经历这么三个过程： 氧气从空气气泡溶解入培养基中供养； 限速步骤 氧气由空气气泡附近传至细胞附近耗氧； 氧气被微生物摄取耗氧。 双膜模型、渗透扩散理论、表面更新理论。,氧传递示意图,6.1.2双膜模型,双膜模型的理论： (1)在气液两相之间，存在有界面，界面的两侧分别存在有气膜和液膜，被吸收的组分(如氧气)必须以分子扩散的方式从气相主体通过气膜和液膜而达液相主体； (2)在界面上，气液达到平衡，即CiHpi；，式中H为溶解度系数（亨利系数）。 (3)组分(氧气)从气相主体传递到液相主体，其全部阻力均集中于两层膜之中，因此，气相主体和液相主体之中不存在有浓度差。,稳态时

47、，总的传递阻力与串级的各步传递速率相等，则通过单位面积的传递速率 N氧的传递通量，mol/(m2s) Na 单位体积反应液中氧的传递速率，mol/(m3s) kLa 体积传质系数，1/s,6.1.3 kLa的测定方法,A.亚硫酸盐氧化法 2Na2SO3+O2 或 Cu 2Na2SO4 kLa=Na/ C* Na=kLaC* 特点： 优点：kLa值较高的生物反应器中的测定。 缺点：系统并非发酵液，而是化学反应液，因此缺乏发酵的真实性,B.葡萄糖氧化法,原理 Na =NaON(2 t VL)、 VL反应体积 kLa 值可下式求出 kLa= Na/ (C* C) 式中COL用氧电极测定。 特点：这种方法较亚硫酸执法更有实用价值，因为葡萄糖氧化酶为蛋白质，葡萄糖溶液