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1、2019/8/17,1,第一篇 微生物学基础,第八章 病原学诊断与防治 Laboratory Diagnosis and Prevention Principles 第一节 细菌学诊断 第二节 病毒学诊断 第三节 真菌学诊断 第四节 特异性预防与治疗,2019/8/17,2,Outline,Laboratory diagnosis for bacterial infections Morphological - microscopic Molecular Serological Laboratory diagnosis for viral infections Morphological -
2、electron microscopic Isolation Molecular: nucleic acids and proteins Serological Laboratory diagnosis for fungal infections Morphological - microscopic Isolation,2019/8/17,3,2019/8/17,4,Assays,Morphological assays Light or electron microscopies Isolation and differentiation Serological assays Antige
3、n-antibody assays Molecular assays Microorganisms gene (DNA & RNA),2019/8/17,5,Principles for Specimen Collection,Sterile manipulation, avoid contamination Obtain a specimen from the infected site according to the disease phase before administrating antibiotics Double sera for antibody detections, a
4、cute and recovery phase each Positive if the titer of the later specimen is above 4X to the first specimen Transport, and store correctly as soon as possible Store at -4oC for most bacterial specimens, but keep warm for Neisseria meningitidis and Neisseria gonorrhoeae Store at -4oC -70oC for viral s
5、pecimens,2019/8/17,6,Laboratory Diagnosis for Bacterial Infections,Morphological Protein and Nucleic acids Antibody,2019/8/17,7,标本的采集和送检六原则,无菌取材,避免杂菌污染,不同期不同标本,用抗生素以前,采集病变明显部位,运送注意保存,标本必须新鲜,2019/8/17,8,病原菌的检查程序,药物敏感试验,标本,直接涂片镜检,分离培养,生化试验,血清学试验,动物试验,明确诊断,初步诊断,分子生物学技术,其他检测技术,2019/8/17,9,Bacteriologica
6、l Diagnosis,Identifying the organism Morphological Isolation & culture Biochemical reaction Serological assays,Pathogenesis & antibiotics susceptibility Animal experiment Virulence test antibiotics susceptibility,2019/8/17,10,Morphological,Non-stained microscopic observation Dark-field microscopy Ob
7、serving the movement of live bacteria Stained microscopic observations Gram stain Acid-fast stain Fluorescence stain,2019/8/17,11,2019/8/17,12,2019/8/17,13,2019/8/17,14,2019/8/17,15,2019/8/17,16,2019/8/17,17,Isolation & Culture: Colony,Size Shape Color Surface features Smooth - Rough Transparency He
8、molysis,2019/8/17,18,2019/8/17,19,2019/8/17,20,分离培养 isolation and cultivation,分离培养是微生物学诊断的金标准，是最可靠的传统诊断技术。 （图为普通培养箱）,2019/8/17,21,厌氧罐 厌氧袋,2019/8/17,22,Biochemical Reactions,Sugar Fermentation H2S Test Citrate utilization,2019/8/17,23,Serological Assays,Detection antibody in the patients serum A curr
9、ent infection should be IgM positive A 4-fold or greater rise on antibody titer between the acute serum sample and the convalescent serum sample Major drawbacks A single IgG antibody titer is difficult to interpret because it is unclear whether it represents a current or a previous infection the con
10、valescent sample is usually taken 10-14 days after the acute sample. By this time, the patient has often recovered and the diagnosis becomes a retrospective one Some exceptions In certain diseases, a single titer of sufficient magnitude can be used as presumptive evidence of a current infection,2019
11、/8/17,24,基本原则 用已知抗体检测未知抗原； 用已知抗原检测未知抗体。 最简易的方法有玻片凝集等试验。 常用的方法有：凝集试验、沉淀试验、补体结合试验、ELISA、免疫荧光等。,免疫学试验,2019/8/17,25,Animal experiment,Animals Mouse Guinea Pig Rabbit Dog Monkey Inoculation routes Intradermal Subcutaneous Intraperitoneal Intravenous Intracranial / intracerebral Intraspinal Intranasal Lav
12、age,2019/8/17,26,Virulence Test,Median lethal dose, LD50 Median infective dose, ID50 Elek Plate Diphtherotoxin Corynebacterium diphtheriae Enterotoxin enterotoxigenic E. coli,2019/8/17,27,Antibiotic Susceptibility Test,Method,2019/8/17,28,MIC & MBC,Minimum Inhibitory Concentration，MIC Minimum Bacter
13、icidal Concentration，MBC Bactericidal drugs usually have an MBC equal or very similar to the MIC Bacteriostatic drugs usually have an MBC significantly higher than the MIC,2019/8/17,29,2019/8/17,30,Bacterial Proteins, DNA & RNA,Antigens (Proteins) Known antibodies Agglutination, coagulation, precipi
14、tation, ELISA, Immunofluorescence, radioimmunoassay DNA & RNA PCR Nucleic acid hybridization,2019/8/17,31,Detection of Bacterial Antigens,Precipitation test Coagglutination test Immunoflorecence, IF McAb technique,2019/8/17,32,2019/8/17,33,2019/8/17,34,Bacterial DNA & RNA,PCR DNA probe & hybridizati
15、on DNA hybridization (southern blot) Plasmid fingerprint analysis Restrict multimorphologic analysis,2019/8/17,35,2019/8/17,36,2019/8/17,37,PCR,2019/8/17,38,分子生物学技术 molecular biological techniques,核酸杂交 nucleotide hybridization 原位杂交 in situ hybridization 斑点杂交 dot blot Southern blot Northern blot PCR
16、技术：多聚酶链反应 (polymerase chain reaction，PCR ),2019/8/17,39,PCR 是一种无细胞的分子克隆 技术，能在体外将一个基因或 一段DNA 序列经过多次循 环的DNA复制，在数小时内扩 增上百万倍。既便于基因诊断，又利于 研究。,2019/8/17,40,2019/8/17,41,Gene Chip / microarray,2019/8/17,42,Diagnosis Strategy for Bacterial Infection,2019/8/17,43,第25章 病毒感染的诊断 P238 Laboratory Diagnosis for Vi
17、ral Infection,Morphological Isolation & Culture Protein & Nucleic acids Serological,2019/8/17,44,病毒感染的检测,一、标本的采集与运送,急性期标本； 根据感染性质取不同的标本； 标本置于转运液中； 冷藏快运。,2019/8/17,45,Morphological,Electron microscopy, EM Immunoelectron microscopy, IEM Light Microscopy Inclusion body Negri body,2019/8/17,46,2019/8/17
18、,47,二、病毒分离培养 病毒分离的一般程序是,接种易感动物 出现症状 血清学 检测标本 杀灭杂菌 鸡胚 病变或死亡 鉴定 细胞培养 细胞病变,2019/8/17,48,Isolation and Culture,Animal inoculation Chicken egg culture: 914 days Tissue culture Organ culture Tissue culture Cell culture,2019/8/17,49,Cell culture,2019/8/17,50,2019/8/17,51,Type of Cultured Cells,Primary cell
19、 culture Passage 2-3 generations Diploid cell culture 2-fold chromosomes, Passage 50100 generations, safe, can be used for vaccine manufacture Continuous cell line culture Mutant diploid cells, mostly tumor cells, easy to passage and maintain Not sensitive as diploid cells, may have endogenous virus
20、es, can not be used for vaccine manufacture,2019/8/17,52,Indications of Viral Propagation,Cytopathic effect, CPE Hemadsorption Hemagglutination Viral interference Neutralization test, NT,2019/8/17,53,2019/8/17,54,2019/8/17,55,（1）原代细胞培养： 动物或人组织直接用蛋白酶消化所得的细胞 经体外培养后可贴壁或悬浮生长。 （2）二倍体细胞株： 在体外连续培养5060代仍保持其
21、二倍染色体数目的单型细胞。,为生产人用疫苗的首选细胞株。,（3）传代细胞系 能在体外连续传代、来自癌细胞或发生自发转 化、突变的原代细胞或二倍体细胞株。,2019/8/17,56,临床病毒实验室常用的细胞培养,2019/8/17,57,识别病毒增殖的方法 （1）细胞病变效应（CPE）：溶细胞型病毒感染细胞后，可出现细胞团缩、裂解或细胞肿大、数个细胞融合成多核巨细胞或细胞聚集成葡萄串状、脱落或死亡等。,2019/8/17,58,epithelial cells - adenovirus,uninfected,early infection,late infection,2019/8/17,59,
22、Negri Body,2019/8/17,60,（2）红细胞吸附：流感病毒和某些副粘病毒感染细胞后2448小时，细胞膜上出现病毒的血凝素，能吸附豚鼠、鸡等动物及人的红细胞，发生红细胞吸附现象。 （3）干扰现象,2019/8/17,61,病毒量测定 （1）测定病毒数量可用空斑形成单位（PFU）表示。一个空斑是标本中一个病毒大量复制所致，有感染性的病毒经适当稀释后接种于单层细胞，由于单个病毒的复制增殖使局部单层细胞脱落，此即空斑。经染色后空斑可用肉眼观察，计算空斑数即可计数病毒数量。,2019/8/17,62,PLAQUE ASSAY,PLAQUE ASSAY,2019/8/17,63,PLAQU
23、E ASSAY,PLAQUE ASSAY,2019/8/17,64,2019/8/17,65,三、光学显微镜和电子显微镜 1、光学显微镜：观察病毒的包涵体,2019/8/17,66,2、电子显微镜：直接观察病毒,2019/8/17,67,Viral Quantity Determination,TCID50 50% tissue culture infectious dose Determine the infectivity of the examined viruses PFU Plaque formation pfu/ml Precisely quantitate the number
24、of the living viral particles,2019/8/17,68,2019/8/17,69,Plaque,2019/8/17,70,Differences between viral particle (VP), plaque formation unit (PFU),Viral particles (VPs) represent the total number of viral particles (live and dead combined). Due to variations in virus preparations the ratio of live/dea
25、d varies significantly and therefore, VP does not reflect the amount of active virus in the preparation PFU (plaque formation unit) represents the number of infectious or live viruses. It reflects the amount of working viruses in the preparation For most virus preps, the VP/PFU ratio is 20:1 to 50:1
26、 Which one better reflects the amount of active virus used? Using VP (viral particles) as the unit will result in significant variations in the amount of actual live viruses used, and using IFU or PFU as the viral unit will give more consistent outcomes.,2019/8/17,71,Proteins and Nucleic Acids,Prote
27、ins (antigens) Fluoresece-labeled, enzyme-labeled (enzyme linked immunosorbent assay, ELISA) and radio-labeled anitbodies Viral DNA or RNA Gene chip DNA chip / cDNA Microarray,2019/8/17,72,Virus-specific Antibodies,Neutralization test, NT Hemagglutination inhibition test, HI Complement fixation, CF
28、ELISA Western blot,2019/8/17,73,三、病毒感染的血清学诊断方法 P240 1、中和试验 2、补体结合试验 3、红细胞凝集和凝集抑制试验,病毒抗体 失去感染性,恢复期/早期 4:1，有诊断意义。,2019/8/17,74,ELISA for HIV antibody,Microplate ELISA for HIV antibody: coloured wells indicate reactivity,2019/8/17,75,2019/8/17,76,Diagnosis Strategy for Viral Infection,2019/8/17,77,Rapi
29、d Diagnosis for Viral Infection,Morphological EM & IEM, occasionally Light Microscopy: inclusion body Viral antigens Immunofluorescence Radioimmunoassays ELISA Specific antibodies: IgM Nucleic acids: PCR,2019/8/17,78,小 结,细菌感染的微生物学检查法 病原体检查 核酸的检测 抗原、抗体的检测 病毒感染的微生物学检查法 电镜及免疫电镜 病毒的分离培养和鉴定 核酸的检测 抗原、抗体的检
30、测 真菌感染的微生物学检查法 直接镜检 真菌的分离培养,2019/8/17,79,第四节 特异性预防与治疗 Prevention Principles,2019/8/17,80,特异性免疫的分类,自然免疫 Natural Immunization 自然主动免疫：隐性或显性感染 自然被动免疫：通过胎盘或初乳获得母体抗体 人工免疫 Artificial Immunization 人工主动免疫：接种疫苗或类毒素等 人工被动免疫：注射抗毒素或丙种球蛋白等,2019/8/17,81,一、人工免疫(artificial immunization),用人工的方法给机体输入抗原性物质（如疫苗、类毒素等）或直接
31、输入免疫效应分子（如抗体、细胞因子等），使机体获得特异性免疫力的方法。 人工主动免疫 artificial active immunization 人工被动免疫 artificial passive immunization,2019/8/17,82,人工免疫：采用人工方法将疫苗、类毒素等或含有某种特异性抗体、细胞免疫制剂等接种于人体，以增强宿主体的抗病能力。,人工自动免疫 artificial active immunization 疫苗（vaccine） 类毒素,人工被动免疫 artificial passive immunization 抗毒素 抗菌血清 血清丙种球蛋白,2019/8/1
32、7,83,人工自动与被动免疫比较,2019/8/17,84,生物制品(biological products)：人工免疫的免疫原、免疫血清、细胞制剂及诊断制剂的生物性制剂。,人工主动免疫生物制品 疫苗 类毒素 人工被动免疫生物制品 抗毒素 丙种球蛋白,2019/8/17,85,疫苗（vaccine）,减毒活疫苗（attenuated live vaccine） 卡介苗（BCG） 灭活疫苗（inactivated vaccine） 伤寒沙门菌与甲、乙型副伤寒沙门菌混合的三联疫苗 亚单位疫苗（subunit vaccine） 基因工程疫苗（gene engineered vaccine） 核酸疫苗
33、（nucleic acid vaccine）,2019/8/17,86,2019/8/17,87,2019/8/17,88,类毒素（toxoid）,细菌外毒素经0.4甲醛液处理后，其毒性消失而仍保留抗原性的生物制品 常用的类毒素 白喉类毒素 破伤风类毒素等 白、百、破三联疫苗,2019/8/17,89,人工被动免疫生物制品,抗毒素（antitoxin） 通常是用细菌类毒素给马多次注射后，取其免疫血清提取免疫球蛋白精制而成 常用 破伤风抗毒素 白喉抗毒素 免疫球蛋白（immunoglobulin）,2019/8/17,90,人工主动免疫病毒疫苗,减毒活疫苗（attenuated live vac
34、cine） 灭活疫苗（inactivated vaccine） 亚单位疫苗（subunit vaccine） 基因工程疫苗（gene engineered vaccine） 基因工程亚单位疫苗（gene engineered subunit vaccine） 基因工程载体疫苗（gene engineered vectored vaccine） 基因缺失活疫苗（gene deleted live vaccine） 核酸疫苗（nucleic acid vaccine）。 合成肽疫苗（synthetic peptide vaccine） 抗独特型疫苗（anti-idiotype vaccine）,2
35、019/8/17,91,活疫苗（Living vaccine）,减毒活疫苗 基于基因工程技术的新型活疫苗 遗传重组活疫苗 基因缺失活疫苗 载体活疫苗,2019/8/17,92,减毒活疫苗(Attenuated vaccine),自然或人工选择法（如Ts株）对人低毒或无毒的变异株，如脊灰、流感、麻疹的减毒株。 优点：模拟自然感染，免疫效果好，局部IgA。 理论上的缺点，实际工作中少见 变异株可能回复到有毒力的野生株 如果机体免疫缺陷，减毒株仍可能引起感染或并发症 可能激活机体内其他病毒的感染 减毒活苗可能引起持续感染 成功的范例：1961年我国应用脊灰疫苗，脊灰发病率大幅度下降。1980年天花病
36、毒灭绝。,2019/8/17,93,遗传重组疫苗,将野毒株表面抗原基因与弱毒株其他基因组合而获得减毒活病毒。 适用于基因组分节段双链RNA病毒，如流感病毒、轮状病毒等。,2019/8/17,94,基因缺失活疫苗,利用DNA重组技术，定向缺失病毒基因组的某一区段，使病毒丧失毒力而保留增殖能力和免疫原性。 优点：疫苗株的遗传背景清楚，不易突变回到野毒株。,2019/8/17,95,载体活疫苗,利用DNA重组技术，将编码病毒抗原的基因插入到另一无毒力的载体病毒，使之高效表达 易建立多价疫苗 载体病毒常用的有痘苗病毒、腺病毒、HSV-1,2019/8/17,96,灭活疫菌（Killed vaccine
37、）,灭活全病毒疫苗 亚单位疫苗 合成肽病毒疫苗 基因工程疫苗 独特型病毒疫苗 核酸疫苗,2019/8/17,97,灭活全病毒疫苗,物理或化学方法灭活病毒。适用烈性或易变异病毒如乙脑病毒、狂犬病病毒、流感病毒。 优点：生产简单、易保存运输 缺点 需要大量培养病毒，成本高 无局部抗体，不激活CTL，可激活TDTH 甲醛灭活的麻疹病毒和RSV疫苗可加重疾病，机制不详,2019/8/17,98,亚单位疫苗（Subunit）,种类 化学方法制备：如HBsAg和流感HA 基因工程亚单位疫苗 优点 不含病毒核酸，仅有能诱导中和抗体的衣壳蛋白或包膜表面抗原。免除了回复突变和交叉复活的可能。 消除肿瘤病毒的潜在
38、的致癌作用。,2019/8/17,99,合成肽病毒疫苗,人工合成病毒保护性抗原决定簇肽段。 优点 制备容易，可大量生产，易保存，副作用少 理论与实践上的缺点 免疫原性弱，使用时需要加佐剂。 不同肽免疫活性有差异。 部分肽只激发B细胞表位，缺乏激发TH细胞的表位。,2019/8/17,100,基因工程疫苗,利用DNA重组技术制备的生物制品。如将编码病毒特异抗原的基因用适当的载体将此基因带入大肠杆菌或真核细胞，使之表达。 研发成本高，生产成本低，下游工程复杂。,2019/8/17,101,核酸疫苗,将病毒基因导入DNA载体（通常是带有真核表达调控基因的质粒或病毒），将重组DNA导入机体，重组DNA
39、可以在细胞的转录和翻译系统表达出目的蛋白。 优点：同时刺激产生体液和细胞免疫，能诱导CTL活性，易生产，易保存。 理论上缺点：安全性尚待考察。 目前仅在实验研究中，尚未投放市场。,2019/8/17,102,独特型病毒疫苗（Idiotype）,基于Jerne的免疫网络学说，内影像组抗体中含有与抗原一致的表位序列，又称抗独特型抗体疫苗 特别适合于 不能培养或培养困难、产量极低的病原体 直接用病病制备有潜在危险的，如Retrovirus 免疫原性弱，且不能用重组技术生产的抗原,2019/8/17,103,2019/8/17,104,人工被动免疫预防,胎盘丙种球蛋白 人血清丙种球蛋白 特异性免疫球蛋
40、白 乙型肝炎免疫球蛋白,2019/8/17,105,第三节 病毒感染的治疗 P243,化学药物 基因制剂 天然药物,2019/8/17,106,抗病毒化学药物机制,阻断病毒脱壳 阻断病毒核酸合成 核苷类似物(nucleoside analogue)、核苷酸类似物(nucleotide analogue)和非核苷类似物。 主要应用于疱疹病毒、逆转录病毒 阻断病毒蛋白质合成 阻断病毒释放,2019/8/17,107,抗病毒化学药物作用的靶位点,2019/8/17,108,阻断病毒核酸合成的药物,核苷类似物（nucleoside analogue） 核苷酸类似物（nucleotide analogue） 非核苷类似物 主要应用于疱疹病毒、逆转录病毒,2019/8/17,109,阻断病毒核酸合成的药物,2019/8/17,110,抗真菌药物的种类和抗菌谱,2019/8/17,111,真菌感染预防,无特异性的相应疫苗 真菌的表面抗原性弱，无法制备有效的预防性疫苗 皮肤癣菌感染 注意皮肤卫生；保持鞋袜清洁、干燥；避免与患者及其污染的物品直接接触 深部真菌感染 提高机体的免疫力 真菌性食物中毒 严禁销售和食用发霉的食品,2019/8/17,112,五、真菌感染的防治原则,卫生、干燥、消毒（福尔马林） 避免直接或间接与患者接触 局部感染治疗：外用药 系统感染治疗：口服,