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1、微生物学实验,生命科学实验教学中心510室,实验三 革兰氏染色,实验目的,2. 掌握细菌涂片和革兰氏染色基本程序。,1. 理解革兰氏染色的原理。,革兰氏细菌的细胞壁结构,实验原理,革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的。,在染色过程中，当用乙醇处理时，肽聚糖脱水而孔障缩小，通 透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色， 因此，呈现蓝紫色，用G+表示。,实验原理,革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而易被乙醇溶 解的类脂质含量高。,当用乙醇处理时，类脂质溶解，细胞壁的通透性增加，使 结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复 染液的颜色，因此呈现红色，用
2、G-表示。,实验步骤,一、细菌涂片的制作,取干净载玻片一块，在载玻片的左、右各加一滴单蒸水， 按无菌操作法取菌涂片，做成浓菌液。,2. 再取干净载玻片一块将刚制成的浓菌液挑2-3环涂在玻片 两边制成薄的涂面，注意取菌不要太多。,3. 将玻片反复在酒精灯上方通过几次（用手指触摸涂片反 面，以不烫手为宜），对标本进行干燥、固定（也可自然干燥）。,待涂片冷却后，再加染色液。,涂片制作,1. 初染：在涂片上加结晶紫（以盖满细菌涂面为宜），染色 约1分钟后水洗。,2. 媒染：滴加Lugol碘液染色1分钟，水洗。,3. 脱色：把玻片上的水吸净，用95%酒精滴洗玻片，直到滴出 的酒精刚好不出现紫色，大约20
3、秒钟，立即用水洗。,4.复染：滴加稀释石炭酸复红染液染色1-2分钟，水洗后涂片用吸水纸吸干或者放空气中晾干。,二、革兰氏染色,(1)先用低倍镜观察，再用高倍镜观察，找出适当的视野。 (2)将高倍镜转出，然后在涂片上加香柏油一滴。 (3)将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的颜色和形态。,三、涂片观察,油镜工作原理,四 实验完毕后的处理：,1.将浸过油的镜头按照下述方法擦拭干净：,a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。,b.用擦镜纸沾少许二甲苯（）将镜头擦2-3次。,c.再用干净的擦镜纸将镜头擦2-3次。,注意擦镜头时向一个方向擦拭。,2.镜检后的染色玻片用纸将香柏油擦干净。,1.涂片后要注意固定、干
4、燥，以免标本被冲洗掉。,注意事项,2.革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。 如果脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌。 如果脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。 脱色时间的长短受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响， 难以严格界定。,4. 选用幼龄的细菌。选用培养16h-24h菌龄的细菌为宜。若菌龄 太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。,3. 染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的 残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。,实验结果,实验思考,1. 为什么革兰氏染色后细菌会分出两种颜色？,2. 革兰氏染色最关键的是哪一步，此时阳性菌和阴性菌各应该 是哪种颜色，不经过复染这一步能不能区别革兰氏阳性菌和阴性菌？,3. 固定的目的之一是杀死细菌，这与用自然死亡的菌体进行染色有什么不同?,