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1、第四模块 色谱检测技术,第二节 液相色谱法,第七章 色谱分析法,知识目标： 理解高效液相色谱法的含义及特点；掌握常用术语；理解高效液相色谱仪的结构组成；掌握高效液相色谱法的主要应用。 技能目标： 能使用高效液相色谱仪对药物进行分析。,学习目标,复习提问,2.气相色谱法定性 和定量依据。,1.写出气相色谱 法流程。,),新课大纲,本章主要内容 一、概述及基本原理 二、色谱条件检测器 三、定性和定量方法 四、在药物分析中的应用,一、概述及基本原理,是用高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，经进样阀注入供试品，由流动相带入柱内，在柱内各成分被分
2、离后，依次进入检测器，色谱信号由记录仪或积分仪记录。,1.高效液相色谱法流程,与经典液相色谱法一致。 1.按固定相的聚集状态不同分为: 液-固色谱法和液-液色谱法。 2.按分离原理不同分为: 吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱和凝胶色谱法四类。,2.高效液相色谱法的分类,不但具有高效、高速、高灵敏度的特点 还由于它的流动相（载液）种类比气相色谱的流动相（载气）多，因此可选用两种或多种不同比例的液体作流动相，可提高选择性。 此外，液相色谱的馏分比气相色谱易于收集。便于为红外、核磁等方法确定化合物结构提供纯样品。,3.高效液相色谱与气相相比：,但是，高效液相色谱的固定相的分离效率、检测器的检测范围以
3、及灵敏度等方面，目前还不如气相色谱法。 此外对于气体和易挥发物质的分析方面也远不如气相色谱法，因此高效液相色谱法和气相色谱法配合使用可互相取长补短，相辅相成。,黄芩苷：保留时间12.048min,双黄连,色谱图及保留值,大黄酸标准品HPLC色谱图,常通口服液HPLC色谱图,分离度： 1）色谱分离的根本目的是使样品中各组分相互分离 2）用分离度定量表示相邻两峰的分离程度，也称分辨率。 3）越大表示分离越好,液固色谱固定相： 硅胶 无定形：YWG 球形：YQG 堆积硅珠：YQG 高分子多孔小球：YSG,固定相与流动相,非极性：十八烷基 ODS(C18) 国产品： YWG- C18 H37 YQG
4、- C18 H37 进口品：Partisil 5-ODS（无定形） 极性：氨基、氰基 国产品： YWG- CN YQG -NH2 进口品：Zorbax-CN(球形）,化学键合相：硅氧烷型,1.不与固定相发生化学反应 2.对样品有适宜的溶解度：太小不易分离、太大易产生沉淀 3.必须与检测器相适应，如紫外，检测波长大于截止波长（当吸光度A=1) 4.粘度小 5.洗脱方式：恒组成溶剂洗脱、梯度洗脱,流动相的基本要求：,二、仪器构造,高效液相色谱仪主要有进样系统、输液系统、分离系统、检测系统和数据处理系统五部分构成。,进样系统,输液系统,分离系统,检测系统,数据处理系统,一般采用隔膜注射进样器或高压进
5、样瞬间完成进样操作， 进样量是恒定的。这对提高分析样品的重复性是有益的。,进样系统,该系统包括高压泵、流动相贮存器和梯度仪三部分。,输液系统,该系统包括色谱柱、连接管和恒温器等。,分离系统,高效液相色谱常用的检测器有紫外检测器、示差折光检测器和荧光检测器三种。,检测系统,该系统可对测试数据进行采集、贮存、显示、打印和处理等操作，使样品的分离、制备或鉴定工作能正确开展。,数据处理系统,输液泵及梯度泵 恒流：螺旋 往复泵 隔膜 柱塞（用的最多） 恒压： 梯度泵：用于改变溶剂的组成 分高压及低压梯度兩种方式,2.主要部件,思考：为什么用高压泵？,因为填料颗粒小，具有高的柱效，但会引起高阻力，因此用高
6、压输送流动相。,进样器 六通阀进样器是高效液相色谱系统中最理想的进样器。,自动进样器， 是具有极高重复性和精度的样品进样系统。样品数最多可达384个（2个样品槽合计）， 样品架上可有84个样品瓶， 或者50个2ml的样品瓶。,色谱柱： 由柱管（不锈钢） 和固定相（化学键合相：药物分析中90%用反相键合相，如C18)组成,智能型HPLC柱箱，温度范围为室温以上10-80，控温精度为 0.1， 可放置40CM长的色谱柱。,（1）紫外检测器 该检测器适用于对紫外光（或可见光）有吸收性能样品的检测。其特点：使用面广（如蛋白质、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用）；灵敏度高（检测下限为1-10g
7、ml）；线性范围宽；对温度和流速变化不敏感；可检测梯度溶液洗脱的样品。,检测器：,（2）示差折光检测器 凡具有与流动相折光率不同的样品组分，均可使用示差折光检测器检测。目前，糖类化合物的检测大多使用此检测系统。这一系统通用性强、操作简单，但灵敏度低（检测下限为10-7gml），流动相的变化会引起折光率的变化，因此，它既不适用于痕量分析，也不适用于梯度洗脱样品的检测。,（3）荧光检测器 凡具有荧光的物质，在一定条件下，其发射光的荧光强度与物质的浓度成正比。因此，这一检测器只适用于具有荧光的有机化合物（如多环芳烃、氨基酸、胺类、维生素和某些蛋白质等）的测定，其灵敏度很高（检测下限为10-1210-
8、14gml），痕量分析和梯度洗脱作品的检测均可采用。,（4）. Model 6000二级管阵列紫外检测器,三、定性和定量方法,定性参数：保留时间。 定量参数：峰高或峰面积。,1.外标法：一系列浓度不同的标准品，准确进样，得色谱图，用峰面积或峰高与浓度绘制校准曲线，由其回归方程计算样品的浓度。（样品溶液的浓度用样品峰与标准品峰的直接面积比计算。） 样品浓度样品峰面积 标准品浓度 标准品峰面积,含量测定：,要求： 1）精密度与进样量有关，进样量重复性好能得到好的精密度 2）严格控制实验条件，仪器稳定，如流速、温度,1）内标物的要求：在样品中不存在、与样品完全分离、与待测物保留时间接近、与待测物峰大
9、小相近、不与待测物中各组分发生化学反应、很纯且贮在职 稳定。 2）面积比样品峰面积 内标峰面积 样品浓度样品面积比 标准品浓度 标准面积比,2.内标法：,已知量的纯物质作内标物，加至准确称量样品和标准品中进行测定。,3）优点：只要被测组分及内标物出峰就可定量、与进样量的重复性无关、适于微量成分及杂质。 缺点：样品配制麻烦及内标物不易寻找。 4）实例：复方乙酰水扬酸片的测定,测杂质时常采用此法） 1)先用纯品测校正因子，因检测器对各组分灵敏度不同，使相同质量的不同组分得到的峰面积不同，因此需用校正因子。 2)要求所有组分必须流出并能检测，计算待测组分占总峰面积的比值。 Ci%= Aifi .10
10、0% Aifi,3.峰面积归一化法：,（一）在药典中应用的情况 1.鉴别： 以供试品与对照品的保留时间一致进行鉴别。如头孢、林可、可的松 2.检查： 用于检查有关物质、分解产物，如乙烯雌酚：1ml含0.5mg和1ml含0.01mg，记录至主成分保留时间的2倍，溶液1显示的杂质峰数不得超过4个，各杂质的峰面积及其总和分别不得大于溶液2主峰面积的1/2和1/3。 3.含量测定：列出色谱条件、系统适用性试验,四、在药物分析中的应用,（二）在制剂的测定和稳定性的研究,3.糖浆剂：泼尼松,2.注射剂的测定：林可霉素,1.片剂的测定：复方甘草片,4.软膏剂：氟氢松,5.其他：布洛芬缓释胶囊、栓、乳膏,(三
11、)在中草药分析中的应用 测定前先提取分离有效成分，再测定 1.提取净化方法：溶剂提取、超声、固相萃取柱（加压使样品进入柱再水、甲醇洗，收集醇 液进样） 2.测定药物：如复方甘草冲剂中的甘草酸和绿原酸 (四)体内药物分析 血中、尿、胆汁、乳汁、脏器,(五)在兽药方面的应用：,1.牛奶中抗生素残留及其检测方法研究进展,2.畜禽肉中土霉素、金霉素、四环素残留检查,3.水中氯霉素残留,5.药物制剂中的含量及杂质限量的检查,4.饲料中抗生素含量,本课小结,课后习题,1. 液相色谱法流程。,3.什么是色谱图？什么是保留时间？,2.液相色谱法定性和定量依据。,4.液相色谱定性、定量方法主要有哪几种？,Thank you!,