第2章-组织细胞培养技术.ppt

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1、第二章 园艺植物组织培养 Tissue culture of horticultural plants,第一节 概说,组织培养(Tissue culture)指通过无菌操作分离植物体的一部分，即外植体（explants）接种到人工培养基，在人工控制的条件下（包括营养、激素、温度、光照等）进行培养，使其产生完整植株的过程，也称为离体培养（In Vitro Culture）。,一、概念,二、分类,根据接种外植体不同，分为： 茎尖培养 (shoot tip culture) 胚胎培养 (embryo/ovule/ovary culture) 花药/花粉培养（anther/pollen/microsp

2、ore culture） 器官培养 (organ culture) 组织或愈伤组织培养 (tissue or callus culture) 细胞/原生质体培养 (cell/protoplast culture),根据培养过程： 将从植株体上分离下来的第一次培养称为初代培养 (primary culture) 以后培养体转移到的培养基，则统称为继代培养 (subculture),根据培养方式： 将加琼脂的培养基称为固体培养基 (solid medium) 不加琼脂的培养基称为液体培养基 (liquid medium ),三、内容,1. 愈伤组织培养（callus culture）：植物各种器官

3、或组织增殖而成的细胞团的培养。利用愈伤组织培养，在理论上可以阐明植物细胞的全能性和形态发育的可塑性，还可以诱导产生不定芽或胚状体而形成植株。 2. 器官培养(organ culture)：主要是根端、茎尖、叶与未成熟果实等培养。根端的离体培养是研究生物合成的和一种手段，茎尖培养具有快速繁殖和去除病毒的优点。,3. 胚培养(embryo culture)：主要是对较小且未成熟的胚进行培养，研究胚胎的发生以及影响胚生长的因素，特别是所需有机营养成分的研究。 4.胚珠和子房培养(ovule and ovary culture)：培养已传粉的子房及胚珠，是进行试管受精和诱导单倍体植株的一个途径，也是研

4、究生殖生理的有效方法。,5胚乳培养 (endosperm culture)是研究胚乳的功能、胚乳与胚的关系以及获得无籽结实的三倍体植株的手段。 6花粉和花药培养 (pollen / anther culture)：利用花粉具有整套染色体的特点，诱导产生单倍体植株进行育种，可以缩短育种周期，获得纯系。,7细胞培养 (cell culture)：分散性好的离体细胞或细胞团的培养，可应用于生产提取某些有用成分和次生物质，单细胞培养还可用于取得单细胞无性系，进行突变体选育。 8. 原生质体培养 (protoplast culture)：将去壁后裸露的原生质体进行培养。易于摄取外来遗传物质，细胞器及病毒

5、、细菌，应用于体细胞杂交或外源基因的导入研究。,哪些过程涉及减数分裂和遗传重组与分离？ 哪些材料培养获得的组培苗有童期？,四、组织培养的意义,园艺植物组织培养的意义和应用,在基础研究方面,营养生理,细胞生理和代谢,基因重组,新的技术手段,生物合成,加速无性或有性世代的繁殖，缩短育种周期或获得新的基因。 克服远缘杂交不亲和的障碍，促进幼胚发育。 获得三倍体。,在育种上,快速繁殖苗木具有质量好、体积小、便于携带、运输和交流。 获得无病毒苗木。,在工厂化育苗方面,In vitro (cryo-) preservation of germplasm,五、组织培养理论与技术发展简史,1. 理论准备与实验

6、开创时期 2. 理论与技术的发展时期 3. 生产应用及研究拓展,1.探索阶段,1902年，植物生理学家（德），根据细胞理论，提出：高等植物的器官和组织可以不断分割、直至单个细胞的植物细胞全能性（totipotency）的理论。即植物的体细胞在适当条件下，具有不断分裂和繁殖，发展成完全植株的潜在能力。,HABERLANDT,The father of plant tissue culture is considered to be the German Botanist HABERLANDT who conceived the concept of cell culture in 1902.,2

7、. 奠基阶段,1934年，White利用藻类用的无机盐培养基加上葡萄糖和酵母，建立了番茄离体根无性繁殖系。 1934年，Guillarmond（法）的学生，Gantheret，利用山毛柳、黑杨形成层组织培养。 1937年, White发现VB簇对根生长重要。,四十年代- Skoog&崔澂，腺嘌呤或腺苷可诱导形成芽。 五十、六十年代- Morel&Martin从受病毒侵染的大丽花中获得无病毒植株。 Muir单细胞培养。,3. 迅速发展阶段,七十年代- 原生质体培养和体细胞杂交。 原核生物噬菌体在寄主大肠杆菌中复制 DNA，得到遗体稳定的突变DNA克隆。,八十年代- 转基因技术迅速发展，全球已有1

8、2种作物的48种转基因作物产品获准进行商品化生产，至2001年全球基因作物种植面积达5260万公顷。,被批准进入商品化生产,转基因耐贮藏番茄 转查尔酮合成酶基因矮牵牛 抗病毒甜椒 抗病毒番茄 抗虫棉,近20年，对植物的快速繁殖与脱毒、种质保存、次生物质生产、细胞工程和基因工程等生物技术育种、以及遗传学和生物学基础理论进行了广泛的研究。,技术的发展 Development of the technique,（一）材料范围的逐步扩大 器官 组织、细胞、原生质体 低等苔鲜 高等植物,（二）培养方法的逐步发展,静止 液体振荡或旋转改善O2悬浮培养、深层培养 小量 大量 试管 大罐 手工 自动化,（三）

9、培养基的逐步改进,随着化学工业发展而迅速发展 各种配方以成品方式出售,（四）实验手段的逐步完善,新型显微镜 新型分子标记 新型倍性分析仪（FCM）,第二节 组织培养原理与技术, Totipotency: the ability of undifferentiated plant tissues to differentiate into functional plants when cultured in vitro,Plant cells are totipotent,细胞是生物有机体的基本结构单位，特别是植物细胞又是在生理上发育上具有潜在全能性的单位。 受精卵：可以产生具有完整形态和结构和

10、功能的植株。 体细胞：也具备遗传信息的传递、转录和翻译的能力。,乳腺细胞克隆羊,Competency（再生作用）: the endogenous potential of a given cell or tissue to develop in a particular way Plant cell and tissue culture: cultural techniques for regeneration of functional plants from embryonic tissues, tissue fragments, calli, isolated cells, or pro

11、toplasts,Definitions,Basis for cell culture, Plant cells are totipotent; Have the ability to develop into whole plants or plant organs in vitro when given the correct conditions Not all plant cells are totipotent. However, there are a sufficient number of totipotent cells in the plant (e.g. in the p

12、ith木髓) Differentiated cells have to be dedifferentiated into callus and redifferentiated back to somatic embryo that will regenerate the entire plant,Callus, Is a natural response of the plant tissue to wounding A mass of actively dividing undifferentiated cells produced by plant tissue explant Cell

13、s are totipotent Callus can be Resuspended in liquid media to create a susupension culture of single totipotent cells Or differentiated into plant with the appropriate manipulations of culture conditions,两条繁殖途径,(1) 器官发生（organogenesis），通常由培养的组织或细胞产生愈伤组织（callus），再产生芽和根。 (2) 胚胎发生（somatic cell embryogen

14、esis），即由培养的组织产生愈伤组织，通过悬浮培养，或直接产生大量胚状体（embryoid），再长成植株。通过胚状体培养可以得到大量的植株。,Organogenesis: The process of initiation and development of a structure that shows natural organ form and/or function. Embryogenesis: The process of initiation and development of embryos or embryo-like structures from somatic ce

15、lls (Somatic embryogenesis).,Virus-free strawberry plantlets by anther culture,Adventitious bud of aloe 芦荟,Adventitious product from callus of orchid,器官发生繁殖的4种方式,1通过茎尖培养产生大量腋芽 植物茎尖部分是分生组织区，是产生植物组织地上部分的全能性区域。叶脉分生组织受到顶端优势（Apical Dominance）的抑制，而调整细胞分裂素浓度，可以促进腋芽的生长。,培养方法简单，能高度保持遗传稳定性，能长期继代繁殖。该繁殖方式一般不需要添

16、加外源激素，如果需要使用激素，一定要严格控制浓度，以防止产生愈伤组织。,腋 芽 增 殖,例：唐菖蒲 6 weeks + BA 0.5 mg/L 长主芽 + BA 1 mg/L 1个侧芽 + BA 2 mg/L 3个侧芽 例：菊花 BA增加，腋芽的萌发量增加。 NAA减少，腋芽的萌发量增加。,2通过器官培养直接诱导不定芽,Tulip bulb produced after 6 months with young flower stalks are the starting material,从现存的芽以外的任何器官、组织上通过器官发生重新形成的芽称为不定芽。 特点：繁殖系数高， 遗传稳定性较好。

17、 但继代次数有限。,不定芽增殖,3通过愈伤组织培养再诱导产生不定芽,接种的组织或器官小块在培养基上生长，去分化形成愈伤组织；为诱导愈伤组织生长，采用较强的生长素浓度。 多数植物的愈伤组织需要低生长素含量，高细胞分裂素浓度的培养基才会分化产生不定芽，且有的在不含生长素的培养基上也可以分化。,所有植物通过组织培养均可诱导愈伤组织，进一步分化即可获得小植株。该途径经历了组织培养技术的所有过程(愈伤组织诱导愈伤组织增殖芽分化生根完整植株)，它属于真正意义上的组织培养。 一切通过其它增殖方式不能成功的植物，均可通过此途径获得组培苗。 其特点是成功率高，繁殖系数大，但遗传稳定性较差。对品种要求遗传稳定性高

18、的作物一般不采用这一途径快繁。,愈伤组织增殖,Callus, Is a natural response of the plant tissue to wounding A mass of actively dividing undifferentiated cells produced by plant tissue explant Cells are totipotent Callus can be resuspended in liquid media to create a suspension culture of single totipotent cells Or differe

19、ntiated into plant with the appropriate manipulations of culture conditions,Cell suspension culture,增长率高，双极性免去生根环节，但胚状体休眠的诱导和解除还难以把握，其成苗率仍不高。目前除一些特殊用途外(人工种子)，这一途径还没有用于快繁技术。,4、体细胞胚增殖,Basis for Plant Tissue Culture,Two Hormones Affect Plant Differentiation: Auxin: Stimulates Root Development Cytokinin

20、: Stimulates Shoot Development Generally, the ratio of these two hormones can determine plant development: Auxin Cytokinin = Root Development Cytokinin Auxin = Shoot Development Auxin = Cytokinin = Callus Development,植物的再生作用,再生作用（competency）植物内在的通过某个器官（根、茎、叶等）发育成完整植株的能力。,1扦插的园艺植物有100多种。 枝插：梅、葡萄、菊花等；

21、 叶插：秋海棠、卷柏、月季； 根插：柿、树莓。 2受伤的部位往往可产生新的器官：如长出不定芽，或不定根。 3再生：主要取决于内源激素调整是否快或完 全。,细胞分化和形态建成,1合子胚的发育，经历生长和分化过程，生长为完整结构的有机体； 2体细胞生长（类似），开始是进行生长。从一个分化的有专一功能的细胞，要表现它的全能性，首先要经过去分化（脱分化）的过程，改变细胞原来的结构、功能，而回复到无结构的分生组织状态，即愈伤组织状态。愈伤组织分生细胞团再分化，进行形态建成，而产生完整植株。（体细胞胚胎发生）,最常见的再分化是根的形成：3 种方式 （1）先形成根的，往往抑制芽的形成； （2）先形成芽的，较

22、易产生根； （3）同时产生芽和根。 一般而言，芽和茎叶原基起源于组织培养中比较表层的细胞（外起源） 根原基则发生在组织较深处（内起源）,在组织培养中再生植株还可通过与合子胚相似的胚胎发生过程，即形成胚状体，而成为完整的植株。 有分化胚状体能力的种子植物已有117种（分属于34科，75属）。,胚状体可从以下几种培养物中产生： 1直接从器官上发生； 2从愈伤组织上发生； 3从游离的单细胞发生； 4从小孢子发生。,诱导胚状体与诱导芽相比，有3个显著优点： 1 数量多、速度快、结构完整； 2 胚状体以单细胞直接分化成小植株，比经过愈伤组织再分化要快； 3 胚状体一旦形成即可再生小植株，成苗率高。,Fa

23、ctors Affecting Plant Tissue Culture,Growth Media Minerals, Growth factors, Carbon source, Hormones Environmental Factors Light, Temperature, Photoperiod, Sterility, Media Explant Source Usually, the younger, less differentiated the explant, the better for tissue culture Genetics Different species s

24、how differences in amenability to tissue culture In many cases, different genotypes within a species will have variable responses to tissue culture; response to somatic embryogenesis has been transferred between melon cultivars through sexual hybridization,第三节 实验室设计及基本设备,实验室设置,基本技术,培养基及其配制,外植体接种培养,实

25、 验 室 设 置,实验室组成,基本设备配置,培养容器与用具,实验室的基本要求,实验室布局示意图,基 本 实 验 室,准备室 准备室的功能就是进行一切与实验有关的准备工作。要求宽敞明亮，通风条件好。 接种室 接种室的功能是进行无菌操作。要求封闭性好，干燥清洁，能较长时间保持无菌。为了保持清洁，接种室应防止空气对流。 培养室 培养室的功能是对离体材料进行控制培养。其首要要求是要能控制光照和温度，其次为防止微生物感染，培养室应保持干燥和清洁。,辅 助 实 验 室,细胞学实验室 其功能是对培养材料进行细胞学鉴定和研究。要求清洁、明亮、干燥，使各种光学仪器不受潮湿和灰尘污染。 摄影室及暗室 其功能是进行

26、培养材料的摄影记录和胶片冲印。在有条件的情况下可建立此实验室。 生化分析室 在以培养细胞产物为主要目的的实验室中，应建立相应的分析化验实验室，以便于对培养物的有效成分随时进行取样检查。,基本设备配置,基本设备,灭菌设备,光照培养室与设备,无菌操作设备,细胞学鉴定设备,天平 ，冰箱 ，酸度计 ，纯水器,活性成分过滤灭菌,接种工具随时消毒,培养基灭菌,玻璃器皿灭菌,培养容器与用具,玻璃容器 塑料容器 金属用具 塑料用具,倒置显微镜,研究显微镜,激光共聚焦,显微操作仪,第四节 组织培养基 （Culture media）,一 培养基的种类和成分 培养基的种类,1培养基是组织培养最重要的基质。 2培养基

27、的名称多数以发表人的名字命名，再加上年号。,3国际上常用的五种培养基： MS：Murashige 和Skoog (1962) MT: Murashige 和Tucker (1969) ER：Eriksson（1965） B5：Gamborg等（1968） SH：Shenk和Hildebrandt（1972） HE：Heller（1953）,MS（Murashige和Skoog 1962） M6（朱至清1975）：用于禾本科植物花药组织培养 Miller（1963）：一般组织培养 H（Bowgin和Nitsch）：一般组织培养 T（一般组织培养）,White（1963）：一般组织培养 B5（Ga

28、mborg et al 1968）一般组织培养 C17（王培等 1986）：小麦花药培养 W14（欧阳俊闻等 1988）：小麦花药培养 KM8P（Kao et al 1975）：原生质体培养 Lloyd and Mccoun（Lloyd 1980）：木本植物培养 RM（Reinent et al 1967）：兰花,4各培养基特点 MS：用于烟草细胞，硝酸盐、钾和铵的含量比其它培养基高。 ER：与MS相似，磷酸盐的含量比MS高一倍，微量元素含量低得多。 B5：为培养大豆的细胞组织设计，铵的含量低。 SH：与B5相似，无机盐的含量稍高。 HE：无机盐浓度稍低，水稻愈伤组织培养上使用。,培养基成分,

29、主要为五大类：,水,无机盐,有机化合物,培养体支持材料,抗生素及中药,天然复合物,（一）水,自来水,重蒸馏水,蒸馏水,（二）无机盐 （inorganic element）,1大量元素,N：硝态氮、铵态氮。 P：ATP合成不可少，培养基中一般以PO34的形式添加。 K、Ca、Mg、S：必须元素，浓度一般在13毫克分子较适合。,2微量元素,Fe： 有利于合成叶绿素，是植物细胞分裂和延长所必需的。 一般使用Fe2(SO4)3和FeCl3，pH5.2以上时，成Fe(OH)3的不溶性沉淀，常以FeSO4.7H2O和NaEDTA使用。 Mn、Cu、Zn、Mu：组织培养常需要。,（三）有机化合物,1碳水化合

30、物 蔗糖：浓度为23%， 胚培养时，可加45% 其它：葡萄糖、果糖、麦芽糖。,2植物激素 （1）植物生命活动中不可缺少的物质，主要是促进细胞分裂生长及诱导器官分化。 （2）组织培养用的较多的有：IAA、NAA、2,4-D、KT、BA。,3. 维生素：维生素C、B1、B6、烟酸、叶酸、一般0.10.5 mg/L。 维生素C：可防止组织变褐； 维生素B1：与愈伤组织的产生和生活力 有密切关系； 维生素B6：对根的生长有促进； 烟酸：对植物代谢和胚的发育有作用。,4肌醇：一般用量100 mg/L （1）对组织、细胞繁殖、分化有促进； （2）对细胞壁的形成有作用； （3）还可增强愈伤组织的生长。,5氨

31、基酸 （1）对培养体的生长、分化起重要作用； （2）但单独添加进往往起阻碍作用，几种混合时才有好的作用。,（四）天然复合物,（1）含氨基酸、激素、酶等复杂化合物，如； （2）对细胞和组织的增殖与分化有促进，但对器官分化不明显； （3）成分不清，一般应尽是避免使用。,1椰乳 coconut milk （1）使用最多、效果最大的一种，浓度在1020%； （2）对愈伤组织和细胞培养有促进作用。,2香蕉 （1）黄熟的小香蕉，150200 g/L （2）对pH的缓冲作用大，主要在兰花的组织培养中应用，对发育有促进。,3胳朊加水分解物 （1）主要成分为氨基酸，浓度100200 mg/L。 （2）受酶和酸的

32、作用易分解。,4马铃薯 （1）去皮和芽，煮30分钟，过滤，一般150200 mg/L。 （2）对pH缓冲作用大。,5其它 （1）酵母提取液、麦芽提取物、苹果汁、番茄汁、黄瓜果实、未熟玉米的胚乳。 （2）遇热较稳定，大多在培养困难时使用，有时有效。,（五）培养材料的支持物,1琼脂（agar) （1）凝固剂，一般0.61%. （2）为防此有害物质毒害，可加110 g/L的活性炭。 2其它：玻璃纤维、滤纸桥等。,（六）抗生物质,防止内生菌，可加抗生物质。,Hypocotyls of papaya were contaminated by endogenous bacteria,培养基的制备,（一）母

33、液配制和保存,1. 为减少工作量，一般配制所需浓度高10-100倍的母液 (Stock solution)； 2配制母液，按所使用药品的类别，分别配成大量元素、微量元素、维生素等； 3保存：无机成分在一起时，可能产生沉淀，应分别保存；,4要用重蒸馏水，等级较高的化学纯或 分析纯的药品，称量或定容要准确； 5配好的母液瓶上注明母液号、配制倍数、日期、及配1升培养基时应取的量。 6低温下可保存几个月。,培 养 基 配 制,大量元素配制成10-20的母液 微量元素配制成100-200的母液 激素单独配制成mg/ml的母液 培养用培养基按需要按比例加入,（二）过程,加重蒸馏水 按序加母液 生长调节物质

34、 加蔗糖 熔琼脂,（三）pH值的调节,1一般加0.11 N的HCl（或NaOH）； 2通常使用的pH值范围是5.56.5。pH在4.0以下或7.0以上培养物就不能正常生长。 由于外植体的吸收，引起培养过程中pH变化 高压灭菌引起pH变化,（四）培养基分注：趁热分注,1三种方法：虹吸式、滴管方法、漏斗； 2分注适量，一般占试管或三角瓶的1/31/4； 3不要把培养基粘到管壁；分注后马上用棉盖塞住，并做好标记。,（五）灭菌和洗涤,1灭菌 （1）高压蒸气锅灭菌，压力0.81.1 kg/cm2，保持1520 min。 （3）进行三天预培养，一般至多保存2周。,培养基：湿热灭菌，即高压高温蒸汽灭菌。 玻

35、璃器皿：湿热灭菌或干热灭菌，即在烘箱中加热至15040分钟，或1202小时。 金属器皿：干热灭菌。 接种室：接种室常采用定期熏蒸，熏蒸剂常用甲醛加高锰酸钾，每100ml甲醛加5g高锰酸钾。,培养基体积与灭菌时间的关系,2洗涤 （1）小口器皿：清水冲 洗衣粉 刷子刷 自来水 蒸馏水洗1次 烘箱烘干 （2）大口器皿：清洗前，要先浸泡2小时。,玻璃器皿洗涤：新的玻璃器皿 已使用过的试管、烧杯、三角瓶 吸管、滴管等内径狭小的玻璃制品 塑料用品洗涤：一般用合成洗涤剂洗涤，因其附着力较强，冲洗时必须反复多次，最后用蒸馏水冲洗。 金属用品洗涤：金属用品一般不宜用各种洗涤液洗涤，需要清洗时，一般用酒精擦洗，然

36、后火焰干燥。,生长调节物质的应用,生长调节物质是培养基中的关键物质，对植物组织培养起决定性作用。,（一）生长素,1吲哚乙酸（IAA）：有天然，也可合成，活力低。遇高温高压、遇酶、受光易分解，对器官形成副作用小。 2萘乙酸（NAA）：可人工大量生产，高温高压下稳定，动能比IAA高3.7倍。 32,4-D：可促进愈伤组织形成。,不同器官对生长素的反应,根：对生长素最敏感，低浓度下105103PPM，可促进生长；浓度高时，抑制生长。 芽：浓度略高时，促进芽的生长。 愈伤组织：高浓度的生长素可诱导产生，而且对愈伤组织的再分化也有诱导作用。 其它：可促进细胞伸长、分裂、分化；还可促进新成代谢。,（二）赤

37、霉素（GA3）,1GA3对整个植株的作用比离体器官或组织作用显著，这与生长素不同。 2GA3有刺激器官生长的作用，但抑制器官的发生。 3GA3可刺激植物体内生长素的生物合成。,GA3 蛋白酶 蛋白质 色氨酸 生长素,（三）细胞分裂素,1. 对细胞分裂与分化，以及细胞的增大 有促进。 2. 可解除顶端优势，促进侧芽生长。 3. 可减少叶绿素分解、延缓叶片衰老。 4. 对根的生长起拟制作用。,生长调节物质的使用,溶剂 1水中直接溶解困难。 IAA、NAA、IBA、2,4-D、GA3可先用少量95%酒精溶解，再加水； KT、BA等则可用0.11 N的HCl溶解，再加水。 2也可配制母液，低温贮存使用

38、，用量极微，一般用mg/L表示。,使用量 1一般生长为0.0510 mg/l。细胞分裂素0.0520 mg/l 。 2生长素和细胞分裂素的比例决定着发育的细胞类型，愈伤组织再分化是长根或长芽。 生长素/细胞分裂素 低 促进芽形成 生长素/细胞分裂素 高 促进根形成,要点,1举例说明国际上常用的几种培养基？ 2培养基一般由哪些成分组成，各成分有何作用？ 3培养基的配制程序？ 4生长素、GA3、细胞分裂素在培养中主要有哪些作用？,第五节 Tissue Culture Applications,Micropropagation Germplasm preservation Somaclonal va

39、riation & mutation selection Embryo Culture Haploid & Dihaploid Production Industrial Products from Cell Cultures,一、Micropropagation,The art and science of plant multiplication in vitro Usually derived from meristems (or vegetative buds) without a callus stage Tends to reduce or eliminate somaclonal

40、 variation, resulting in true clones Can be derived from other explant or callus (but these are often problematic),Steps of Micropropagation,Stage 0 Selection hardened off,Features of Micropropagation,Clonal reproduction Way of maintaining heterozygozity Multiplication stage can be recycled many tim

41、es to produce an unlimited number of clones Routinely used commercially for many ornamental species, some vegetatively propagated crops Easy to manipulate production cycles Not limited by field seasons/environmental influences Disease-free plants can be produced Has been used to eliminate viruses fr

42、om donor plants,外 植 体 灭 菌,不同外植体 在灭菌剂浓度、 时间、程序上 应有所区别,几种常用消毒剂的效果比较,二、Germplasm Preservation,Extension of micropropagation techniques Two methods: Slow growth techniques e.g.: Temp., Light, media supplements (osmotic inhibitors, growth retardants), tissue dehydration, etc Medium-term storage (1 to 4 y

43、ears) Cryopreservation Ultra low temperatures Stops cell division & metabolic processes Very long-term (indefinite?) Details to follow on next two slides ,Cryopreservation Requirements,Preculturing Usually a rapid growth rate to create cells with small vacuoles and low water content Cryoprotection G

44、lycerol, DMSO, PEG, etc, to protect against ice damage and alter the form of ice crystals Freezing The most critical phase; one of two methods: Slow freezing allows for cytoplasmic dehydration Quick freezing results in fast intercellular freezing with little dehydration,Cryopreservation Requirements

45、,Storage Usually in liquid nitrogen (-196oC) to avoid changes in ice crystals that occur above -100oC Thawing Usually rapid thawing to avoid damage from ice crystal growth Recovery (dont forget you have to get a plant) Thawed cells must be washed of cryoprotectants and nursed back to normal growth A

46、void callus production to maintain genetic stability,三、Somaclonal Variation in Vitro,Somaclonal Variation: variability in plants regenerated from tissue culture that is either induced or uncovered by a tissue culture process. Most somaclonal variation is negative, but if enough plants are examined,

47、positive changes can usually be recovered.,Somaclonal Variation & Breeding,The source for most breeding material begins with mutations, whether the mutation occurs in a modern cultivar, a landrace, a plant accession, a wild related species, or in an unrelated organism Total sources of variation: Mut

48、ation, Hybridization, Polyploidy Somaclonal variation is a general phenomenon of all plant regeneration systems that involve a callus phase,Somaclonal Variation,There are two general types of Somaclonal Variation: Heritable, genetic changes (alter the DNA) Stable, but non-heritable changes (alter ge

49、ne expression, AKA epigenetic) Since utilizing somaclonal variation is a form of mutation breeding, we need to consider mutation breeding in more detail ,Inducing Mutations,Physical Mutagens (irradiation) Neutrons, Alpha rays Densely ionizing (“Cannon balls”), mostly chromosome aberrations Gamma, Beta, X-rays Sparsely ionizing (“Bullets”), chromos