第四节苹果酸.ppt

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1、第四节 苹果酸,一、概况 又名羟基琥珀酸，羟基丁二酸，几乎一切果实中都含有，以仁果类中最多。酸味较柠檬酸强1.21.3倍，苹果酸具有比柠檬酸柔和的酸味，滞留时间长和口味更好的优点，作为食品酸味剂更理想。,酸味剂:,赋予食品酸味为主要目的的食品添加剂。 有机酸类：柠檬酸、乳酸、酒石酸、苹果 酸、草酸； 无机酸类：食用磷酸、碳酸等。,DL-苹果酸： 白色或结晶状粉末，国外采用化学法生产。 L-苹果酸：(LMalic acid) 无色结晶，存在于植物或其果实中，发酵法或酶法生产。,二、历史 20世纪20年代，发现某些霉菌和酵母可积累L-苹果酸。 60年代，英美用化学合成法生产L-苹果酸，成本高。 1

2、959年，日本利用短乳杆菌（lactabacillus brevis） 产生的富马酸酶催化富马酸转化为L-苹果酸成功。 60年代以来，各国争相研制一步法从淀粉等糖质原料 生产苹果酸。 目前，世界上苹果酸的主要产地是日本。,三、生产方法 1. 从果汁中直接抽提法：经济上不合理 2. 化学合成法：产物是DL-苹果酸 3. 发酵法： （1）一步法 糖类 苹果酸 （2）二步法 根霉 酵母菌、细菌 糖类 富马酸 苹果酸 4.酶转化法: (常用) 固定化细胞 富马酸盐（化学合成） 苹果酸盐 富马酸酶,曲霉,四、常用菌种,1. 一步发酵法：黄曲霉、米曲霉、寄生曲霉； 2. 两步发酵法：华根霉、无根根霉、短乳

3、杆菌、膜毕赤酵母； 3.酶转化法：短乳杆菌、大肠杆菌、产氨短杆菌、黄色短杆菌。,L一苹果酸在生物体内的合成途径有3条: 1.丙酮酸羧化合成。丙酮酸羧化支路生成草酰乙酸，由苹果酸脱氢酶作用转变成苹果酸，此涉及到CO2的固定。 2.支路乙醛酸循环。 3.延胡索酸由延胡索酸酶作用转变成苹果酸。,五、苹果酸合成途径,EMP 固定CO2 淀粉 葡萄糖 丙酮酸 草酰乙酸 苹果酸脱氢酶 苹果酸,证据 （1）发酵依赖于CaCO3或其它碳酸盐。 （2）苹果酸对糖的最高转化率可达128，说明部分碳源是外源性的（不是从葡萄糖来的）。 CaCO3的双重作用: （1）提供外源的羧基碳源 （2）调节pH,六、苹果酸的生产

4、方法,（一）一步发酵法 糖类 苹果酸 1.菌种 ：黄曲霉A-114 2.培养基（%） （1）种子培养基（%） C6H12O6 3，豆饼粉1， FeSO4 0.05，K2HPO4 0.02，NaCl 0.001，MgSO4 0.01，CaCO3 6(单独灭菌)。,（2）发酵培养基（%） C6H12O6 7%8% 其余同种子罐培养基 3.发酵 装液量70%，接种量10%，罐压0.1MPa， 培养温度3334，通风量0.7m3/（m3.min)，搅拌转速180r/min，发酵时间40h左右。 当残糖在1%以下时，终止发酵，产苹果酸7%。,（二）二步发酵法 糖类 富马酸 苹果酸,1.菌种 ：华根霉65

5、08 2.斜面培养 葡萄糖马铃薯汁琼脂斜面 30培养7d 3.摇瓶发酵 a 培养基组成(%) C6H12O6 10，(NH4)2SO4 0.5，K2HPO4 0.1，聚乙二醇10，MgSO4 0.05，FeCl3 0.002，CaCO3 5(单独灭菌)。 b 富马酸发酵 30培养45d，得到含富马酸和苹果酸的混合液。,（三）酶转化法: (常用) 固定化细胞 富马酸盐（化学合成） 苹果酸盐 菌种：黄色短杆菌（Brevibacterium flavum）,富马酸酶,1.游离细胞酶转化法 8%富马酸溶液（pH7.5）+2%湿菌体苹果酸 条件：35 150r/min 2436h 转化率90%以上 2.

6、固定化细胞酶转化法 菌种：产氨短杆菌或黄色短杆菌 方法：包埋法（聚丙烯酰胺凝胶或卡拉胶KCl） 该方法易生成与苹果酸难以分离的琥珀酸。因此，细胞被固定以后必须经化学试剂处理，以防止这种副反应的发生。,采用固定化技术必须注意以下几个问题： 细胞被固定前富马酸酶活力要高； 使用的固定化方法对酶的损害较小； 细胞被固定后不应引起副反应的发生； 固定化细胞应有高度的操作稳定性。,（四）两种生产方法的比较：,发酵法尚未大规模工业化生产的主要原因：菌种的产酸率低。,七、苹果酸的提取 （一）从发酵醪液中提取苹果酸,H2SO4 过滤 CaCO3 流程：发酵液 酸解液 滤液 苹果酸钙 过滤 离子交换 浓缩 结晶

7、 干燥 苹果酸 H2SO4 65%80%,反应液中有残余的富马酸盐和多量的苹果酸盐。 提取原理：利用富马酸难溶于水的性质，在反应 液中加酸使富马酸沉淀析出。 发酵醪液浓缩析出富马酸结晶过滤滤液浓缩 50% 2030 65%80% 析出富马酸结晶过滤滤液冷却加晶种苹果酸 20 结晶干燥成品,（二） 从混杂富马酸发酵醪液中提取苹果酸,（三） 从酶转化液中提取苹果酸,H2SO4 过滤 CaCO3 流程：转化液 酸解液 滤液 苹果酸钙 12.5% 过滤 离子交换 浓缩 结晶干燥 苹果酸 H2SO4 65%80%,八、L一苹果酸生产技术展望 1.选用更合适的原料如葡萄糖、蔗糖、糖蜜、食用 级淀粉等进行精

8、细发酵； 2.在菌体快速絮凝、发酵液膜分离和净化技术方面 进行探讨； 3.研究用离子色谱法、树脂吸附法、萃取法等提取 技术替代传统的钙盐法； 4.改间歇冷却结晶为连续化真空浓缩降温结晶工艺。,第四节 黄原胶 一、多糖 1.概况 多糖是由多个单糖或其衍生物聚合而成的大分子化合物。,2. 多糖的分类 植物多糖 （1）根据多糖的来源不同 动物多糖 微生物多糖 （2）根据多糖在微生物体内的分泌部位 胞内多糖 细胞壁多糖 胞外多糖,二、黄单胞菌多糖 又称黄原胶，汉生胶，属于酸性胞外杂多糖，是微生物多糖中产量最大的一种。 1962年美国科学家发现，1964年实现工业化生产，在美国的生产规模仅次于抗生素和溶

9、剂，列第三位。,黄原胶的结构特征 1975年阐明，黄原胶是由 D葡萄糖、D甘露糖、D葡萄糖醛酸、乙酰基和丙酮酸组成的“五糖重复单元”的结构聚合体。 D-葡萄糖：D-甘露糖：D-葡萄糖醛酸 2 ： 2 ： 1,在水溶液中呈现多聚阴离子，而且在某些条件下，其分子可发生一级结构、二级螺旋构象以及超级接合带状螺旋共聚体构象间的互变现象。,2. 黄原胶的性质 （1）典型的流变特性 （2）低浓度时的高粘性 2%3%黄原胶37Pa.s的粘度 （3）耐热、耐酸碱性 -9890粘度稳定 130 36min后冷却 0.5%NaCl可稳定高温下的粘度,（4）相容性及溶解性 与藻酸盐类、淀粉、卡拉胶、瓜胶溶混后粘度叠

10、加。 易溶于水，不溶于醇、酮等极性溶剂。 （5）分散性及保水性,3. 黄原胶的用途 （1）能源开发 （2）食品工业 （3）其它工业,三、黄原胶的生产,工艺流程： 菌种的扩培发酵原料配比发酵发酵条件控制分离提纯干燥,1.菌种 引起甘蓝黑腐病的病原细菌野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）。 杆状，G，产荚膜，好氧。 平板：黄色粘稠菌落，液体培养形成粘稠状胶状物。 其他黄单胞菌：菜豆黄单胞菌、锦葵黄单胞菌和胡萝卜黄单胞菌等。,2.培养基 （1）碳源：葡萄糖(国外),淀粉(国内)。 （2）氮源：易利用有机氮（鱼粉和豆粉）， 不易利用无机氮。 （3）无机盐：K2HPO4、MgS

11、O4.7H2O、轻质 CaCO3对发酵有明显的促进作用。 还有Fe2+、Mn2+、Zn2+等微量元素。 （4）其他：促进剂谷氨酸、柠檬酸等。,南开-01菌种所用摇瓶发酵培养基： 玉米淀粉4%，鱼粉蛋白胨0.5%， 轻质碳酸钙0.3%，自来水配制，pH7.0。,3. 培养条件 （1）摇瓶发酵 接种量1%5% 转速220r/min 28 72h 产胶2030g/L，碳源转化率60%70%。,（2）工业化生产 温度：2528 pH: 6.57.0 高通气量： 10.6m3/（m3min) 高碳氮比,周期：7296h 前18 h：对数生长期，不合成胞外多糖； 1848 h：平衡生长期，多糖合成迅速，菌

12、体出现荚膜并且越来越厚； 48 h：菌体进入衰老期，多糖产量趋于稳定。发酵周期为72 h左右，产量最高可达28 g/L，,氮源对黄胶合成的影响： 易利用有机氮源，不易利用无机氮源。 起始较低浓度氮源： 氮源浓度提高细胞浓度增加合成速率加快得率提高,起始中等浓度氮源： 细胞浓度提高 中等浓度氮源 发酵时间缩短 合成速率提高 得率降低 原因：细胞生长过快，用于细胞生长及维持细胞生命的糖量增加，用于合成黄原胶的糖反而减少，导致黄原胶得率下降。,发酵后期流加糖：使糖浓度始终维持在一定的水平，补加的糖只用于细胞维持生命及合成黄原胶，而没有生长的消耗，得率就可比间歇发酵有较大提高。,起始高浓度氮源： 细胞

13、浓度增加 高浓度氮源 得率降低 合成速率降低 原因：“氧限制”。高浓度细胞随着发酵的进行，发酵液粘度不断增大，体积传质系数降低，造成氧供应能力逐渐下降，合成速率变慢，得率降低。,高粘度发酵液影响供氧，解决方法： 提高搅拌转速 a.改进发酵设备，提高供氧能力 提高通气速率 b.限制细胞浓度，控制氧的需求量补料分批 培养（后期流加糖）。,四、黄原胶的提取 1.发酵液处理 经离心法、过滤法、酶处理法、次氯酸盐氧化法、过滤及超滤浓缩法预处理除去菌体细胞和各种不溶性杂质。,2.沉淀反应 用钙盐、铝盐、季铵盐或酸沉淀法制取工业级精制品；用有机溶剂沉淀法制取食品级精制品。 （1）钙盐法,（2）有机溶剂沉淀法

14、 发酵液乙醇 黄原胶沉淀（工业级黄原胶） 酸化 （酒精+KOH）洗涤干燥粉碎 成品 离心除菌体，多次用酒精沉淀、洗涤，得食品级黄原胶。,（3）钙盐工业酒精沉淀法 酸性乙醇 黄原胶CaCl2 黄原胶钙沉淀 黄原胶Ca2+ 酸化 成品粉碎干燥洗涤（酒精+KOH） 特点： 有机溶剂用量减少一半，但在成品中带入了钙离子。,五、黄原胶的干燥 1.主要干燥方法 真空干燥 滚筒干燥：设备复杂，工业应用少 喷雾干燥：黄原胶溶解性差 流化床干燥：传热传质快，常用该法。 气流干燥,2.不同级别黄原胶的制备 发酵液 灭菌 干燥 工业粗制品级 超滤脱盐 干燥 工业精制品 酶处理 超滤浓缩 干燥 食品级,六、工艺流程 斜面种子 一级种子 二级种子 罐发酵 提取 离心 烘干 磨碎 过筛 产品,