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1、细胞器的分级分离,高等植物叶绿体制备 动物细胞线粒体的分离,实 验 目 的,学习分离细胞器的一般原理及方法,实验原理,细胞内不同细胞器的比重和大小都不相同，在均匀密度介质中不同离心力下沉降的细胞器组成不同或在梯度介质中离心后分布于不同密度层，根据这一原理，差速离心法或密度梯度离心法就可将细胞内各种组分分离出来。 分离流程： 破碎组织（匀浆或研磨）差速离心或密度梯度离心分离细胞器结果检验分析,匀浆（Homogenization）,低温条件下，将组织放在匀浆器中，加入等渗匀浆介质(即0.25molL蔗糖一0.003molL氯化钙)进行破碎细胞使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆。,各种匀浆、研磨器,
2、差速离心分级分离(Fractionation),由低速到高速离心逐渐沉降细胞器。 先用低速使较大的颗粒沉淀，再用较高的转速将上清液中的小颗粒沉淀下来。,Differential centrifugation,High speed,Low speed,密度梯度离心（density gradient centrifugation method ）,亦称平衡密度梯度离心法。 用超速离心机对小分子物质溶液，长时间加一个离心力场达到沉降平衡，在沉降池内从液面到底部出现一定的密度梯度。 若在该溶液里加入少量大分子溶液，则溶液内比溶剂密度大的部分就产生大分子沉降，比溶剂密度小的部分就会上浮，最后在重力和浮力
3、平衡的位置，集聚形成大分子带状物。,Velocity (A) and Equilibrium (B) sedimentation,分析,分级分离得到的组分，可用细胞化学和生化方法进行形态和功能鉴定。,（一）实 验材料,多叶绿菜,实 验试剂,0.4M蔗糖 0.35M氯化钠（每升19.856g氯化钠）,实 验用品,1、普通台式离心机：4台 2、研钵：30个 3、40ml小烧杯:30个 4、纱布：5包 5、离心管60支 6、载玻片及盖玻片见指导。,一、叶绿体的分离,细胞中及匀浆中的叶绿体,叶绿体的分离步骤,1、采样、洗涤、去叶脉：最好在晴天上午10时左右选取生长正常的菠菜叶子（菜心、白菜、豌豆也可）
4、洗干净，用吸水纸擦干，去柄及粗脉 2、预冷：放入4冰箱预冷1h； 3、研磨匀浆：称2克叶子在玻璃研钵中剪碎，先加12m1制备液，快速磨成匀浆，然后再加8m1制备液，磨匀； 4、过滤：把匀浆液倒在6层沙布上过滤入小烧杯；,5、离心去完整细胞、细胞核等：上述滤液转入10ml离心管，平衡后在约500rpm（每分钟的转速）离心2分钟，上清转入另一离心管； 6、离心收集叶绿体：上清液在2600rpm离心5分钟，弃上清液，沉淀即是叶绿体。 7、悬浮叶绿体：沉淀中加入制备液适量，用吸管吹打悬浮、混匀： 8、镜检分离效果 9、叶绿体被膜完整度的测定 ：铁氰化钾光还原的Hill反应,叶绿体的分离应该注意哪些问题？,1、选材 2、低温 3、缓冲系统：渗透压、PH、防氧化 4、研磨程度 5、离心速度,