酶学概论1.ppt

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1、第一章 酶学概论 第一节 酶作为生物催化剂的显著特点 一催化能力 酶促催化效率是一般无机催化剂的1061013倍。,二专一性 绝对专一性 化学结构专一性 族专一性 (基团专一性) 相对专一性 键专一性 旋光异构专一性 立体异构专一性 几何异构专一性,三. 反应条件 温和，常温常压下进行。 四. 酶的活性是受调节控制的 （一）通过影响酶蛋白的量影响酶的活性 1.代谢物 组成酶：细胞中含量较为稳定，不受代谢物影响。 诱导酶：细胞接触到诱导物后产生，诱导物往往是该 酶的底物或底物类似物。 2. 同工酶： 能催化相同的化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构 组成不同的一组酶。,3.酶的降解 当生物体已经完

2、成了某一发育过程，或者酶分子的结构发生了改变而使其稳定性下降，这些酶都会被降解。 （二）通过改变酶分子的结构或酶蛋白亚基之间的结合状态而影响酶的活性 1. 别构调节 2. 激素调节,修饰亚基的水平是由激素控制的。妊娠时，修饰亚基在乳腺生成。分娩时，由于激素水平急剧的变化，修饰亚基大量合成，它和催化亚基结合，大量合成乳糖。,如乳糖合酶 催化亚基：催化反应半乳糖+蛋白质糖蛋白 修饰亚基：与催化亚基结合后改变其专一性，催化 UDP-galactose+D-glucose UDP+lactose,3.共价修饰调节 比较普遍的方式是通过磷酸化与去磷酸化。最典型的例子是动物组织的糖原磷酸化酶，它催化如下反

3、应： （葡萄糖）n+Pi（葡萄糖）n-1+1-磷酸葡萄糖,共价修饰调节：通过其它的酶对其结构进行共价修饰，从而使其在活性形式和非活性形式之间相互转变。,肾上腺素启动肝细胞中由催化剂活化催化剂的反应，最终引起细胞信号的放大。少量的肾上腺素与细胞表面的肾上腺素受体结合活化了腺苷酸环化酶生成cAMP，继而活化蛋白激酶A (protein kinase A, PKA)，PKA再使无活性的磷酸化酶b激酶活化，磷酸化酶b激酶再使无活性的糖原磷酸化酶b活化为有活性的糖原磷酸化酶a，后者催化糖原分解。X代表作为起始信号的肾上腺素分子数，x前面的数字代表每步反应所活化的分子数。,MAPK活化的促进细胞分裂的蛋白

4、激酶 TF转录因子 Ras, Rac小G蛋白,蛋白质（酶）的磷酸化与去磷酸化在细胞信号转导中起着主要作用。,据估计，真核生物有1/3的蛋白质都受到由蛋白激酶(protein kinase)和磷酸酶(phosphatase)作用所介导的可逆磷酸化作用调节。 蛋白质磷酸化可以调节酶的活性，蛋白构象，并影响蛋白质蛋白质之间的相互作用，以及改变蛋白质在细胞内的定位以及稳定性。 From: Pesaresi P et al. (2011) Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1807: 887896,根据发生磷酸化的氨基酸残基的种类不同，蛋白激酶可以

5、分为丝氨酸/苏氨酸激酶，酪氨酸激酶和组氨酸激酶。 有的蛋白激酶具有双重底物特异性。 共价修饰酶除了磷酸化和脱磷酸化调节酶外，还有腺 苷酰化与脱腺苷酰化调节酶、尿苷酰化与脱尿苷酰化调节酶等类型。,4限制性蛋白水解作用与酶活性控制。如酶原激活。 5抑制剂和激活剂的调节。 6反馈调节：催化某物质生成的第一步反应的酶的活 性，往往被其终端产物所抑制。这种对自我合成的 抑制叫反馈抑制。,A-J：代谢物 实线箭头：酶促催化步骤 虚线箭头：反馈抑制步骤 代谢途径的第一步和共同底物进入分支途径的分支点是反馈抑制的最为重要的位点。,7金属离子和其它小分子化合物的调节。 8蛋白质剪接 一个单一的前体蛋白通过剪接机

6、制可以产生多种蛋 白质（酶）分子，从而具有不同的功能或活性。 蛋白质剪接中，被切去的肽段称为内含肽(intein )， 连接起来形成成熟蛋白质的肽段称为外显肽(extein)。 先前认为蛋白质剪接是由内含肽所介导的，但现在否 认了这一看法。因此对蛋白质剪接的机制目前仍然是 不清楚的。,*酶活性的表现不仅需要一定的结构基础，而且是一个由基因决定的，受到多重调控的复杂过程。而其中酶的生物合成是一个关键，这一过程又受遗传基因及代谢物的双重控制。遗传基因的存在是形成酶的内在原因及根据。但是，酶的形成还受到代谢物（酶反应的底物、产物或它们的类似物）的调节与控制，从而最终决定酶的生成数量及速度。,此外，酶

7、的区室化(compartmentation)和多酶复合体 等都和酶活力的调节控制有密切联系。,第二节 酶的组成、分类和命名 一酶的组成 （一）根据酶的化学组成 单纯酶 酶蛋白 结合酶 辅因子 （二）根据酶蛋白的特点及分子大小 1单体酶：只有一条多肽链，分子质量为1335 ku， 为数不多，且都是水解酶；,2寡聚酶：由若干相同或不同亚基非共价结合而组成的 酶，亚基一般无活性，必须相互结合才有活性，分子 质量为35 ku以上到数百万单位； 1）含相同亚基的寡聚酶。比较重要的有下面两类 a多催化部位（寡聚）酶：由相同亚基组成，每个亚基 上都有一个催化部位，但无调节部位。这类酶的游离 亚基无活性，必须

8、聚合成寡聚酶才有活性； b可调节酶：主要是指别构酶和共价调节酶。,2）含不同亚基的寡聚酶： *寡聚酶中亚基的聚合作用，有的与酶的专一性有关， 有的与酶活性中心的形成有关，有的与酶的调节性能 有关。大多数寡聚酶，其聚合形式是活性型，解聚形 式是失活型。 3多酶复合体（multienzyme complex）：多种酶进行 连续反应的体系。 4多酶融合体 (multienzyme conjugate) (杂合酶) 一条多肽链上含有两种或两种以上催化活性的酶，它 往往是基因融合的产物。,二酶的命名 1推荐名：以习惯名为基础 （酶的来源或性质）+底物名称+催化反应的类型 （水解反应可省去“水解”二字）

9、特点：比较简单，便于使用。 2系统名 酶的作用底物（底物之间用“：”隔开）+酶作用的基 团+催化反应的类型 特点：严格，但更为详细准确地反映出酶所催化的反 应。,如： COO- CH3 COO- CH3 | | | | (CH2)2 + C=O (CH2)2 + C-N+H3 | HC-N+H3 COO- C=O COO- | | COO- COO- 推荐名：谷丙转氨酶 系统名：谷氨酸：丙酮酸氨基转移酶,三国际系统分类法及编号 六大蛋白类酶 氧化还原类酶AH2+BA+BH2 转移酶AB+CA+BC 水解酶ABH2OAOH+BH 裂合酶ABA+B 异构酶 连接酶或合成酶A+B+ATPABADP+

10、Pi（或AB AMP+PPi）,两个比较容易混淆的酶 1）氧化磷酸化与光合磷酸化中，以跨膜质子动力势为动力推动ATP形成的酶是ATP合成酶还是ATP合酶？ 催化的反应：ADP+PiATP 合成酶：synthetase; 合酶：synthase 2）DNA (RNA)聚合酶属于六大类酶中的什么类型？ 催化的反应：dATP+DNA DNA-dAMP+PPi,DNA聚合酶,Mg2+,第三节 酶的活力测定 一酶活力：在一定条件下，酶所催化的化学反应速 度，它可以用单位时间内底物的减少量或产物的 增加量表示。 二酶活力测定方法 注意事项： 1底物及底物浓度的选择 a.根据其专一性选择底物； b.一般采用

11、高底物浓度测定法(10-20 Km)。,2反应条件的选择 a.一般应采用酶的最适反应条件，确保反应条件在整个 反应过程中尽量保持不变； b.如需要激活剂，取其最适浓度，且维持恒定。还要保 证不存在该酶的抑制剂。 3选择合适的化学反应及检测指标 a.如酶促反应的底物或产物具光吸收、旋光、电位差改 变或荧光的变化等性质，可以直接检测；,260 nm,340 nm,很多脱氢酶以NAD(P)为辅酶，可以测定反应前后340 nm光吸收的变化。,如：己糖激酶 葡萄糖+ATP葡萄糖-6-磷酸 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 葡萄糖-6-磷酸+NADP 6-磷酸葡萄糖酸+ NADPH+H+ c.一般以测定产物在反应初

12、期的生成速度为好。,b.对于一些不能直接测定底物或产物的酶反应，可通过 与其它可检测产物的酶反应偶联，使第一个酶反应的 产物变为第二个酶反应的底物。,三酶的活力单位： 1国际单位（IU）：在特定条件下（温度可采用25 或其他选用的温度，pH值等条件均采用最适条件）， 每分钟催化1 mol底物转化的酶量。 2比活力：在特定条件下，每毫克(mg)酶蛋白所具有的 酶活力单位数，即：酶比活力=酶活力（单位）/mg蛋 白。它是酶纯度的一个指标。,四酶的转换数与催化周期 1酶的转换数：又称为摩尔催化活性（molar catalytic activity），是指每个酶分子每分钟催化底物转化的 分子数。即每摩

13、尔（或微摩尔）酶每分钟催化底物转 变为产物的摩尔（或微摩尔）数，是酶催化效率的一 个指标。通常用每微摩尔酶的酶活力单位数表示，单 位为min-1。,2.酶的催化周期： 是指酶进行一次催化所需的时间，单位为毫秒或微 秒。在数值上等于酶的转换数的倒数。,第四节 酶的结构与功能 一级结构高级结构功能表现 （有时与辅因子一起） 一酶分子中的氨基酸残基对酶促反应的不同贡献 与底物结合、催化作用接触残基 活性中心 催化活性显示作用 协助催化作用 辅助残基 活性中心外（维持空间构象作用）结构残基 其它方面作用(活性调节、防止降解、运输转移等） 非贡献残基,接触残基: R1, R2, R6, R8, R9,

14、R163, R164, R165 辅助残基: R7 结构残基: R10, R162, R169 非贡献残基: R3, R4, R5,二酶的活性部位（中心） 1概念：酶分子中，显示酶的催化活性的特殊部位称为活性部位。,某些酶活性部位的AA残基,胰凝乳蛋白酶活性部位与底物的结合 红色表示底物，酶分子表面的红色区域表示酶分子关键的活性部位氨基酸残基。红色的线条代表底物。,酶分子的可逆伸展（不可逆失活的初始阶段） 黑体部分酶的活性中心,2结构组成： 底物结合部位：参与酶与底物的结合和使底物处于被 催化的正确位置酶的专一性 催化部位酶催化反应的性质 *底物结合部位与催化部位并不是绝对的，活性中心的 某些

15、基团同时兼有这两种功能。,3酶的活性中心的构成： 不需要辅酶的酶：三维结构上比较靠近的少数几个氨基酸残基或是这些残基上的某些基团。 需要辅酶的酶：辅酶分子，或者辅酶分子上的某一部分结构，以及与辅酶紧密偶联的蛋白区域。,4酶分子活性中心的进化：,一些丝氨酸蛋白酶接触残基丝氨酸附近的氨基酸顺序,酶活性中心在种系进化上存在严格的保守性。,5酶活性基团的鉴定： .物理法：X-射线衍射（晶体）、核磁共振（溶液）等 物理方法，直接 X-射线衍射：蛋白质的晶体难以培养，晶体结构测定 的周期较长。 核磁共振：对样品的需要量大，纯度要求高，被测蛋 白质的分子量一般不超过20 000。 .化学法 基本思路 化学修

16、饰剂修饰特定残基测定酶活的变化确定该 残基在酶催化反应中的作用。,a.共价修饰 测酶活 酶+共价修饰剂 复合物水解分离出含共价修饰物的 肽段分析该肽段序列 不 失 活 非活性中心 完全失活 活性中心 部分失活 活性中心，但可能只是其底物结合部 位，而非催化部位，或为活性中心以 外的必需基团。,b.亲和标记 酶+与底物结构相似的修饰剂复合物水解分离出 含修饰剂的肽段分析肽段序列确定活性中心 c.差别标记 酶+过量底物+修饰剂不被修饰 酶+带标记的同种修饰剂复合物水解分离带标记 的肽段分析肽段序列确定活性中心 .定点突变方法 8种在酶的活性中心中出现频率最高的的氨基酸残基 Ser, His, Cy

17、s, Tyr, Trp, Asp, Glu, Lys,三别构酶结构及活性调节： 活性中心：与配体（底物）结合并催化转化底物 别构部位：与别构配体（效应物）结合酶分子构象 改变活性中心构象改变影响酶活 四酶的结构改变对其催化功能的影响 （一）酶的一级结构改变对其催化功能的影响 1主链断裂 切除非贡献残基几乎不影响酶活（但不能过长） 切除接触残基、辅助残基和结构残基酶活性丧失 酶原激活显示出催化活性 实质：活性中心的形成和暴露。,2二硫键断裂 影响空间构象酶活性丧失 不影响空间构象不影响酶活性 （二）酶的二、三级结构改变对其催化功能的影响 酶活丧失 （三）酶的四级结构破坏对其催化功能的影响 多催化部位寡聚酶：一般情况下，亚基酶活丧失 多酶复合体：亚基酶活减弱或消失 调节亚基失去调节功能 别构酶 催化亚基仍具酶活，但并不显示别构酶的S 型动力学曲线。,