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1、食品卫生微生物学检验 GB/T 4789 -2003,1、霉菌和酵母计数 2、肉毒梭菌及肉毒毒素检验 3、罐头食品商业无菌的检验 4、乳酸菌检验,一、霉菌和酵母计数,1 范围 2 规范性引用文件 3 设备和材料 4 培养基和试剂 5 检验程序 6 操作步骤,霉菌和酵母菌及其检验,二、检验方法： 霉菌和酵母的计数方法，与菌落总数的测定方法基本相似。主要步骤为： 将样品制作成10倍梯度的稀释液，选择3个合适的稀释度，吸取1mL于平皿，倾注培养基后，培养观察，计数。 对霉菌的计数，还可以采用显微镜直接镜检计数的方法。,霉菌和酵母菌及其检验,三、程序: 1样品的处理。为了准确测定霉菌和酵母数，真实反映
2、被检食品的卫生质量，首先应注意样品的代表性。对大的固体食品样品，要用灭菌刀或镊子从不同部位采取试验材料，再混合磨碎。如样品不太大，最好把全部样品放到灭菌均质器杯内搅拌2min。液体或半固体样品可用迅速颠倒容器25次来混匀。 2样品的稀释：为了减少榈稀释倍数的误差，在连续递增稀释时，每一稀释度应更换一根吸管。在稀释过程中，为了使霉菌的孢子充分散开，需用灭菌吸管反复吹吸50次。 3培养基的选择：在霉菌和酵母计数中，主要使用以下几种选择性培养基。 马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基（PDA） 孟加拉红（虎红）培养基 高盐察氏培养基,霉菌在孟加拉红培养基上典型特征,霉菌在孟加拉红培养基上典型特征为红色菌落，
3、有黑色孢子 。,酵母菌在孟加拉红培养基上典型特征,酵母菌在孟加拉红培养基上典型特征为红色菌落,酵母菌在孟加拉红培养基上典型特征为红色菌落,霉菌和酵母菌及其检验,4倾注培养。每个样品应选择3个适宜的稀释度，每个稀释度倾注2个平皿。培养基熔化后冷却至45，立即倾注并旋转混匀，先向一个方向旋转，再转向相反方向，充分混合均匀。培养基凝固后，把平皿翻过来放温箱培养。大多数霉菌和酵母在2530的情况下生长良好，因此培养温度2528。培养3d后开始观察菌落生长情况，共培养5d观察记录结果。 5菌落计数及报告：选取菌落数10150之间的平板进行计数。一个稀释度使用两个平板，取两个平板菌落数的平均值，乘以稀释倍
4、数报告。固体检样以g为单位报告，液体检样以mL 单位报告。关于稀释倍数的选择可参考细菌菌落总数测定。,霉菌和酵母菌及其检验,6霉菌直接镜检计数法：对霉菌计数，可以采用直接镜检的方法进行计数。 在显微镜下，霉菌菌丝具有如下特征： 平行壁：霉菌菌丝呈管状，多数情况下，整个菌丝的直径是一致的。因此在显微镜下菌丝壁看起来象两条平行的线。这是区别霉菌菌丝和其他纤维时最有用的特征之一。 横隔：许多霉菌的菌丝具有横隔，毛霉、根霉等少数霉菌的菌丝没有横隔。 菌丝内呈粒状：薄壁、呈管状的菌丝含有原生质，在高倍显微镜下透过细胞壁可见其呈粒状或点状。 分枝：如菌丝不太短，则多数呈分枝状，分枝与主干的直径几乎相同，有
5、分枝是鉴定霉功得出可靠的特征之一。,肉毒梭菌及肉毒毒素检验,肉毒梭菌是厌氧性梭状芽胞杆菌属的一种。该菌在厌氧环境中能分泌极强烈的肉毒毒素，引起特殊的神经中毒症状 肉毒毒素通过消化道粘膜吸收，经血液扩散至全身，主要侵犯中枢神经系统，因而表现出一系列的神经症状。 主要临床特点：发病初期为无力、腹部不适、咽部发紧、呕吐，继而出现声音嘶哑、饮水发呛、吞咽困难、眼睑下垂、复视等眼部症状。,肉毒梭菌及肉毒毒素检验,培养基、试剂 明胶磷酸盐缓冲液 10%胰酶水溶液（酶活力1：250） 庖肉培养基 卵黄琼脂培养基 肉毒分型抗毒诊断血清 革兰氏染色,肉毒梭菌及肉毒毒素检验,样品采集： 可疑食物 病人血清在未使用
6、抗毒素治疗前采集（4-5ml） 病人粪便 疑似患者外伤感染后的坏死组织或者是渗出液,肉毒梭菌及肉毒毒素检验,1 增菌（产毒培养） 2 分离培养 3 菌落特征及菌体形态 4 菌落特征及菌体形态 5 生化试验 6 肉毒毒素检验（小白鼠腹腔注射）,肉毒梭菌及肉毒毒素检验,菌落特征及菌体形态 普通琼脂平板上形成直径3-5mm不规则菌落、半透明、绒毛样边缘扩散生长 血平板上形成发丝状或盘状的灰色菌落有-溶血 卵黄琼脂平板菌落及周围培养基上能分解脂肪表面覆盖着特有的虹彩样薄层和珠光层,肉毒梭菌及肉毒毒素检验,生化试验 肉毒梭菌的生化反应变化很大，同一型各菌株之间也不完全一致。,肉毒梭菌及肉毒毒素检验,分纯
7、后主要生化鉴定,肉毒毒素检验（小白鼠腹腔注射）,定型试验,定型试验说明,标本中的肉毒毒素可被肉毒多价抗毒素和B型抗毒素中和起到保护小白鼠免于死亡的作用。 上清液煮沸10分钟可以破坏肉毒的毒素证明标本中含有毒素。 此次样品检出结果为B型肉毒毒素,罐头食品商业无菌的检验,1 范围 2 规范性引用文件 3 术语与定义 4 设备和仪器 5 培养基和试剂 6 检验步骤 7 结果判定,罐藏食品的特性,概念：罐藏食品是将原料经过预处理、装罐、杀菌、密封后而成。因罐内保持一定的真空度，所以合格产品的罐盖和罐底是平的或向内凹陷。 罐藏食品的分类：罐藏食品可根据酸性的不同，分为低酸性罐头（动物性原料制成的罐头，蛋
8、白质含量高）、中酸性罐头、酸性罐头、高酸性罐头（植物性原料制成的罐头，碳水化合物含量高）,罐藏食品变质的原因,罐藏食品变质的原因： 化学因素：如罐头容器的马口铁与内容物相互作用引起的氢膨胀（主要发生于中酸性罐头） 物理因素：如温度过高或排气不良，造成的金属容器腐蚀穿孔。 微生物因素: 罐内残留的微生物（多是产芽孢的耐热微物）， 漏罐后的微生物再次污染,常用的几个概念,商业无菌：食品经过杀菌处理后，按照所规定的微生物检验方法，在所检食品中无活的微生物检出，或者只能检出极少数的非病原微生物，但他们在食品的保藏过程中不可能生长繁殖，这种从商品角度对某些食品提出的灭菌要求，称为商业无菌 腐败：食品中的
9、蛋白质被微生物分解造成的败坏，称为腐败。 酸败：食品中的碳水化合物或脂肪被微生物分解产酸而败坏，称为腐败。,中温芽孢细菌,中温芽孢细菌的最适生长温度是37 ，包括需氧和厌氧两大类，他们的少数芽孢耐过高压蒸汽处理而存活下来。,不产芽孢细菌引起的食品腐败变质,不产芽孢的细菌不耐热，因此罐头中出现此类菌时，主要是由于漏罐而造成的（冷却水是重要的污染源）。罐头中污染的不产芽孢细菌主要有两类，一类是肠道细菌，另一类是嗜热链球菌、乳链球菌、粪链球菌等，他们分解糖类化合物产酸产气，变质时使罐头膨胀。,不同外观的腐败变质罐头的微生物分析,胖听：除部分氢膨胀外，胖听主要由微生物生长繁殖而造成，即TA腐败产生的C
10、O2和H2、中温梭状芽孢杆菌发生丁酸腐败，产生CO2和H2、中温需氧芽孢杆菌、不产芽孢细菌、酵母菌、霉菌发酵糖类产酸产气。 平听：平酸菌、中温芽孢细菌、不产芽孢乳酸菌、致黑梭状芽孢杆菌（硫化物腐败）、霉菌,罐头食品商业无菌的检验,术语和定义 商业无菌：罐头食品经过适度的 热杀菌以后，不含有致病的微生物，也不含有在通常温度下能在其中繁殖的非致病性微生物，这种状态称作商业无菌。 密封 胖听 泄漏 低酸性罐头食品 酸性罐头食品,罐头食品商业无菌的检验,保温 开罐 留样 PH测定 感官检查 涂片染色镜检 接种培养 微生物培养检验程序及判定 罐头密封性检验,乳酸菌检验,1 范围 2 规范性引用文件 3
11、术语与定义 4 设备和材料 5 培养基和试剂 6 乳酸菌菌落总数的测定 7 乳酸菌的测定,乳酸菌,一群能分解葡萄糖或乳糖产生乳酸，需氧和兼性厌氧，多数无动力过氧化酶阴性，革兰氏阳性的无芽孢杆菌和球菌。,乳酸菌检验,乳酸菌菌落总数的测定 乳酸菌菌落总数 检样在一定条件下培养后，所得1ml(g)检样中所含乳酸菌菌落的总数。,乳酸菌菌落总数的测定,检验操作步骤 1、 以无菌操作将经过充分摇匀的检样25mL(或25g)放入含有225mL灭菌生理盐水的灭菌广口瓶内作成110的均匀稀释液。 2、 用1mL灭菌吸管吸取110稀释液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水的试管内(注意吸管尖端不要触及管内
12、稀释液)。 3、 另取1mL灭菌吸管，按上述操作顺序，作10倍递增稀释液，如此每递增一次，即换用1支1mL灭菌吸管。 4、 选择23个以上适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作两个平皿。 5、 稀释液移入平皿后，应及时将冷至50的乳酸菌计数培养基(改良TJA或改良MC)注入平皿约15mL，并转动平皿使混合均匀。同时将乳酸菌计数培养基倾入加有1mL稀释液检样用的灭菌生理盐水的灭菌平皿内作空白对照，以上整个操作自培养物加入培养皿开始至接种结束须在20min内完成。 6、 待琼脂凝固后，翻转平板，置361温箱内培养723h取出，观察乳
13、酸菌菌落特征(见表1)，选取菌落数在30300之间的平板进行计数。计算后，随机挑取5个菌落数进行革兰氏染色，显微镜检查并做过氧化氢酶试验。革兰氏阳性，过氧化氢酶阴性，无芽胞的球菌或杆菌可定为乳酸菌。根据证实为乳酸菌菌落计算出该皿内的乳酸菌数，然后乘其稀释倍数即得每毫升样品中乳酸菌数。例如，检样104的稀释液在改良TJA琼脂平板上，生成的可疑菌落为35个，取5个鉴定，证实为乳酸菌的是4个，则1mL检样中乳酸菌数为：,乳酸菌菌落总数的测定,乳酸菌的菌落特征 改良TJA： 1、杆菌：平皿底为黄色，菌落中等大小，微白色，湿润，边缘不整齐，直径3mm1mm，如棉絮团装菌落。 2、球菌：平皿底为黄色，菌落光滑，湿润微白色，边缘整齐 改良MC： 1、杆菌：平皿底为粉红色，菌落较小，圆形，红色，边缘似星状，直径2mm1mm，可有淡淡的晕。 2、球菌：平皿底为粉红色，菌落较小，圆形，红色，边缘整齐，可有淡淡的晕,乳酸菌的鉴定,极少见还原硝酸盐 不液化明胶 不产生靛基质和硫化氢 多数无动力 过氧化氢酶阴性 革兰氏阳性的无芽胞杆菌或球菌,