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1、第七章 细胞培养及次生代谢物的生产,植物细胞培养的应用主要包括以下3个方面: 1、植物次生代谢产物的生产； 2、植物体细胞无性系的快速繁殖和遗传突变体的筛选； 3、植物细胞遗传、生理、生化和病毒方面的基础研究。 植物细胞培养生产的化合物很多，包括糖类、酚类、脂类、蛋白质、核酸以及帖类和生物碱等初生和次生代谢产物。,第一节 单细胞培养 一、单细胞的分离方法 (一)机械法: 分离叶肉细胞是首先轻轻研碎叶片组织,然后过滤和离心净化细胞; 优点: 1 细胞不受酶的伤害; 2不需要质壁分离;有利于进行生理生化研究; 缺点: 细胞结构易受到伤害,获得完整的细胞数量低; 虽然此法分离的细胞能分裂并形成愈伤组
2、织,但仍不普遍适用;,(二)酶解法: 利用果胶酶，纤维素酶处理，分离出具有代谢活性的细胞。 不仅能降解中胶层，而且还能软化细胞壁，但在分离获得细胞的过程中，必须对细胞给予渗透压保护。,（三 ）从愈伤组织分离单细胞 首先通过组织培养的方法,诱导外植体产生愈伤组织。接着对愈伤组织反复继代以增加愈伤组织的松散性。同时还要利用不同的培养基可以使愈伤组织具有不同的生长速度,结构可松可紧-愈伤组织分散成单细胞或很小的细胞团。,将愈伤组织放在较高盐分,高生长素及高水解酪蛋白的培养基上培养,然后移入液体培养基并经过搅拌而分散为单细胞,也可加入一些果胶酶;但一般来说得到纯一的单细胞依然很少。 操作步骤:形成愈伤
3、组织选择未分化和易散碎的愈伤组织-转移到液体培养基中-振荡培养小细胞团或单细胞。,二、单细胞培养方法 单细胞培养方法有三种：看护培养法、平板培养法、微室培养法。 (一)看护培养-把单个细胞置于一块活跃生长的愈伤组织(看护组织)上培养,在愈伤组织与培养细胞间用一层滤纸相隔;看护愈伤组织的作用不仅给培养细胞提供营养成分，还提供能促进细胞分裂的物质，细胞分裂物质可通过滤纸而扩散。,应用看护培养法建立单细胞无性系,(二)平板培养 将含有游离细胞或细胞团的悬浮培养物过滤，除去组织块和大细胞团，将液体培养基加入0.61%的琼脂，融化，冷却到35C，再将培养基与悬浮液等量混合，迅速注入并使之铺展在培养皿(1
4、mm厚)。35C温度下,培养基保持液体状态，也不会杀死细胞。封口,25C温度,黑暗中培养。可以定期镜检观察细胞的生长情况。,用平板培养技术获得单细胞无性系的程序,(三)微室培养法 由悬浮培养物中取出一滴含单细胞的培养液,置于一张无菌载玻片上的微室中进行培养,可以对细胞培养过程连续进行显微观察,了解细胞经过生长,分裂,分化,形成细胞团的全部过程。,微室培养法示意图,三、 影响单细胞培养的因子 初始细胞密度（1）是影响单细胞培养成败的关键因子。单细胞培养接种密度必须达到临界细胞密度(103个细胞毫升以上，一般细胞密度在104105个细胞毫升）为宜，细胞密度过低，不利于细胞的增殖，而细胞密度过高形成
5、的细胞团混杂在一起，难于获得单细胞系。,培养基的成分（2）是影响单细胞培养的又一关键因子。初始细胞密度的减小，细胞对培养基的要求就越高，在培养基中添加如椰子汁、水解酪蛋白或酵母浸出液等，则可有效地取代影响细胞分裂的高密度细胞的群体效应。在培养低密度植板假挪威械细胞时，必须在基本培养基中加入一种细胞分裂素、赤霉酸和几种氨基酸，而这些添加物并不是该种植物愈伤组织培养所必须的。,第二节 细胞悬浮培养 细胞悬浮培养是指将游离的单细胞或小的细胞团（含少数细胞的分生细胞团或细胞聚集体）以一定的细胞密度接种到液体培养基中于摇床上进行悬浮培养。用于培养的细胞或小的细胞团来自愈伤组织，或某个器官或组织，通过物理
6、或化学的方法进行分离而获得。,细胞悬浮培养是一种有用的实验技术体系。一方面细胞可以不断增殖，形成高密度的细胞群体，适应于大规模培养，另一方面悬浮培养能够得到大量的均匀的细胞，可以用来分离原生质、筛选突变体、人工种子生产、生产次生代谢物质以及进行植物细胞代谢生理、生化特征等方面的研究，为深入研究细胞的生长、分化提供良好的条件。,一、悬浮细胞培养的方法 细胞悬浮培养可分为分批培养和连续培养 1.分批培养 是指将一定量的初始培养细胞或小细胞团分散在一定量的液体培养基中进行培养的方法。在培养过程中,除了气体和挥发性代谢产物可以与外界空气交换外,一切都是密闭的。 所用容器一般为100250ml三角瓶,每
7、瓶2075ml培养基; 为了使分批培养的细胞不断增殖,必须进行继代培养:取出培养瓶中一小部分(1/51/3)的悬浮液,转移到含相同成分的新鲜培养基中;,分批培养是植物细胞悬浮培养中常用的方法，培养体系容易建立，重复性好，常常用于突变体筛选和遗传转化体系建立等方面的研究。,2. 连续培养 利用特别的培养容器进行大规模细胞培养的一种培养方式;在连续培养的过程中,不断注入新鲜培养基,排出等体积的用过的培养基,培养液中的营养物质的到不断的补充,可调节注入与流出速度,故培养的细胞生长速率相对一致,形成一个稳定状态的培养。有封闭式和开放式2种。开放式连续培养又可分为化学恒定式和浊度恒定式。,连续培养是植物
8、细胞培养技术中的一项重要技术，由于连续培养过程中调节细胞增殖和生长的因子如培养温度、通气、搅拌速度、阳光、养分以及生长调节剂都可以调节和控制，因此连续培养不仅可用于植物次生产物的规模生产，也可用于对于植物细胞生长和代谢调节的研究。,二、悬浮细胞培养体系的建立 成功的悬浮细胞培养体系必须满足三个条件: 1、悬浮培养物分散性良好;细胞团较小。 2、均一性好,细胞形状和细胞团大小大致相同。 3、生长迅速，细胞分裂旺盛一般在2-3d其生长量就能增加一倍 。,1. 疏松愈伤组织的诱导 不同的培养基可以使愈伤组织具有不同的生长速度,结构可松可紧,利用这些特性可使之分散成为单细胞或很小的细胞团。诱导出松散易
9、碎的愈伤组织对后来建立悬浮细胞系可以起到事半功倍的效果。 也可以通过多次的继代筛选而获得。 一般条件下,以幼胚诱导愈伤组织为最好;某些情况下直接用幼胚,下胚轴,子叶等作为外植体进行悬浮培养也比较容易建立悬浮细胞系。,一般用颗粒细小、松散易碎、外观湿润、鲜艳的白色或淡黄色的愈伤组织比较松散易碎、经过几次筛选、继代至稳定后、可以用于悬浮细胞系; 基本培养基：N6, MS B5 激素：2,4-D 2mgL-1, 附加6-BA,NAA 0.5mgL-1, 附加有机物：水解酪蛋白,L-脯氨酸,谷氨酰胺等; 培养基中蔗糖浓度较低(1030gL-1),有利于形成松散的愈伤组织，蔗糖浓度较高有利于形成坚硬的愈
10、伤组织和胚状体。,通常情况下,松散易碎的愈伤组织不能直接由外植体诱导获得,而是在愈伤组织在继代过程中通过筛选获得的。 悬浮培养用的培养基可以使用愈伤组织培养基,但遇到悬浮细胞变褐,生长缓慢或停止时,要重新选择培养基，一般是: N6,MS,B5适合单子叶植物细胞的悬浮培养。 MS,B5,LS,SL等适合双子叶植物细胞的悬浮培养。,悬浮细胞培养基中需要加入水解酪蛋白,椰乳,脯氨酸等,并注意及时更换新鲜培养基,一般以间隔35天为适宜;培养基要求过滤除菌; 操作:2g松散易碎愈伤组织-2040ml液体培养基-摇床(120r/min,25C,黑暗或弱光),2. 细胞悬浮培养程序 取2g新鲜疏松易碎的愈伤
11、组织作为悬浮细胞培养的初始材料，接入盛有2040 毫升液体培养基的100毫升三角瓶中，于转速120 r/分钟，温度25C1C，黑暗或弱光条件下培养。细胞悬浮培养过程中，细胞或小细胞团的接种量，以120 r/分钟条件下细胞或小细胞团可在培养液中浮起为宜。,细胞悬浮培养与植株再生过程示意图,3. 悬浮细胞的继代与选择 悬浮细胞培养初期，可以看到原来许多较小的细胞团慢慢变大，同时又产生一些新的小细胞团。为了得到较均一的分散性好的悬浮细胞系，需要在每次继代时，都去掉培养液中大的愈伤组织块和细胞团，保留单细胞或小细胞团，这样反复继代培养，直至得到均一的悬浮细胞系为止。,悬浮细胞的继代与选择方法: 方法1
12、-将培养物摇匀，静止片刻，用吸管吸取培养基中部的培养物。 方法2-通过过滤收集到小细胞团进行继代培养。 另外，在更换培养基时，弃去底部的愈伤组织块和大细胞团，只保留小细胞团在瓶内，加入新鲜培养基。,4. 悬浮细胞的同步化 经过多次继代和筛选得到的悬浮细胞系均一性是相对的，需要进一步同步化培养，同步培养是指在培养体系中大多数细胞都能同时通过细胞周期的各个阶段。 衡量细胞同步化的参数： 在某一时刻处于细胞周期某一点上的细胞的百分数；在一个短暂的具体时间内通过细胞周期中某一点的细胞的百分数；全部细胞通过细胞周期中某一点所需的总时间占细胞周期时间长度的百分数。,实现悬浮培养细胞同步化的方法可分为物理方
13、法和化学方法两种。物理方法主要是通过对细胞物理特性（细胞或小细胞团的大小）或生长环境条件（光照、温度等）的控制以实现高度同步化，物理方法包括体积选择法和低温休克法。,化学方法是使细胞遭受某种营养饥饿，或是通过加人某种生长抑制剂阻断细胞分裂周期而停留于某一分裂相，从而达到细胞同步化的方法。 （1） 饥饿法 饥饿法的原理是除去细胞进行细胞分裂和生长所必需的营养成分或激素，使细胞停滞在细胞的分裂间期（G1期或G0期），经过一段时间的饥饿之后，重新补给除去的必须生长物质，诱导恢复静止细胞的同步分裂和生长。,（2）抑制法 通过使用DNA合成抑制剂如 5一氨基尿嘧啶、氟脱氧尿核苷（FUdR）、羟基脲和胸腺
14、嘧啶脱氧核苷等使培养细胞同步化。细胞受到这些抑制剂处理后，细胞周期被阻断在G1期，细胞都滞留在G1期和S期。去掉抑制剂后，细胞即进人同步分裂和生长。,5. 影响细胞悬浮的因素 （1） 培养材料 1、用于诱导愈伤组织的外植体类型和基因型以及用于悬浮培养的初始愈伤组织材料均对细胞悬浮体系的建立均有较大影响。2、外植体的类型及生理状况对愈伤组织的诱导十分关键。植物常用的外植体幼幼胚、成熟胚、下胚轴、子叶、叶片、幼穗和花药等。,（2）培养基的影响 植物细胞悬浮培养过程中，基本培养基组成、溶氧以及添加物等对细胞分裂和生长具有十分重要的作用。不同种类植物对营养物质的需求是不同的，悬浮细胞培养时，对基本培养
15、基的要求也有差异。培养基中的碳源、氮源、一些微量元素以及一些有机物质不仅影响细胞正常分裂和生长以，而且很多影响到细胞次生代谢产物的形成。,1、细胞悬浮培养所用基本培养基中大量元素的浓度对悬浮培养细胞存活率有较大影响。 2、低浓度的总氮有利于细胞的分裂，而高浓度的总氮则有利于细胞的生长。铵离子被用于合成谷酰胺，硝态氮诱导代谢途径中的多种酶基因的表达。 3、蔗糖是植物组织细胞培养中最常用的碳源和能源，研究表明，一定浓度的蔗糖不仅能够促进植物细胞的生长，还能够刺激次生物质的合成。,4、溶氧有一定的极限，过高或过低都会影响到细胞生长和产物合成，特别是在高密度培养时，供氧不足往往可能是限制产量的主要因素
16、之一。 5、植物生长调节物质对悬浮细胞生长有较大的影响，在细胞悬浮培养时，不同种类的激素对细胞的分裂和生长的作用不同。如生长素类，2，4-D有助于薄壁细胞的生长，因此，悬浮培养中，常适量加入2，4-D。,（3）培养条件的影响 植物细胞培养过程中，培养条件对细胞的生长以及目标次生代谢产物的合成具有很大的影响。温度、光照、电磁场及电磁辐射以及超声波等对于植物细胞培养都有很大的影响。在一定的温度条件下，培养的植物细胞才能正常生长、增殖和维持正常的新陈代谢，植物细胞生长的最适温度一般为25，不同的植物种类略有差异。,第三节 植物细胞的规模培养 利用植物细胞大规模培养技术为植物有用代谢产物的生产提供了有
17、效途径和生产方法。主要集中在制药工业中一些价格高、产量低、需求量大的化合物上如紫杉醇、长春碱、青蒿素等 。植物大规模细胞培养技术已在农业、医药、食品、化妆品、香料等领域广泛用于生产有价值的产品。人类迄今通过植物细胞培养获得的生物碱、维生素、色素、抗生素以及抗肿瘤药物不下50多个大类。,一、植物细胞大规模培养方法 植物细胞规模培养是大规模生产次生化合物的最有效的方法，其目的在于利用生物反应器为次生代谢产物的生产获得大量遗传稳定、同步分裂、增殖迅速并且能大量积累次生代谢产物的细胞，生物反应器是大规模细胞培养所用的为细胞生长和代谢提供适宜场所和环境的装置。,1植物细胞大规模悬浮培养 大规模悬浮细胞培
18、养的原理与细胞悬浮培养基本一致。用于大规模细胞培养的生物反应器有机械搅拌式反应器和非搅拌式反应器（又称气动式反应器）两大类。根据所用生物反应器的不同，将植物细胞大规模悬浮培养分为机械搅拌式植物细胞规模培养和气动式植物细胞规模培养。,（1） 机械搅拌式植物细胞规模培养 机械搅拌式植物细胞规模培养是利用搅拌式反应器大规模培养植物细胞的悬浮培养技术。搅拌式生物反应器常常用于微生物发酵，该反应器用于植物细胞规模培养时可借鉴微生物培养的成功经验对植物细胞培养过程进行控制。,机械搅拌式生物反应器只能用于对剪切力耐受能力较强的植物细胞系,（2）气动式植物细胞规模培养 针对利用机械搅拌式反应器进行植物细胞大规
19、模培养过程中剪切作用大突出问题，研究者研制了利用气流和气泡进行搅拌的气动式反应器，也称非机械搅拌式反应器。根据进入反应器的无菌空气的方式不同，气动式反应器又可分为气升式反应器和鼓泡式反应器。,利用悬浮培养系统进行植物细胞大规模培养的优点： 有利于培养细胞与培养基中的营养物质和气体充分接触； 培养体系中的温度、PH值、养分浓度等培养条件易于控制； 适于在连续密闭的系统中进行，减少了污染的概率。缺点是大的剪切力对植物细胞具有伤害作用。,2 固定化细胞培养 固定化细胞培养是指通过物理或化学方法将培养细胞固定于限定的空间区域内或表面，使之成为水不溶性，但细胞仍保持其生物活性的一种细胞培养技术。,固定化
20、植物细胞培养具有液体悬浮培养不具备的优点： 固定化细胞间接触紧密，生长缓慢，产生一定程度的分化，有利于次生代谢产物的积累； 细胞包埋在聚合物中，受到剪切力作用小，对培养细胞的损伤少； 固定化细胞容易回收，有利长期的连续培养； 培养条件易于控制，细胞稳定性好。 非分泌性的次生代谢产物的释放和固定化细胞内的氧养分传递问题成为固定化植物细胞培养进入工业化规模生产主要障碍。,（1） 植物细胞的固定方法 植物细胞的固定方法可分为包埋式固定和吸附式固定两大两类。 包埋式固定：是将细胞包埋在多空在体内部而制成固定化细胞的方法，根据所用包埋载体的不同又分凝胶包埋法和半透明膜包埋法。 吸附式固定：是将细胞吸附在
21、固体吸附剂表面而固定化细胞的方法。这种方法通常将细胞吸附在多孔陶瓷、多孔玻璃等材料的大孔隙或裂缝中，或吸附在中空纤维的外壁上。,（2） 固定化细胞培养反应器 固定化细胞培养反应器有流化床反应器、填充床反应器和膜反应器3类。 流化床反应器利用培养液和无菌空气流动的能量将固定化植物细胞悬浮在液体培养基中培养的方法。其优点是混合效果好；缺点是剪切力较大，放大培养困难。 膜反应器是将植物细胞固定在具有一定孔径和选择透性的膜上，营养物质通过膜渗透到细胞中，细胞产生的次生代谢产物通过膜释放到培养液中的培养方法。该方法的优点膜设备中流体流动与放大关系不大，减小了放大的困难；,填充床反应器是将固定化植物细胞置
22、于填充床反应器中堆叠在一起，静止不动，通过培养基的流动提供所需的养分和氧气，同时带出各种代谢产物的培养方法。该方法的优点是单位体积的细胞密度大，细胞能紧密接触，次生物质产量较高；缺点是混合效果差、传质效率低，培养条件不易控制。,二、高产细胞系的建立与保存 实现植物细胞规模化生产的首要条件是获得生长快、次生代谢产物合成能力强的高产细胞系。 1高产细胞系的建立 高产细胞系的筛选可以通过细胞表型差异和测定单细胞克隆的目的产物含量来进行筛选，高产细胞系的建立需要经过基因型选择、外植体选择、愈伤组织选择、培养条件优化、高产细胞系诱导与筛选等过程。 （1）基因型和外植体的选择 次生代谢产物高的外植体诱导出
23、的愈伤组织，其生产次生代谢产物的能力也高。,（2）愈伤组织选择 同一外植体诱导得到的愈伤组织的性状、质地、生长能力以及代谢均有差异，最初几代培养还可能发生体细胞无性系变异，合成次生代谢产物的能力并不稳定，经过多代的继代培养，根据需要选择目的产物的生产能力强的稳定遗传的愈伤组织细胞。,（3）高产细胞系诱导 利用化学或物理的方法诱导高产细胞系。物理诱导是采用X射线、y射线、射线、紫外线等辐射培养细胞，以获得目的产物的高产细胞系；化学诱导是采用秋水仙素、对-氟苯丙氨酸（PFP）、5-甲基色氨酸和生物素等化学诱变剂来处理培养细胞得到目的产物的高产细胞系；也可以用环境胁迫作为选择压来诱导对环境胁迫具有抗
24、性的细胞系。,（4）高产细胞系筛选 高产细胞系的筛选方法主要有： 目测法-从愈伤组织的形状、颜色和质地等外观形态特征来初步判断 ； 测定法-目的代谢产物含量 测定； 抗性筛选法-。,第四节 培养细胞的次生代谢及产物积累 一、植物细胞培养生产次生代谢产物的程序 目标植物的选择检测 2高产目标细胞系的选择 3建立高产细胞系的培养体系 4细胞规模培养,二、生产次生代谢产物的方法 前体物饲喂及生物转化 细胞固定体系 3两相法培养 4应用诱导子的生产次生代谢产物 5毛状根和冠瘿瘤的运用 6生物转化,第五节 培养细胞突变体筛选 体细胞无性系筛选具有以下优点： 变异，增殖速度快，为目的突变体的筛选提供广泛遗
25、传基础； 诱变数量大，诱变几率高，重复性和稳定性好； 因存在细胞质突变，从而有可能选择细胞质雄性不育系等新的变异。 在人工控制条件下离体定向选择，易于进行同位素示踪，半微量分析等实验。,一、目标细胞突变体的类型和筛选方法 1细胞突变体的筛选类型 次生代谢产物高产细胞突变体筛选； 抗性（抗病、抗虫等）病细胞突变体筛选； 抗逆境细胞突变体筛选； 抗除草剂细胞突变体筛选； 营养缺陷型细胞突变体筛选等。,2植物细胞突变体筛选方法 （）正选择法：正选择法是指把培养细胞置于某种选择剂中或选择条件下，使细胞突变体正常生长，而正常型细胞不能生存而死亡，从而达到分离细胞突变体目的一种选择方法。,（）负选择法：负
26、选择法是先控制培养基营养成分使正常型细胞生长，抑制突变细胞不分裂，然后用一种能毒害生长细胞而对不分裂的细胞无害的物质淘汰生长的正常细胞。常用于负选择的物质有亚砷酸盐和某些核苷酸类似物（如5-脱氧尿嘧啶）。负选择法通常适用于营养缺陷型细胞突变体的筛选。,（）绿岛法：绿岛法又称原位选择法，是在整体的植株水平上，用某种化学物质作用于植株叶片，使细胞发生突变，叶片局部呈现绿色斑点，切下这部分细胞进行组织培养，通过培养细胞的再分化，使抗性细胞分化成完整植株。在筛选某些病毒（如TMV和CAV病毒）的抗性变异细胞时，可以采用这种方法。,二、植物体细胞无性系突变体的获得 植物体细胞无性系突变体由自发无性系变和诱导无性系变异2种，它们在体细胞无性系变异育种上都有着重要意义。 1自发无性系变异 2诱导无性系变异 （1）物理诱变 （2）化学诱变,3体细胞无性系变异的检测和鉴定 对植物体细胞无性系变异的检测和鉴定，可以从形态学、细胞学、生物化学和分子物学等多个方面综合进行。从而使我们能在个体、器官、组织、细胞、蛋白质及DNA等不水平上全面了解和分析植物体细胞无性系变异的遗传机制及其稳定性。,