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1、实验九 动物细胞内微丝结构的观察 （鬼笔环肽标记法）,实验目的,1. 了解鬼笔环肽标记微丝结构的原理。 2 观察微丝束（应力纤维）在动物细胞内的分布。 3 学习细胞固定，穿透，染色等技术。 4 巩固荧光显微镜的使用技术。,实验原理,Actin-Tracker Green是一种Actin绿色荧光探针，可以用于培养细胞或组织切片的Actin特异性荧光染色。 Actin-Tracker Green探针为荧光染料FITC标记的毒蕈肽(phalloidin)，即phalloidin-FITC，其分子量约为1251.4，最大激发波长为496nm，最大发射波长为516nm。 可以用于细胞或组织内的微丝(mi
2、crofilament)的荧光检测。 使用时的推荐稀释比例为1:200。如果每个片子需要使用200l染色工作液，每个包装的本产品足够用于200个片子 的染色。,主要仪器与溶液,主要仪器 荧光显微镜、移液器（1000ul 和100ul) 材料：细胞爬片，两人一孔。 溶液 PBS配制的3.7%甲醛溶液。 0.1% Triton X-100的PBS洗涤液 含有5%BSA和0.1% Triton X-100的PBS按照1:200的比例稀释Actin-Tracker Green,实验步骤,a 用PBS洗涤细胞或组织切片2次。每次0.4ml. b.弃去洗涤液，用PBS配制的3.7%甲醛溶液室温固定细胞或组
3、织切片约10分钟。注意：甲醇可以破坏actin蛋白，因此不能使用含有甲醇的固定液。并且尽量使用不含甲醇的甲醛。每孔0.2 ml. c.弃去固定液，用含0.1% Triton X-100的PBS洗涤2-4次，每次约5分钟。每次0.2 ml. d 弃去洗涤液，把Actin-tracker Green染色工作液按照每个片子约100l的比例滴加到片子上，室温避光孵育30分钟。,实验步骤,e. 用含0.1% Triton X-100的PBS洗2-4次，每次约5分钟。每次200ul。 f. 在载玻片上加一滴PBS, 反扣盖玻片（生长有细胞的一面朝下），随后可以用荧光显微镜进行观察。 为长期保存，可以在片子自然干燥后封片并于4避光保存，保存时间可长达6个月左右。,实验结果,荧光显微镜 激光共聚焦显微镜 显示的细胞中的微丝分布,作业,1 为什么不能使用细胞松弛素B标记微丝结构？ 2 Triton-x 100溶液处理细胞的作用是什么？ 3 本实验中能使用甲醇固定细胞吗？为什么？ 4 动物细胞内重组表达的GFP-Actin 融合蛋白也能装配成微丝，试设计实验观察GFP-Actin装配形成的微丝结构，拟出实验的标题，原理、目的和实验的步骤。,