一种快速提取棉花干种子基因组DNA的新方法.pdf

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1、棉 花 学 报Cotton Science2014袁26渊1冤院8794 一种快速提取棉花干种子基因组 DNA 的新方法 郎需勇袁刘伟霞袁杨亮袁周文华袁吴建功袁别传述 * 渊湖北惠民农业科技有限公司袁湖北 武汉 430070冤 摘要院利用 SSR(Simple sequence repeats)分子标记技术袁能够快速有效地进行杂交棉纯度鉴定遥 为了攻克 SSR 分子标记技术中存在的技术难关袁 本文专门对棉花干种子胚的基因组 DNA 提取方法进行了研究遥 利用该方 法袁只需要 2 次加液尧1 次离心袁从基因组 DNA 提取到 SSR- PCR 扩增袁最后电泳袁进行谱带分析袁整个过程仅 需 4.5

2、5 h遥 本方法成本低尧速度快尧操作简单袁适用于批量化 DNA 的提取袁且整个提取过程无毒尧无污染袁是 一种资源节约型和环境友好型的高效提取方法袁适用于大批量样本的 SSR 分子标记鉴定工作遥 关键词院棉花曰胚曰SSR曰基因组 DNA 中图分类号院S562.035.3文献标志码院A 文章编号院1002- 7807(2014)01- 0087- 08 Lang Xuyong, Liu Weixia, Yang Liang, Zhou Wenhua, Wu Jiangong, Bie Chuanshu* (430070) SSR(simple sequence repeats) molecular

3、 marker technology can quickly and efficiently identify the purity of hybrid cotton seeds. This study was aimed at overcoming technical difficulties of this technology and finding a genomic DNA extrac- tion technique from dry cotton seed embryo. This method requires only two fluid additions and one

4、centrifugation. From genom- ic DNA extraction to SSR- PCR amplification, electrophoresis, and finally band- spectrum reading, the entire process requires on- ly 4.55 h. The method has low cost, high speed, simple operation, and is suitable for mass DNA extraction. The entire extrac- tion process is

5、non- toxic and non- polluting, so it is a resource- saving and environmentally friendly solution that could be used for large sample quantity SSR molecular marker work. cotton; embryo; SSR; genomic DNA 收稿日期院2013- 06- 07 作者简介院郎需勇渊1985- 冤袁男袁硕士袁曰 * 通讯作者袁 基金项目院转基因生物新品种培育重大专项渊2012ZX08013- 012冤 随着市场上棉花品种的

6、不断增加袁而其遗传 基础又相对狭窄袁使棉花各品种间在形态学鉴定 上也越来越困难袁导致棉花品种杂尧乱现象日益 严重袁从而对棉花产量和质量造成了严重影响1遥 近年来袁 随着分子生物学和生物技术的发展袁证 明 SSR(Simple sequence repeats)分子标记技术应 用于杂交棉纯度鉴定袁能够快速尧有效地对棉花 品种的质量进行控制2- 3遥 SSR 分子标记检测技术 可以在短时间内检测出棉花种子的纯度袁具有速 度快尧准确性高等优点袁能够切实有效地防止制 种农户的掺杂使假1- 5遥 应用 SSR 分子检测过程中袁 对基因组 DNA 高效尧快速提取是基本环节遥 目前已有多种 DNA 提取方法

7、袁如 CTAB(Cetrimonium bromide)6尧SDS (Sodium dodecyl sulfate)7等方法可提取高质量尧 高产量 DNA遥 这些方法应用于 SSR 作物辅助育 种或者杂交种纯度鉴定对大量样本进行分析 时袁要求基因组 DNA 提取人员操作熟练袁整个 过程步骤繁琐尧 耗时较长尧 试剂繁多且成本较 高袁另外对仪器设备有特殊要求等袁这些缺点限 制了其应用遥 本研究以棉花干种子胚为材料袁探 索一种适用于棉花干种子基因组 DNA 的快速 提取新方法遥 棉花学报26 卷 材料与方法 实验材料 选用由湖北惠民农业科技有限公司提供的 鄂杂棉 10 号渊太 D5F1冤尧伊陆早 3

8、 号尧鄂杂棉 10 号父本尧鄂杂棉 10 号母本尧测试品种渊疑似鄂杂 棉 10 号冤袁利用自制的棉花干种子切割器将棉花 干种子切开并用镊子将胚取出备用遥 主要试剂院 Tris- Base尧Na2- EDTA 购自 Biosh- arp袁KCl尧异丙醇尧无水乙醇购自国药集团化学药 业有限公司遥 引物由上海生工生化公司合成遥 使用前配制 DNA 提取缓冲液院100 mmol 窑 L- 1 Tris- Base袁pH8.0曰10 mmol 窑 L- 1Na2- EDTA袁pH 8.0曰 1 mol 窑 L- 1KCl遥 DNA 提取步骤 1冤取棉花干种子胚于200滋L96 孔 PCR板中曰 2冤 向

9、棉花干种子胚中 渊每孔冤 加入 50 滋L DNA 提取缓冲液袁用 PCR 板硅胶盖封好袁再将混 合体系置于 PCR 扩增仪上 941520 min曰 3冤室温 3000 r窑 min- 1离心 2 min袁用 12 孔道 移液器将上清液吸出去掉袁重复步骤 2冤一遍曰 4冤 向棉花干种子胚中 渊每孔冤 加入 150 滋L ddH2O 稀释备用遥 基因组 DNA 检测 取 10 滋L 的基因组 DNA 原液和 5 滋L 的 3伊 Loading buffer 混匀袁经 0.8%琼脂糖凝胶渊含 EB冤 电泳 30 min袁 于君意东方 JY04S- 3C 型凝胶成像 系统上检测尧拍照并保存遥 SS

10、R-PCR 扩增分析 PCR 扩增的具体方法院 在常温或冰浴中建立 10 滋L 的 PCR 扩增体 系袁然后置于 ABI- 9700 PCR 仪上进行扩增反应遥 扩增体系如下表所示院 表 110 滋L 的 PCR 扩增体系 Table 110 滋L PCR amplification system 成分 Composition使用浓度 Stock终体积 Final volume(10 滋L) ddH2O-6.3 滋L 10伊Buffer-1.0 滋L Mg2+25 mmol 窑 L- 10.8 滋L dNTP10 mmol 窑 L- 10.2 滋L F- primer10 滋mol 窑 L-

11、10.3 滋L P- primer10 滋mol 窑 L- 10.3 滋L Taq5 U 窑 滋L- 10.1 滋L Template DNA1530 ng 窑 滋L- 11.0 滋L 反应程序院 94预变性 4 min袁1 个循环曰 94 变性 50 s袁58退火 50 s袁72延伸 1 min袁35 个循环曰72延伸 7 min袁 一个循环曰4保存待 用遥 PCR 扩增产物经 6%的变性聚丙烯酰胺凝胶 电泳分离袁再经过银染和显影后在胶片观察灯上 分析袁并用相机拍照保存遥 结果与分析 基因组 DNA 的提取结果 如图 1 所示袁112 为鄂杂棉 10 号 渊太 D5F1冤袁1425 为伊陆早

12、 3 号袁13 为 100 bp Ladder DNA Marker遥 在图 1A 中除了 100 bp Ladder DNA Marker 有明亮的谱带之外袁 鄂杂棉 10 号 渊太 D5F1冤尧伊陆早 3 号的泳道并没有出现清晰明 亮的条带遥 然而将它们的 DNA 提取液在分光光 度计下检测得知袁 其 DNA 浓度在 75120 ng 渊ddH2O 稀释前冤 左右袁 说明该方法能够将 DNA 提取出来袁可能是溶液中的离子的原因导致琼脂 糖电泳未检测出基因组 DNA 的谱带遥 为了验证明本方法能否提取出基因组 DNA袁 本研究在该提取方法的基础上增加了基因组 DNA 沉淀和风干步骤遥具体操作

13、如下院首先袁运用 本方法提取出基因组 DNA 上清液 渊未用 ddH2O 88 稀释冤曰其次袁将 35 滋L 上清液转移到新的 96 孔 PCR 板中袁加入 0.7 倍体积的异丙醇袁置于20 冰箱冷冻 20 min曰再次袁室温 3000 r 窑 min- 1离心 10 min袁倒掉上清液曰最后袁75%酒精清洗袁风干袁加入 20 滋LddH2O 稀释遥 将提取出的较纯的基因组 DNA 经琼脂糖电泳检测袁 可以看到明显的谱带 渊图 1B冤遥 由图 1 可以得出袁 本方法能够提取出基因组 DNA袁但是其条带呈现明显的弥散形袁拖尾现象 严重袁与宋尚新13的研究结果是一样的遥 本方法得 到的上清液中含有

14、基因组 DNA袁 但是 DNA 溶液 中其他离子成分的干扰使得其不能有效地通过琼 脂糖电泳检测袁 然而该 DNA 溶液经过纯化处理 之后则能够在琼脂糖电泳检测时得到谱带遥 DNA 模板体积对 SSR-PCR 扩增影响 按照本方法提取出的基因组 DNA 样品 渊未 用 ddH2O 稀释之前冤袁 分别吸取 0.1 滋L尧0.2 滋L尧 0.3 滋L尧0.5 滋L 和 1 滋L袁PCR 扩增做 10 滋L 体系袁 模板体积的差值用 ddH2O 补齐遥 实验得出袁0.2 滋L尧0.3 滋L 能够很好地扩增袁 0.5 滋L 只有个别样品能扩增袁 而 0.1 滋L 和 1 滋L 则没有扩增谱带袁说明 PC

15、R 扩增的模板的取用量 以 0.2 0.3 滋L 为宜遥 当 DNA 模板达到一定的用 量时袁随着 DNA 模板用量的增加袁其扩增效率呈 下降趋势袁最终导致无法得到有效扩增袁这一结 果与王伟伟14的结论是一致的遥 另外袁 用本方法提取的基因组 DNA 稀释之 后袁经 SSR- PCR 扩增能够得到更好的结果遥 图 2 中袁 都是用经过 4 倍稀释的基因组 DNA 扩增得 到的结果袁A尧B尧C尧D 分别依次取 0.5 滋L尧1 滋L尧 1.5 滋L尧2 滋L 体积的模板(分别对应未稀释前的模 板体积 0.13滋L尧0.25 滋L尧0.38滋L尧0.5滋L)袁做 10 滋L 体系进行扩增遥由图 2

16、 可以得出袁图 2A 基本无扩 增谱带袁图 2B尧2C 谱带清晰尧结果一致袁图 2D 有 个别谱带未扩出且其扩增量明显下降袁与未稀释 前的 SSR- PCR 扩增结果是一致的遥 另外袁在基因 组 DNA 未稀释之前袁0.5 滋L 体积的模板只有个 别样品能够扩增袁然而稀释之后则绝大部分样品 可以扩增出结果袁 说明本方法提取的基因组 DNA 经过稀释袁 能有效地进行 SSR- PCR 扩增遥 因此袁综合以上所述袁本方法提取的基因组 DNA 模板体积取 11.5 滋L 即可进行有效地 SSR- PCR 扩增遥 1- 12:鄂杂棉 10 号(太 D5F1); 13:Marker; 14- 25: 伊

17、陆早 3 号遥 1- 12:Ezamian 10(Tai D5F1); 13:Marker; 14- 25: Yiluzao 3. 图 1基因组 DNA 的琼脂糖电泳图谱 Fig. 1The agarose gel electrophoresis pattern of genomic DNA 郎需勇等院一种快速提取棉花干种子基因组 DNA 的新方法1 期89 棉花学报26 卷 SSR-PCR 扩增结果 为了研究本 方法提取 DNA 的可用性袁 对其做了准确性和精 确度研究遥 准确性研究采用一一对应的方法进行比较袁 即采用同一粒棉花干种子使用不同的提取方法袁 来验证其结果是否相同遥 具体步骤是袁

18、取一粒棉 花干种子的部分胚采用本方法提取基因组 DNA袁 剩下部分采用匡猛等1的单粒棉花干种子 DNA 快速提取法进行提取袁两者进行对比袁观察其结 果是否相同遥 图 3A 和 3B袁为分别采用匡猛的单 粒棉花干种子 DNA 提取方法和本研究的 DNA 提取方法得到的 SSR- PCR 扩增结果图谱袁1- 13 的样序是院1袁父本曰2袁母本曰4 和 10袁混杂种子曰其 他为杂种鄂杂棉 10 F1遥 由图 3A 和 3B 可以看出袁 两种提取方法的结果相同袁说明本方法能够准确 得到基因组 DNA 扩增结果遥 精确度研究则用发芽 6 d 的棉花幼苗经 CTAB6法提取得到基因组 DNA 扩增的结果(

19、图 3C)袁 与运用本研究方法直接提取该样品种子胚 的基因组 DNA 扩增结果(图 3D)进行比较遥 图 3C 的取样是发芽 6 d 的幼苗遥 采用传统的 CTAB 方法袁 能够真实反映该种子批的纯度情 况遥在待检的 48 个样品中有 8 个混杂种子袁其纯 度为院(样本总谱带数 -混杂谱带数)/ 样本总谱 带数伊100%=83.3%遥 图 3D 中袁则是从该种子批 中随机抽取 48 粒种子袁采用本研究方法袁直接取 其胚提取基因组 DNA 经扩增得到的结果袁在待 检样品中有 7 个混杂种子袁其纯度是 85.4%遥 由 图 3C 和 3D 可以得出袁 本研究方法直接提取的 棉花干种子胚基因组 DN

20、A 得到的扩增结果与 用幼苗经 CTAB 法提取 DNA 扩增所得到的结 果一致遥 由此可知袁 本研究的提取方法得到的结果袁 能够真实的再现种子内基因组 DNA 的真实情 况袁与常规方法得到的纯度结果一致袁证实了该 方法 DNA 提取结果的准确性和精确度遥 利用本方法提取的 鄂杂棉 10 号渊太 D5F1冤尧伊陆早 3 号的干种子基 因组 DNA 经 PCR 扩增袁 产物经 6%的变性聚丙 烯酰胺凝胶电泳分离袁再经银染和显影后得到谱 带结果遥 图 4A 为鄂杂棉 10 号 渊太 D5F1冤渊杂交 种冤的电泳图谱袁谱带 33尧34 为自交铃袁其余都是 杂种 F1袁其杂交种 F1的纯度为 97.9

21、%曰图 4B 为伊 陆早 3 号渊常规种冤的电泳图谱袁谱带 2尧7尧24尧48 为混杂品种的谱带袁其中谱带 2 可能是混杂品种 与该品种串粉得到的杂种 F1袁因而该品种的纯度 为 91.7%遥由图 4 可以看出袁本方法对杂交种或常 规种都能很好的提取其基因组 DNA袁所得谱带清 晰袁无拖尾尧杂带现象袁也未出现 RNA 干扰出现 的拖尾袁说明本方法提取的基因组 DNA 较纯袁无 RNA 的干扰和蛋白质等其他杂质遥 因此袁本方法对于棉花干种子的提取具有通 用性袁 提取得到的基因组 DNA 经 SSR- PCR 分 析袁能够得到清晰尧明亮的条带袁说明本方法适用 于大批量样本的 SSR 分子标记鉴定工

22、作袁能及时 准确地进行棉花种子的纯度鉴定遥 基因组 DNA 模板体积院A)0.5 滋L曰B)1 滋L曰C)1.5 滋L曰D)2 滋L遥 Volume of genome DNA template: A)0.5 滋L曰B)1 滋L曰C)1.5 滋L曰D)2 滋L. 图 2基因组 DNA 模板体积对 SSR-PCR 扩增影响 Fig. 2Volume of genome DNA template affect on SSR-PCR amplification 90 基因组 DNA 的储藏和稳定性 本文中研究了该方法提取基因组 DNA 的储 藏温度和稳定性遥 在常温下袁该方法提取的基因 组 DNA

23、至少能够保存一星期以上曰 在 4条件 下袁至少能够保存半年以上渊图 5B冤遥 图 5A 为当 天提取的基因组 DNA 取 1 滋L 体积的模板进行 SSR- PCR 扩增得到的结果袁 图 5B 为半年以后取 等体积的相同模板扩增得到的结果袁 其中 13是 A) M袁Marker曰1袁父本曰2袁母本曰4尧10袁混杂种子曰其余均为鄂杂棉 10 号渊太 D5F1冤遥 B) M袁Marker曰1袁父本曰2袁母本曰4尧10袁混杂种子曰其余均为鄂杂棉 10 号渊太 D5F1冤遥 C) M袁Marker曰4尧13尧20尧28尧37尧40尧44尧48袁混杂种子曰其余均为鄂杂棉 10 号渊太 D5F1冤遥 D)

24、 M袁Marker曰2尧6尧18尧23尧26尧32尧34袁混杂种子曰其余均为鄂杂棉 10 号渊太 D5F1冤遥 A) M袁Marker曰1袁Male parent曰2, Female parent; 4尧10袁the motley of other seeds曰others, Ezamian 10(Tai D5F1). B) M袁Marker曰1袁Male parent曰2, Female parent; 4尧10袁the motley of other seeds曰others, Ezamian 10(Tai D5F1). C) M袁Marker曰4尧13尧20尧28尧37尧40尧44尧48

25、袁the motley of other seeds; others, Ezamian 10(Tai D5F1). D) M, Marker; 2尧6尧18尧23尧26尧32尧34袁袁the motley of other seeds曰others, Ezamian 10(Tai D5F1). 图 3SSR-PCR 扩增结果 PAGE 电泳图谱 Fig. 3The PAGE electrophoresis of SSR-PCR Amplification results A) 33尧34袁母本曰其余均为鄂杂棉 10 号渊太 D5F1冤遥 B) M袁Marker曰2尧7尧24尧48袁混杂种子曰其

26、余均为伊陆早 3 号遥 A) 33尧34, Female parent; others, Ezamian 10(Tai D5F1). B) M, Marker; 2尧7尧24尧48袁the motley of other seeds曰others, Yiluzao 3. 图 4不同品种 SSR-PCR 扩增结果 PAGE 电泳图谱 Fig. 4The PAGE electrophoresis of SSR-PCR Amplification results in different cultivars 郎需勇等院一种快速提取棉花干种子基因组 DNA 的新方法1 期 A B 91 棉花学报26

27、卷 鄂杂棉 10 号母本袁46 为鄂杂棉 10 号父本袁715 为鄂杂棉 10 号尧1624 为测试品种遥 图 5A 中袁测 试品种有混杂现象(17尧19)袁其杂种 F1的谱带与 鄂杂棉 10 号的谱带不同袁 父本条带与鄂杂棉的 10 号的父本不同(测试品种的父本带比鄂杂棉 10 号的扩增片段长度较短)遥测试品种检测出 3 个标 记处均与鄂杂棉 10 号不同袁 因此可以判定测试 品种不是鄂杂棉 10 号遥 图 5B 中也得到了相同的 结果袁说明该方法提取的基因组 DNA 在 4保存 半年以后仍然能够很好的进行 PCR 扩增袁且其具 有良好的稳定性遥 另外袁本研究也将保存半年的样品进行二次 抽提

28、袁 即去掉上清液加入提取缓冲液置于 94, 1520 min袁之后加入 150 滋L ddH2O 稀释备用遥采 用二次抽提得到的基因组 DNA 经 SSR- PCR 扩 增后也得到了相同的结果袁 说明如果 DNA 中途 降解进行二次抽提提取基因组 DNA 的方法是行 之有效的遥 M袁Marker曰13袁鄂杂棉 10 号母本曰46袁鄂杂棉 10 号父本曰715袁鄂杂棉 10 号曰1624袁测试品种遥 M袁Marker曰1- 3袁Ezamian 10 female parent曰4- 6袁Ezamian 10 male parent曰7- 15袁Ezamian 10曰16- 24袁The test

29、 varieties. 图 5基因组 DNA 的储藏和稳定性图谱分析 Fig. 5Storage and stability of the genome DNA sequence analysis 表 2三种 DNA 提取方法的成本比较 Table 2The cost comparison of three methods of DNA extraction 费用 CostCTABSDSTPS 试剂费用 Reagent cost元23.2120.270.034 人力费用 Human cost元53.3353.3313.33 成本及耗时分析 本研究创新的棉花干种子胚 DNA 提取方 法袁具有低成

30、本尧耗时少等优点遥 成本问题主要从两个方面进行 比较袁即试剂成本和人力成本渊见表 2冤遥表 2 中列 出了 3 种 DNA 提取方法提取 1 个大样 渊以提取 96 粒种子的 DNA 样品为 1 个大样冤 的试剂费用 和人工费袁 得出试剂费用由繁琐的 CTAB尧SDS 方法的二十几元成本降为不到 5 分钱袁人工费用 由原来的 1 个人每天只能提取 1.5 个大样到现在 1 个人可以独立完成 6 个大样的提取袁使 DNA 的 提取成本大幅度降低遥综合人力费用(80 元 窑 人 - 1 窑 d- 1)和试剂成本可以得出袁提取单个样品的费用由 原来的 80 元降为 15 元左右的成本遥 表 3 中列

31、出了 CTAB尧SDS 和 TPS 3 种方法对棉花干种子基因组 DNA 的提取袁 并对其提取步骤和耗费的时间进行比较袁除去取 样和风干的时间袁3 种方法依次耗时 5 h尧5 h 和 0.5 h遥 由此可见袁TPS 高温水煮法能够高效快速 的提取 DNA袁且安全无污染袁即不会污染实验室 的空气质量袁也不会因为 茁 巯基乙醇和氯仿等有 毒物质的挥发对人体造成伤害遥 另外袁TPS 高温 水煮法袁采用傻瓜式操作方法袁只有简单的加液 和沸水浴过程袁易于操作袁不需要像 CTAB尧SDS 两种方法需要一定的操作经验遥 第三袁 提取的 DNA 直接取用上清液作为 DNA 模版进行 PCR 扩增反应袁省去了风

32、干的步骤袁因此可以做到当 天取样当天出结果遥 92 结论与讨论 DNA 分子标记技术已广泛运用于分子生物 学的各个领域袁 其中 DNA 的提取亦是其重要的 技术环节之一遥 提取的 DNA 片段大小渊完整性冤袁 干扰物质渊如蛋白质尧RNA尧多酚尧多糖等冤的多 少袁决定其结果是否具有可靠性和重复性1遥 相对 于水稻尧玉米等作物袁棉花因含有多酚尧单宁尧多 糖等干扰物质袁 使得其基因组 DNA 的提取难度 加大遥 在棉花基因组 DNA 提取中袁多数以新鲜的 叶片尧花瓣组织进行 DNA 的提取8遥一直以来袁直 接从棉花干种子中提取基因组 DNA袁既是难点也 是热点遥 自 1997 年 Krishna 和

33、 Jawali9成功的提 取了棉花基因组 DNA 以来袁 棉花干重子基因组 DNA的提取方法创新与改进就从未间断过遥匡猛1尧 刘峰8尧李旺忠10等通过改良 SDS尧CTAB 的方法袁 能够直接从棉花干种子中直接提取基因组 DNA袁 省去了 Krishna 等人方法中需要浸种的时间遥 沙 爱华11改良的 SDS 提取方法袁以离心的方法代替 蛋白质抽提袁使提取步骤尽可能简化遥 综观上述 方法袁都只是在 SDS尧CTAB 方法上略微改动袁步 骤依然繁琐袁 使其高通量作业存在一定的困难遥 郭景伦12尧宋尚新13等运用 NaOH 的碱裂解法或 TPS 高温水煮的方法使玉米尧水稻种子的细胞破 碎释放基因组

34、 DNA袁 然后直接用浸出液进行 PCR 扩增分析遥 碱裂解法或者高温水煮法步骤简 单尧成本低袁适用于高通量的 DNA 分子标记检测 任务遥 因此袁本研究通过对 TPS 高温水煮法深入 探讨和研究袁成功的提取了棉花干种子胚的基因 组 DNA遥 本研究实验中袁 以棉花干种子胚为基因组 DNA 提取的底物袁仅通过一种提取缓冲液尧两次 高温水煮袁直接利用其浸出液 PCR 得到了满意的 效果遥 一般情况下袁如水稻和玉米等仅需要 1 次 高温水煮就可以将基因组 DNA 提取出来12- 13袁并 且取种子的任何部位器官都能够进行 DNA 提 取遥 然而袁本研究也尝试利用棉花种子的其他部 位袁采用两次高温水

35、煮的方法的进行 DNA 提取袁 效果并不是很理想袁有很多空管的出现遥 另外袁本 研究也尝试运用 1 次高温水煮的方法来提取棉 花干种子胚的 DNA袁 虽然也能够提取出来部分袁 但是其扩增效果并不是很理想且空管很多遥 本实 验中袁经过第一次高温水煮之后袁弃去上清袁同时 也将浸出液中有很多杂质去除袁再进行第二次高 温水煮就能够得到质量较好的基因组 DNA遥本方 法能够对棉花干种子胚进行多次提取袁 并且在 4能够保存半年以上袁如果中途出现降解现象袁 则可以弃上清袁进行二次 DNA 提取遥 本研究提供的棉花干种子基因组 DNA 快速 提取方法袁 整个提取过程只使用了 1 种试剂袁且 都是机械的加液体操

36、作袁 没有常规方法中转管尧 吸上清那些需要一定技术含量的操作步骤袁因此 适用于批量化 DNA 的提取遥 以 96 个样品基因组 DNA 的提取为例袁本发明方法整个提取过程仅需 步骤 Step CTABSDSTPS 次数 Times 总耗时 Total timeh 次数 Times 总耗时 Total timeh 次数 Times 总耗时 Total timeh 取样 Sampling111 磨样 Grind10.510.5- 加(移)液 Adding(moving) liquid71.071.021 沸水浴 Boiling water bath11.011.0230 离心 Centrifuga

37、tion41.041.0- 震荡 Oscillating60.560.5- 转管 Transfer tube21.021.0- 风干 Air drying11- 5.05.030 表 3三种基因组 DNA 提取方法的步骤和时间对比 Table 3Comparing the steps and time consuming of three genomic DNA extraction 郎需勇等院一种快速提取棉花干种子基因组 DNA 的新方法1 期93 棉花学报26 卷 3040 min遥 从样品准备袁基因组 DNA 提取袁到最 后 SSR- PCR扩增谱带分析袁整个过程仅需 4.55h遥 本方

38、法整个基因组 DNA 提取过程所需试剂用量 少且试剂便宜袁而且整个提取过程无毒尧无污染袁是 一种资源节约型和环境友好型的高效提取方法袁适 用于大批量样本的 SSR 分子标记鉴定工作遥 参考文献院 1 匡猛, 杨伟华, 许红霞, 等. 单粒棉花种子 DNA 快速提取方法 J. 分子植物育种, 2010, 8(4): 827- 831. Kuang Meng, Yang Weihua, Xu Hongxia, et al. A rapid method of DNA extraction from single cotton seedJ. Molecular Plant Breeding, 201

39、0, 8(4): 827- 831. 2 张玉翠, 杨伟华, 匡猛, 等. 32 个棉花主栽品种 DNA 指纹图谱 构建及遗传多样性分析J. 棉花学报, 2012,V24(2): 120- 126. Zhang Yucui, Yang Weihua, Kuang Meng, et al. Construction of DNA fingerprinting and analysis of genetic diversity with SSR markers for 32 leading cotton cultivarsJ. Cotton Science, 2012, 24(2): 120- 1

40、26. 3 郎需勇, 吴建功, 杨亮, 等. SSR 分子标记技术在杂交棉纯度鉴 定中的应用J. 中国棉花, 2012, 39(9): 17- 20. Lang Xuyong, Wu Jiangong, Yang Liang, et al. Purity detection of hybrid cotton by SSR markersJ. China Cotton, 2012, 39(9): 17- 20. 4 许兰杰, 聂战胜, 詹克慧, 等. 利用 SSR 标记鉴定棉花杂交种 兴杂 2 号纯度的研究J. 中国农学通报, 2008, 6(24): 202- 206. Xu Lanjie,

41、Nie Zhansheng, Zhan Kehui, et al. Purity detection of cotton hybrid Xingza No. 2 by SSR markersJ. Chinese Agricul- tural Science Bulletin, 2008, 6(24): 202- 206. 5 赵海燕, 渠云芳, 黄晋玲, 等. SSR 分子标记在棉花遗传育种中 的应用及进展J. 中国农学通报, 2009, 25(22): 57- 61. Zhao Haiyan, Qu Yunfang, Huang Jinling, et al. Advances of SSR

42、 marker technology and its applications in cotton genetics and breedingJ. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2009, 25 (22): 57- 61. 6 Paterson A H, Brubaker C L, Wendel J F. A rapid method for ex- traction of cotton(spp.) genomic DNA suitable for RFLP or PCR analysis J. Plant Molecular Biology R

43、eporter, 1993, 11(2): 122- 127. 7 Ahmed I, Islam M, Arshad W, et al. High- quality plant DNA ex- traction for PCR: an easy approachJ. Journal of Applied Genet- ics, 2009, 50(2): 105- 107. 8 刘峰, 赵佩, 徐子初, 等. 一种适用于 SSR- PCR 的棉花干种子 DNA快速简便提取方法J. 分子植物育种,2010,8(5): 981- 986. Liu Feng, Zhao Pei, Xu Zichu,

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