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1、细胞培养基础,主要内容,1.细胞原代传代培养概念及培养细胞的应用 2.细胞培养的条件及环境 3.体外培养细胞类型及形态 4.细胞培养基本技术 5.细胞原代培养方法 6.培养细胞活性测定 7.细胞传代培养方法、细胞保存,细胞原代传代培养概念及培养细胞的应用,Wilhelm Roux (1850-1924 ),1885年Roux最早尝试使组织离体培养，材料是鸡胚神经板，采用生理盐水为培养液，并首次采用组织培养这个术语。,前 言,Alexis Carrel France Rockefeller Institute for Medical Research New York, NY, USA b. 1
2、873 d. 1944,1907年Harrison 和1912年Carrel开始把组织培养作为一种方法，用于研究离体动物细胞的培养。 他建立的鸡胚胎成纤维细胞持续了34年之久(1912-1946),One of Carrels D-flasks which were manufactured from PYREX glass,细胞培养的条件及环境,- 营养条件 - 无菌环境 - 恒定温度 - 气体 - PH值,无菌条件：净化工作室，风淋室，传递窗，高效过滤器，洁净层流罩，生物安全柜，超净工作台，紫外灯，电热干燥箱，滤器，高压灭菌器，抗生素 细胞生长条件：纯水蒸馏器，纯水仪，培养板，培养瓶，CO
3、2培养箱，培养基，血清 细胞检测条件：倒置显微镜，酶标仪，微孔板震荡器，高速离心机，移液器 细胞保存条件：液氮罐 实验室安全：,超净工作台,超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气通过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。,紫外灯：紫外线消毒。主要用于培养室空气、操作台、塑料培养皿和培养板等表面消毒 紫外灯大约分为3种，分别是UVA、UVB和UVC。UVC是目前工业上所应用的紫外线杀菌灯(253.7nm)，是最常见的一种。高功率紫外线灯经8000小时，一般紫外线灯则在3000小时後功率会降至原来70，这时就应该更换。国内的标准是：30W
4、新灯管的辐射强度90uw/cm2为合格；使用中辐射强度应70uw/cm2。少于此标准就要更换。,大容量高压灭菌器,手提式高压灭菌器,滤菌器,培养器材,CO2培养箱,自动双重纯水蒸馏器 纯水仪,液氮罐,培养细胞的生长条件,细胞培养用液的配制,水：新鲜的三蒸水或去离子水,培养基：,合成培养基：,合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如M199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。 合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。 优点：标准化生产，组分和含量相对固定。成本低。缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细
5、胞生长需要。,抗菌素的使用：,在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长。 通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。 庆大霉素：每毫升100单位方便、广谱、稳定。,完全培养基的组成,培养基的配制,平衡盐溶液 主要用于作为稀释和灌注的液体，维持细胞渗透压，提供缓冲系统，使培养液的酸碱度维持在培养细胞生理范围内，提供细胞正常代谢所需的水分和无机离子等。 常用的有PBS，Hanks等。,其它添加成分 缓冲系统，常用为HEPES（N-2-hydroxy-ethylpiperazine-N-ethanesulfonic acid），缓冲
6、效能(pKa)在20时为7.55，37为7.31； HEPES不是起维持pH恒定的作用，而是起恒定和抵抗快速pH变化的，所以调整pH常常用NaHCO3溶液。,有机补充物，如丙酮酸钠， 谷胺酰氨等。 促细胞分裂因子，如生长因子类的FGF(成纤维细胞生长因子)，EGF(表皮生长因子)。 贴壁和铺展因子，如胶原蛋白，纤粘蛋白等。 可根据培养细胞的特殊要求进行添加。,（一）贴壁型：大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞，判断细胞形态时不能按照体内组织学标推判定，仅大致分成以下四型： -成纤维细胞型 -上皮型细胞 -游走细胞型 -多型细胞型,体外培养细胞的形态,名称：凡在培养中形态与成纤维细胞类似的
7、来源：由中胚层间充质组织起源的组织如：真正的成纤维细胞，心肌，平滑肌，成骨细胞，血管内皮 形态：似体内成纤维细胞的形态，胞体梭形或不规则三角形，胞质向外伸出23个长短不等的突起，中有卵圆形核 生长特点：排列成放射状，漩涡状，并不紧靠连成片，细胞细胞接触易断开而单独行动，游离的单独的成纤维样细胞，常有几个伸长的细胞突起,成纤维细胞型,成纤维细胞 心肌细胞,2、上皮型细胞： 细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。生长时呈膜状移动，处于膜边缘的细胞总与膜相连，很少单独行动。起源于内、外胚层的细胞如皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、肝、胰、肺泡上皮等皆成上皮型形态。,名称：仅形
8、态上似体内，实际上不完全相同 来源：来源于外胚层、内胚层细胞, 如：皮肤及其衍生物,消化道，乳腺，肺泡, 上皮性肿瘤 形态：类似体内的上皮细胞扁平，不规则多角形，中有圆形核 生长特点：易相连成片，相靠紧密相连成薄层铺石状生长时呈膜状移动，很少脱离细胞群而单个活动,上皮型细胞,3、游走细胞型： 呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。 4、多型细胞型： 有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和稳定的形态，可统归于此类。,多型细胞型,游走细胞型,（二）悬浮型： 见于少数特殊的细胞，如某些类型的癌细胞及白血病细胞。胞体圆形，不贴
9、于支持物上，呈悬浮生长。这类细胞容易大量繁殖。,概念：培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长 或以机械方法使保持悬浮状态下生长 来源：自血，脾或骨髓，尤以血中白细胞癌肿 细胞也可能 特点： 在悬浮中生长良好细胞圆形，单个或小 细胞团 优点： 生存空间大，提供数量大，传代方便(不 需消化)，易于收获，可获得稳定状态缺 点：观察不方便，很多细胞不能悬浮生 长(尤以正常细胞),细胞培养条件,细胞洁净间 实验设备 手术器械 玻璃器材,细胞原代培养方法,- 组织块消化法 - 直接贴壁法,培养细胞活性测定,台盼蓝排斥法 FDA-PI双色荧光检测法 MTT法,方法： 1、将细胞悬液以0.5ml加入试管中； 2、
10、加入0.5ml 0.4%台盼兰染液，染色2一3分 钟； 3、吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片； 4、镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力；死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。活力测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用。,台盼蓝法,台盼蓝法,FDA-PI双色荧光检测法,在蓝色光激发下( 495nm ), 活细胞被双醋酸荧光素FDA 染成亮绿色, 死亡细胞被碘化丙锭PI染成红色。,四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝； MTT比色法的原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物(formazan,
11、甲攒)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值； MTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒性试验、肿瘤放射敏感性实验等。,四唑盐（MTT）比色法,细胞传代培养方法,细胞消化 细胞传代方法 细胞保存,细胞冻存和复苏,细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少入力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。,冻存和复苏的原则：慢冻快融,当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。 如果缓慢冷冻，
12、可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反，冰晶很大，大冰晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。,慢冻程序,标准程序： 当温度在-25以上时，12/min 当温度达-25以下时，510/min 当温度达-100时，可迅速放入液氮中 简易程序： 将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降12的速度，在40分钟内降至液氮表面，停30分钟后，直接投人液氮中。,低温保护剂的应用,在细胞冻存时加入低温保护剂，能大大提高冻存细胞存活率。 常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂
13、，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。,细胞冻存方法,1.预先配制冻存液：含20%血清培养基，10% DMSO，DMSO液用培养液配好，避免因临时配制产热而伤害细胞； 2.取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液,用吸管吹打制成细胞悬液（1106 5 106细胞/ml)； 3.加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。,Mr Frosty,细胞复苏方法,（1）从液氮中取出冷冻管，迅速投入3840水 浴中，使其融化（1分钟左右） （2) 尽快(5分钟内)用培养液稀释至原体积的10倍 以上； （3）低速(1000rpm)离心5-10分钟； （4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。,细胞计数,实验中通常需要进行细胞计数 计数结果以每毫升细胞数表示 细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同 血球细胞计数板 Coulter计数仪,血球细胞计数板,谢谢 !,