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1、高效液相色谱仪 （High Performance Liquid Chromatograph）,一.工作原理,储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进 入流动相，被流动相载入色谱柱（固定相) 内，由于样品溶液中 的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动时， 经过反复多次的吸附-解吸的分配过程，各组分在移动速度上产 生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器 时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式打 印出来。,二.特点,1.速度快：通常分析一个样品在1530 min，有些样品甚至 在5 min内即可完成。 2.分辨率高：可选择固定相和流动相
2、以达到最佳分离效果。 3.灵敏度高：紫外检测器可达纳克级，荧光和电化学检测器 可达皮克级。 4.色谱柱可反复使用：用一根色谱柱可分离不同的化合物。 5.样品量少，容易回收：样品经过色谱柱后不被破坏，可以 收集单一组分或做制备。,三.仪器组成,储液器 输液泵 进样器 色谱柱 检测器 操作软件,1.储液器 盛放流动相，材质一般为玻璃，也有不锈钢或特种塑料材质，容积大小 不等，以500-2000ml比较常见。,2.输液泵 2.1 基本要求：提供5-50Mpa的柱前液压；输出无脉动恒定的液流；流速范围0.1-10ml/min；流量精密度RSD 0.5%或更好；系统组件耐腐蚀，耐高压，没有爆炸危险。 2
3、.2 组成模式 （1）等度模式 输液泵输出的液体流速不变。 （2）梯度模式 输液泵输出的液体流速随时间改变，又分为低压梯度 和高压梯度。低压梯度用一个输液泵加一个电磁阀 （比例阀）即可实现，成本较低，流动相混合比例误差 相对大；高压梯度每一路流动相都需要一个单独的输 液泵，成本较高，流动相混合比例更准确。,3.进样器 3.1 手动进样器 Rheodyne 7725i型 世界各大色谱制造商均选用此品牌，进样次数 可达30000次 3.2 手动进样针 针头为平头，容积以10或20ul最常见 品牌：瑞士hamilton，国产上海高鸽等,3.3 自动进样器,全自动进样，提高进样过程的稳定性，降低劳动强
4、度，可满足几十个甚至上百个样品的进样需求。有些自动进样器带有控温功能，适合热敏性样品。,4.色谱柱 4.1 分类： 反相色谱柱：C18色谱柱，C8色谱柱，C4色谱柱等，固定相极性小于流 动相，流动相成分包括水，甲醇，乙腈等。 正相色谱柱：氨基柱，氰基柱，硅胶柱等，固定相极性大于流动相，流 动相成分包括苯，己烷，庚烷等。 4.2 品牌：安捷伦，沃特斯，Merck，岛津，GL Sciences，资生堂， 菲罗门，依利特，迪马等,5.检测器 5.1 紫外吸收检测器（UVD）：是目前HPLC中应用最广泛的检测器。它的主要特点是灵敏度高（10-9g），线性范围宽（105），对流速和温度变化不敏感，可用于
5、梯度洗脱。它要求被检测样品组分有紫外吸收，属于选择性检测器。 5.2 二极管阵列检测器（PDAD）：是20世纪80年代才出现的一种光学多通道检测器，它可以看作是UVD的一个分支。在对每个洗脱组分进行光谱扫描，经计算机处理后，得到光谱和色谱结合的三维图谱。其中吸收光谱用于定性（确证是否是单一纯物质），色谱用于定量，常用于复杂样品（如生物样品、中草药）的定性定量分析。 5.3 荧光检测器（FLD）：同样属于选择性检测器，其灵敏度在目前常用的HPLC检测器中是最高的，应用也较多，仅次于UVD。它适用于能激发荧光的化合物。很多与生命科学有关的物质，如氨基酸、胺类、维生素、甾族化合物及某些代谢药物都可以
6、用荧光法检测。荧光检测器在生物样品痕量分析中很有用，尤其在用荧光衍生后，可以检测很微量的氨基酸和肽。,5.4 示差折光检测器（RID）：是一种通用型检测器，只要被测组分与洗脱液的折光指数有差别就可使用。生命科学中常遇到各类糖类化合物，没有紫外吸收，一般常用示差折光检测器。它的通用性比UVD广，但灵敏度要低，对温度变化敏感，并与梯度洗脱不相容，因而限制了它的使用。 5.5 蒸发光散射检测器（ELSD）：也是一种通用型的检测器，可检测挥发性低于流动相的任何样品，而不需要样品含有发色基团。ELSD的响应值与样品的质量成正比，因而能用于测定样品的纯度或者检测未知物。ELSD灵敏度比RID高，对温度变化
7、不敏感，基线稳定，可用于梯度洗脱。现在ELSD已被广泛应用于碳水化合物、类脂、脂肪酸和氨基酸、药物以及聚合物等的检测。 5.6 电化学检测器(ED) ：电化学检测器主要有安培、极谱、库仑、电位、电导等检测器，属选择性检测器，可检测具有电活性的化合物。目前它已在各种无机和有机阴阳离子、生物组织和体液的代谢物、食品添加剂、环境污染物、生化制品、农药及医药等的测定中获得了广泛的应用。其中，电导检测器在离子色谱中应用最多。,5.7 质谱检测器（MSD）：是另一种通用型检测器，在灵敏度、选择性、通用性及化合物的分子量和结构信息的提供等方面都有突出的优点。但它的昂贵操作费用和复杂性限制了它的推广应用。,6
8、.其他部件 6.1 在线脱气机 用于除去流动相中溶解的微量气体，对于保证高效液相色谱数据的准确性，防止仪器工作中的一些故障是很有必要的。 6.2 柱温箱 用于保持色谱柱工作温度的稳定性，有利于保证高效液相色谱数据的准确性和重现性。,7.操作软件 安装在电脑上，基本作用为记录和处理数据。品牌液相色谱仪一般带有自己专用的操作软件，除了记录处理数据之外还可以控制输液泵和检测器，实现梯度洗脱功能。,某些品牌液相输液泵对比,某些品牌液相UV检测器对比,四.UPLC（UHPLC）,UPLC，又名UHPLC，即超高效液相色谱，沃特世公司首先提出概念并生产出世界上第一台UPLC，是目前分离科技中效能最高的仪器。其特点如下： 1.超高分离度 UPLC系统运用的固定相粒度能达到1.7m，该系统达到的效能将比5m粒度系统高70%，而比3.5m高40%。 2.超高分离速度 运用1.7m的颗粒，相对于5m颗粒，在不影响柱效的情况下，柱长将可以立方级的减少，而且可以在3倍的流速下运行，相同的解析度情况下，分离速度提高了9倍。 3. 超高灵敏度 由于UPLC运用了更短的柱子（柱长L更小），进一步增加了峰高。因此，在提高柱效的同时，运用1.7m的UPLC系统比5m和3.5m的系统灵敏度分别提高了70%和40%，而在柱效下相同情况下，能分别提供3倍和2倍的灵敏度。,五.配置,