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1、第十一章 基因工程,本章重点,基因工程的概念和一般操作流程。,基因工程工具酶、载体、目的基因获得方法、重组连接技术、导入技术、以及重组的筛选等。,动物克隆技术与转基因技术,11.1基因工程概述,基因工程（genetic engineering），也叫基因操作、遗传工程，或重组体DNA技术。它是一项将生物的某个基因通过基因载体运送到另一种生物的活性细胞中，并使之无性繁殖（称之为“克隆”）和行使正常功能（称之为“表达”），从而创造生物新品种或新物种的遗传学技术。,基因工程概述,基因工程的基本流程,目的基因获得,重组DNA分子构建,导入受体细胞,转化体细胞扩增、鉴定与筛选,11.2 工具酶,11.2
2、.1限制性内切酶,识别双链DNA中特定序列并切割双链DNA的核酸内切酶。,型和型限制酶的切点不固定，不能产生可以利用的DNA片段，只有型限制酶具有可以控制和预测的位点特异性切割的性质，并且产生固定的DNA片段，因此基因工程中所用的限制酶都是型限制酶。,限制性内切酶1,II限制性内切酶基本特征,特异性位点切割双链DNA,识别序列为4-6个碱基，大多双重交替对称,切割产生平头末端(blunt end/flush end)和粘性末端(cohesive),限制性内切酶2,EcoR l识别6个核苷酸序列，在特定的G-A之间切割DNA分子：,限制性内切酶3,BamH识别6个核苷酸的序列，在特定的A-A之间
3、切割DNA分子,限制性内切酶4,有少数限制的酶在双链DNA的对称轴处切割，产生平齐末端（平端），如Bal和Sma,限制性内切酶用途,产生特异的限制酶片段；,建立DNA分子的限制酶图谱；,构建基因文库,用限制酶切出的相同的粘性末端，以便重组,11.2.2. DNA聚合酶,DNA聚合酶种类,大肠杆菌聚合酶（全酶）,大肠杆菌聚合酶大片段（Klenow片段）,T4噬菌体DNA聚合酶,T7噬菌体聚合酶及经修饰的 T7噬菌体聚合酶（测序酶）,末端转移酶,逆转录酶,耐热 DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）,DNA聚合酶种类,DNA聚合酶用途,大肠杆菌DNA聚合酶（全酶）,用切口平移方法标记DNA（可作杂交探
4、针）,利用其5-3外切核酸酶活性降解寡核着酸作为合成cDNA第二链的引物,用于对DNA分子的3突出尾进行末端标记，用于DNA序列分析,用途,Klenow片段,补平限制性内切酶切割DNA产生的3凹端；,用32P补平3凹端，对DNA片段进行末端标记；,对带3突出端的DNA进行末端标记；,在cDNA克隆中，用于合成cDNA第二链；,在体外诱变中，用于从单链模板合成双链DNA；,应用双脱氧链末端终止法进行DNA测序,用途,T4噬菌体DNA聚合酶,补平或标记限制性内切酶消化DNA后产生的3凹端,对带有3突出端的DNA分子进行末端标记,标记用作探针的DNA片段,将双链DNA的末端转化成为平端,使结合于单链
5、DNA模板上的诱变寡核着酸引物得到延伸,用途,T7噬菌体DNA聚合酶及由此改造的测序酶,用于拷贝长段模板的引物延伸反应,通过补平或交换（置换）反应进行快速末端标记,耐热 DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶）,用于DNA测序,用于聚合酶链式反应（PCR）对DNA片段进行体外扩增,用途,末端转移酶,给载体或CDNA加上互补的同聚尾,用于DNA片段3末端的放射同位素标记,用途,11.2.3 DNA连接酶,T4 DNA连接酶,连接带匹配粘端的DNA分子,双链DNA分子互相连接或合成的接头相连接,11.2.4 核酸酶,S1核酸酶,去除DNA片段的单链突出端，使之成为平端,去除cDNA合成时形成的发夹结构
6、,施行Sl核酸酶保护试验（Sl protection或Sl mapping），分析转录产物,成熟mRNA与基因组DNA杂交后，结合Sl核酸酶水解，可确定内含子在基因组DNA中的定位,修整渐进性删除突变的末端,核酸酶,Bal 31核酸酶,用于不同长度的删除突变克隆实验及基因结构、机能分析,绘制DNA限性内切图谱,研究超螺旋DNA的二级结构和致畸剂引起的双链DNA螺旋结构变化,11.3 基因工程载体,载体（vector）是把外源基因引入受体细胞并在其中能自我复制的小DNA 分子。,基因工程中的载体应具有如下一些特性：,独立和稳定的 DNA自我复制,易于从宿主细胞中分离，并进行纯化,具有适当的限制性
7、内切酶位点,有报告基因,11.3.1 细菌质粒载体,质粒是细菌染色体外的小型环状双链的DNA分子。,质粒DNA的分子特性,质粒DNA分子呈双链共价封闭环状、自然旋转成超螺旋构型（closed circle DNA， ccDNA），有时会因单链断裂而成为开链环状DNA（open circle DNA， ocDNA）有时双链断开成线性DNA（liner DNA， lDNA）,11.3.2 噬菌体载体,细菌质粒载体所能携带的外源基因只限于10kb以下的DNA片段，噬菌体作为载体，可插入长10kb20kb甚至更大的一些外源DNA片段。,噬菌体,噬菌体是一种温和噬菌体，即在感染其宿主菌大肠杆菌后，呈现溶
8、菌性和溶源性两类生长方式。,11.3.3 粘性质粒载体,粘性质粒载体（也称柯斯质粒载体或粘粒，cosmid vector）本质上是含有抗性基因、单一克隆位点以及DNAcos位点（体外包装所必需）的细菌质粒。,粘性质粒优点是克隆容量较大，可容纳35kb45kb外源DNA，转化率也较高。常用的粘性粒有PHC79。PJB8、MUA3和KOSI等，它们大多具有一种或多种限制性内。切酶的单一酶切位点。极其适合高等真核基因的克隆工作。,11.3.4 YAC载体,酵母人工染色体（yeast artificial chromosome,）是人工构建的染色体：,目前能插入片段最大的载体。,11.3.5 病毒载体
9、,细菌质粒和噬菌体具有严格的宿主选择性，只能在相应的细菌中生存和繁殖，从而限制了基因工程的广泛性。,动物病毒载体是一种比较理想的真核基因工程载体，在其序列中往往具有几个很强的启动子，它可使排列在其后方的核酸序列高产量和高频率地复制和表达。,SV40,病毒的基因组是共价封闭环状双链DNA，长52kb。基因组在功能上分为早、晚期转录两个区域。,pCATbasic plasmid在SV40的调节片段上游插入一个氯霉素乙酸基转移酶（chloramphenicol acetylfransferase， CAT）,11.4获取目的基因的方法,11.4.1鸟枪法,在基因组DNA文库中筛选出目的基因,鸟枪克隆
10、法在基因组DNA文库中筛选到的目的基因，与染色体中的天然基因是一样的，含有内含子，在结构基因两端的连接区还有转录调控序列片段，即调节基因。这样的基因可供基因表达的调控分析。因为有内含子的存在，这样获得的结构基因不宜在原核宿主组织中表达。,11.4.2化学合成基因,将核着酸或寡核苷酸片段，一个一个地或一片段一片段地缩合起来，成为一个一个基因的核苷酸片段 。,11.4.3聚合酶链式反应,polymerase chain reaction， PCR优点很多，具有快速、灵敏、简便，特异等特点。 PCR对 DNA模板的质量和数量要求比其他实验方法低得多,但PCR也有缺点：扩增DNA的长度一般不超过 2k
11、b， Taq DNA聚合酶在合成作用时也会发生错误，出错率025，费用比较昂贵。,11.5 DNA体外重组与基因转移,11.5.1体外重组,将目的基因与载体连接在一起，即DNA的体外重组。,粘性末端连接,同一限制酶切位点连接,不同限制酶切位点连接这两种方法,酶切割产生单链突出的粘性末端（cohensive terminal）,酶切位点附近的DNA序列不影响连接,两个DNA片段一起退火（anneal）时，粘性末端单链间进行碱基配对，然后在T4 DNA连接酶催化作用下形成共价结合的重组DNA分子,体外重组条件与过程,连接结果,平端连接,具有平末端的酶切载体只能与平末端的目的基因连接。 T4 DNA
12、连接酶可催化相同和不同限制性核酸内切酶切割的平端之间的连接,有时载体DNA片段是平末端，而目的基因却是粘性末端，那就需要进行处理，使载体DNA和目的基因的末端一致起来，通常是将目的基因的粘性末端修饰成平末端，即添补法和削除法 。,人工接头连接,同聚物加尾连接,同聚物加尾连接是利用同聚物序列之间的退火作用完成的连接,11.5.2 基因转移,转化(transformation)，是将重组质粒导入受体细菌细胞,转染(transfection)，是将携带外源基因的病毒感染受体细胞,微注射技术(microinjection),电转化法(electro-transformation),微弹技术(micro
13、 neblast technique也叫高速粒子轰击法micro projector或基因枪技术gene blaster technique),脂质体介导法(liposome mediated gene trans-fer)；,11.6 重组体的鉴定筛选,11.7 转基因技术,转基因动物是指以实验方法导入外源基因，在染色体组内稳定整合并能遗传给后代的一类动物。,融合法，包括细胞融合，微细胞介导融合等,化学法，包括DNA-磷酸钙沉淀法、DEAE-葡聚糖法、染色体介导法等,物理法，包括显微注射法、电脉冲法、细胞冻存法等,病毒感染法，包括重组DNA病毒感染、重组RNA病毒感染等,11.8 克隆技术,生产哺乳动物克隆的方法主要有胚胎分割和细胞核移植两种，目前应用的主要是后者。,（1）培育优良畜种和生产实验动物；,（2）生产转基因动物,（3）用于细胞和组织替代疗法；,（4）复制濒危的动物物种,11.9基因诊断,用分子生物学方法检测患者体内遗传物质的水平或结构变化而作出的或辅助临床诊断的技术，称为基因诊断,核酸杂交,聚合酶链反应,限制性内切酶酶谱分析,RFLP,