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1、第五章 DNA复制 Chapter 5 DNA Replication,生物体要生长、生殖就必需进行细胞分裂，分裂前须进行基因组DNA的复制。 DNA是由四种脱氧核糖核酸所组成的长链大分子，是遗传信息的携带者。 生物体的遗传信息就贮存在DNA的四种脱氧核糖核酸的排列顺序中。,DNA通过复制将遗传信息由亲代传递给子代；通过转录和翻译，将遗传信息传递给蛋白质分子，从而决定生物的表现型。DNA的复制、转录和翻译过程就构成了遗传学的中心法则。 在RNA病毒中，其遗传信息贮存在RNA分子中。因此，在这些生物体中，遗传信息的流向是RNA通过复制，将遗传信息由亲代传递给子代，通过反转录将遗传信息传递给DNA
2、，再由DNA通过转录和翻译传递给蛋白质，这种遗传信息的流向就称为反中心法则。,DNA dependent DNA polymeraseDDDP DNA dependent RNA polymeraseDDRP RNA dependent RNA polymeraseRDRP RNA dependent DNA polymeraseRDDP,第一节 DNA复制的一般特点,一、半保留复制 P121 DNA在复制时，以亲代DNA的每一股作模板，合成完全相同的两个双链子代DNA，每个子代DNA中都含有一股亲代DNA链，这种现象称为DNA的半保留复制(semi-conservative replicat
3、ion)。,DNA以半保留方式进行复制，是在1958年由M. Meselson 和 F. Stahl 所完成的实验所证明。该实验首先将大肠杆菌在含15N的培养基中培养约十五代，使其DNA中的碱基氮均转变为15N。将大肠杆菌移至只含14N的培养基中同步培养一代、二代、三代。分别提取DNA，作密度梯度离心，可得到下列结果： P124,二、有一定的复制起始点（区） P105 DNA在复制时，需在特定的位点起始，这是一些具有特定核苷酸排列顺序(富含AT)的片段，即复制起始点（OriC），可被多聚原点结合蛋白所识别。在原核生物中，复制起始点通常为一个，而在真核生物中则为多个，位于复制泡中心位置附近。,细
4、菌复制原点位于复制起始位点的240bp的DNA片断。9聚体和13聚体。 酵母ARS必需元件A(15bp)，11bp保守序列；B1、B2、B3三个小元件可提高ARS 的效率,三、需要引物 参与DNA复制的DNA聚合酶，必须以一段具有3端自由羟基（3-OH）的RNA作为引物(primer) ，才能开始聚合子代DNA链。 RNA引物的大小，在原核生物中通常为50100个核苷酸，而在真核生物中约为10个核苷酸。RNA引物的碱基顺序，与其模板DNA的碱基顺序相配对。,四、复制类型 双向复制 DNA复制时，以复制起始点为中心，向两个方向进行复制。 但在低等生物中，也可进行单向复制。 型复制：环状双链DNA
5、从复制原点解开成单链，两条母本链分别作模板各自合成互补的子链。形似字母,Replicating fork(复制叉)：The point where the two parental DNA strands separate to allow replication,滚环复制：X174（P131）双链环状DNA，其中一条链从复制起始点进行单链特异性切断，以另一链作模板，在其3-OH端聚合脱氧核糖核苷酸而延伸，5端固定在膜上，复制链剥离出来成为越来越长的尾巴。数倍于模板链的长度。,线粒体和叶绿体环状DNA的复制方式。在复制泡里以一条亲代链作模板合成一条新链，置换出另一条亲本链，这种由一条单链和一条
6、双链组成的三元泡状结构，称为置换环(displacement loop)或D环。,D环复制P132：,五、半不连续复制 由于DNA聚合酶只能以53方向聚合子代DNA链，即模板DNA链的方向必须为35。因此，分别以两条亲代DNA链作为模板聚合子代DNA链时的方式是不同的。,以35方向的亲代DNA链作模板的子代链在复制时基本上是连续进行的，其子代链的聚合方向为53，这一条链被称为先导链(leading strand)。而以53方向的亲代DNA链为模板的子代链在复制时则是不连续的，其链的聚合方向也是53，这条链被称为后随链(lagging strand)。,由于亲代DNA双链在复制时是逐步解开的，因
7、此，随从链的合成也是一段一段的。DNA在复制时，由后随链所形成的一些子代DNA短链称为冈崎片段(Okazaki fragment)。 冈崎片段的大小，在原核生物中约为10002000个核苷酸，而在真核生物中约为100个核苷酸。,第二节 DNA复制的条件,一、底物 以四种脱氧核糖核酸(deoxynucleotide triphosphate)为底物，即dATP，dGTP，dCTP，dTTP。 (dNMP)n+dNTP (dNMP)n+1+PPi,二、模板(template) DNA复制是模板依赖性的，必须要以亲代DNA链作为模板。亲代DNA的两股链解开后，可分别作为模板进行复制。,三、相关蛋白质
8、 P107-118,1. 解螺旋酶P116 DNA解链酶(DNA helicase):利用ATP的化学能使双链DNA母链在复制叉处分开成单链的一种酶。 每解开一对碱基，需消耗两分子ATP。 水解ATP时依赖于单链的存在(即双链DNA需有缺口或单链末端) DNA复制时,解链酶常结合在后随链上沿5-3方向移动;rep蛋白沿前导链3-5方向移动。,如：原核生物的Dna B蛋白,2. 单链DNA结合蛋白P115 单链DNA结合蛋白（single strand binding protein, SSB）。这是一些能够与单链DNA结合的蛋白质因子。有多种名称,如解旋蛋白、熔化蛋白、螺旋降稳蛋白等。注意原核
9、与真核生物SSB的区别 功能： 使解开双螺旋后的DNA单链能够稳定存在，即稳定单链DNA，便于以其为模板复制子代DNA； 保护单链DNA，避免核酸酶的降解。,拓扑异构酶:可使DNA双链中的一条链切断，松开双螺旋后再将DNA链连接起来，从而避免出现链的缠绕。不需ATP。P117 Type topoisomerase: A topoisomerase that introduces transient single-strand breaks into substrate DNAs. 催化三种拓扑转换反应：见右图,大肠杆菌拓朴异构酶的结构,改变DNA的超螺旋结构，不改变其化学组成或化学结构。通过两
10、个连续的转酯化反应断开和连接DNA主链的磷酸二酯键。,3. 拓扑异构酶(topoisomerase),拓扑异构酶,可切断DNA双链，使DNA的超螺旋松解后，再将其连接起来。 Type topoisomerase: A topoisomerase that introduces transient double -strand breaks into substrate DNAs. 由和两个亚基组成。 水解ATP时能使松驰态的环状DNA转变为负超螺旋，无ATP时可使超螺旋DNA变为松驰型。 常见识别序列：5-TAT GNTN NT- -ATA CNAN NA-5,4. 引物酶和引发前体蛋白 引物
11、酶（primase）：催化RNA引物合成。DnaG蛋白是E. Coli的引物酶。本质上是一种依赖DNA的RNA聚合酶（DDRP），识别DNA单链模板特异顺序，并聚合一段RNA短链引物(primer)，以提供自由的3-OH，使子代DNA链能够开始聚合。 引发前体蛋白:在原核生物中，引发前体至少由六种蛋白因子构成。蛋白i、n、n”、DnaC与引物预合成有关，蛋白n和DnaB与识别复制起始点有关，并具有ATPase活性。 由若干蛋白因子聚合而成的复合体称引发前体。引发体(primosome)由引发前体与引物酶（primase）组装而成。,5.DNA聚合酶 (DDDP),A. DNA聚合酶（能够在模板
12、链上合成新的DNA链的酶 ）的特点,以脱氧核苷三磷酸(dNTP)为前体催化合成DNA 需要模板和引物的存在 催化dNTP加到生长中的DNA链的3-OH末端 催化DNA合成的方向是53 需要RNA引物，不能起始合成新的DNA链,B、DNA聚合酶的种类P107-115,原核生物DNA聚合酶种类： 目前发现的DNA聚合酶有三种，分别命名为DNA聚合酶（pol），DNA聚合酶（pol ），DNA聚合酶（pol ），这三种酶都属于具有多种酶活性的多功能酶。 参与DNA复制的主要是pol 。,pol 为103Kd(109)的单一肽链大分子蛋白质,可被枯草杆菌蛋白酶水解为两个肽段，其中的大片段称为Kleno
13、w fragment 68(76)Kd ，具有53聚合酶活性和35核酸外切酶活性。 小片断35(34)Kd具有 53核酸外切酶活性,切口平移：在双链DNA磷酸二酯键被打断的地方，该酶可以延伸3-OH端。当新的DNA片段合成以后，它会取代原来双链中存在的同样的一段链。被取代的链被酶的从5-3的核酸外切作用分解。DNA的特性没有被改变，只是一段链被新合成的链取代以及切口的位置沿着双链移动。,DNApol ：,pol有聚合酶活性和5-3核酸内切酶活性,DNA聚合酶(DNApol),聚合作用:其最适模板是双链DNA且中间有缺口(gap)的单链DNA部份，且该单链缺口部份为50-200核苷酸。对于较长的
14、单链DNA模板区该酶的聚合活性很低。单链结合蛋白(SSBP)可以提高其聚合速率，可达原来的50-100倍。 具有35外切酶活性，无53外切酶活性 对作用底物的选择性较强，一般只能将2-脱氧核苷酸掺入到DNA链中。 在DNA的损伤修复（SOS）中起作用。,pol 由十种亚基组成，其中亚基具有53聚合DNA的酶活性，因而具有复制DNA的功能；而亚基具有35外切酶的活性，因而与DNA复制的校正功能有关。,Core,complex,Pol ,Pol *,DNApol ,原核生物E. Coli中的三种DNA聚合酶,真核生物DNA聚合酶,Probable Roles of Eukaryotic DNA P
15、olymerase Enzyme Probable role DNA polymerase Priming of replication of both strands DNA polymerase Elongation of both strands DNA polymerase DNA repair DNA polymerase DNA repair DNA polymerase Replication of mitochondrial DNA,DNA连接酶(DNA ligase)可催化两段DNA片段之间磷酸二酯键的形成，而使两段DNA连接起来。,6. DNA连接酶,DNA连接酶催化的条件
16、是： 需一段DNA片段具有3-OH，而另一段DNA片段具有5-Pi基； 未封闭的切口（非缺口）位于双链DNA中，即其中有一条链是完整的； 需要消耗能量，在原核生物中由NAD+供能，在真核生物中由ATP供能。,酶的活化：ATP（或NAD）与酶结合形成E-AMP。 E-AMP中间物内的AMP转移到DNA的5-P上，使之活化生成5-P-P-A和E。 活化的5-P与缺口内3-OH作用，形成5-P-3磷酸二酯键，释放AMP。,DNA连接酶作用步骤,第三节 DNA生物合成过程,（一）、复制的起始 DNA复制的起始阶段，由下列两步构成。 预引发和引发 概念:合成RNA引物称为DNA复制的引发,一、原核生物的
17、DNA复制,1、预引发,A解旋解链，形成复制叉 由拓扑异构酶和解链酶作用，使DNA的超螺旋及双螺旋结构解开，碱基间氢键断裂，形成两条单链DNA。单链DNA结合蛋白（SSB）结合在两条单链DNA上，形成复制叉。,B引发体组装 由起始蛋白因子（如E.coli的dnaA等）识别复制起始点（富含AT碱基），并与其他蛋白因子（如解链酶dnaB和dnaC等）以及RNA引物酶（dnaG）一起组装形成引发体。,2、引发 在引物酶的催化下，以DNA为模板，合成一段短的RNA片段，从而获得3端自由羟基（3-OH）（引物）。第一个核苷酸装配到引物上。,（二）、复制的延长,1、聚合子代DNA： 由DNA聚合酶催化，以
18、3 5方向的亲代DNA链为模板，从5 3方向聚合子代DNA链（前导链）。后随链的延伸需重复合成RNA引物，pol 合成DNA短链。,延伸过程的5个阶段： 双链DNA不断解旋；前导链的合成；后随链模板不断合成新的RNA引物；DNA聚合酶从RNA引物合成后随链（冈崎片断）；除去RNA引物、连接冈崎片断。,2、引发体移动： 引发体向前移动，解开新的局部双螺旋，形成新的复制叉，随从链重新合成RNA引物，继续进行链的延长。,复制体（Replisome）: DNA聚合酶 全酶、引发体、其它复制蛋白和螺旋构成的复合体。,回环模型：DNA双螺旋是同时进行复制的，在复制叉处后随链模板形成一个环，以适应双链同时进
19、行复制的需要。,（三）、复制 的终止,E.coli复制叉汇合点两侧有100kb的终止区terD、A、C、B； 终止位点有约23bp的保守序列，与Tus(terminator utilization substances)蛋白结合阻止复制叉前进；,DNA复制终止后的事件,1、去除引物，填补缺口 在原核生物中，由DNA聚合酶来水解去除RNA引物，并由该酶催化延长引物缺口处的DNA，直到剩下最后一个磷酸二酯键的缺口。而在真核生物中，RNA引物的去除，由一种特殊的核酸酶来水解，而冈崎片段仍由DNA聚合酶来延长。,2、连接冈崎片段 在DNA连接酶的催化下，形成最后一个磷酸酯键，将冈崎片段连接起来，形成完
20、整的DNA长链。,二、真核生物DNA合成,A Tag或T抗原(病毒编码):解旋酶活性,B RPA(replicatin protein A,宿主编码),需ATP,结合于解开的单链上,相当于原核生物的SSB,C 合成前导链(pol的延伸活性被RFC replication factor C激活),D PCNA(proliferation cell nuclear antigen)结合于3端,取代pol,中断前导链的合成; pol与PCNA结合使前导链连续延长不中断. 解离下来的pol再结合到增长链的3末端.,E 后随链的合成: pol和RFC结合在后随链模板上.,真核生物的端粒,端粒（telom
21、ere）是指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构部分，通常膨大成粒状,由DNA序列和蛋白质形成的一种复合体 。其共同的结构特征是由一些富含G的短串联重复序列构成，可重复数十次至数百次。,线性DNA在复制完成后，其末端由于引物RNA的水解而可能出现缩短。故需要在端粒酶（telomerase）的催化下，进行延长反应。 端粒酶是一种RNA-蛋白质复合体，它可以自身携带的富含G的RNA为模板，通过逆转录过程合成端粒区重复序列，从而对末端DNA链进行延长。,端粒酶(telomerase)的作用机制,三、DNA复制的保真性 为了保证遗传的稳定，DNA的复制必须具有高保真性。DNA复制时的保真性主要与下列因素有关： 1遵守严格的碱基配对规律； 2DNA聚合酶在复制时对碱基的正确选择和对底物的识别作用； 33-5外切活性的校正阅读； 4DNA合成起始时都有RNA引物；,DNA复制小结(1),DNA复制小结(2),本章复习题,名词解释： 复制叉、型复制、滚环复制、D环复制、引发体、复制体、冈崎片断、前导链、后随链、拓朴异构酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、核心酶、端粒酶。 问答题： 简述DNA复制的特点。 参与原核生物和真核生物DNA复制的酶有哪些？各有什么作用。 简述原核生物DNA复制过程。 叙述证明DNA复制是半保留复制的Meselson-Stahl的实验。 简述DNA复制保真性的原因。,