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1、乙型肝炎病毒基因型、YMDD变异与病毒复制水平的关系?400?经验交流?国际检验医学杂志2011年3月第32卷第3期IntJLabMed,March2011,Vo1.32,No.3乙型肝炎病毒基因型,YMDD变异与病毒复制水平的关系马亚平,曹红,李俊枫(湖北省襄阳市中心医院检验科441000)摘要:目的研究拉米夫定治疗慢性乙型肝炎(CHB)期间乙肝病毒(HBV)YMDD变异的情况及其与HBV基因型和病毒复制水平的关系.方法检测53例CHB患者在使用拉米夫定治疗后的YMDD突变情况,考察其与HBV基因型和病毒复制水平的关系.结果患者在用药9个月和12个月后发生YMDD突变的概率为1.8和9.4%
2、;基因型B的治疗有效率明显高于基因型C(P<0.05).基因型C的YMDD突变率明显高于基因型B的YMDD突变率.结论拉米夫定能迅速抑制HBV复制,改善肝功能,但长期用药部分患者会出现耐药,其YMDD突变概率随治疗时间的延长而增加.关键词:拉米夫定;肝炎,乙型;基因型;突变D0I:10.3969/j.issn.16734l3O.2O11.03.058文献标识码:B文章编号:16734130(2011)03040002拉米夫定(1amivudine)是一种核苷(酸)类似物,可有效抑制乙肝病毒(hepatitisBvirus,HBV)复制.但在长期使用后,部分患者会出现耐药.因此,寻找能早期
3、预测发生DNA多聚酶酪氨酸一蛋氨酸一天冬氨酸天冬氨酸(YMDD)变异的相关因素,做出相应防治措施,对提高慢性乙型肝炎(chronichepatitisB,CHB)患者的l临床疗效,改善预后等具有重要的意义.1资料与方法1.1研究对象选择2006年9月至2007年lO月就诊于本院肝病科,并采用拉米夫定治疗的CHB患者93例,其中男性61例,年龄18-71岁,平均年龄39.4岁;女性32例,年龄2568岁,平均38.6岁.诊断符合2000年病毒性肝炎防治方案中的标准.分为治疗组(53例)和对照组(40例).治疗组服用拉米夫定(100mg/d)治疗1年,在用药后6个月,9个月,1年分别进行血清标本Y
4、MDD,HBVDNA含量和丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平检测.HBV基因型检测则于第1次就诊后1个月内进行.对照组的治疗方案为普通保肝治疗.1.2疗效标准治疗1年后,ALT正常,HBeAg转阴,HBVDNA<500copy/mL为有效,其他为无效.1.3方法(1)标本采集:空腹采集患者静脉血3mL,4过夜,以8cm离心半径3000r/min离心10min,分离血清置1.5ml离心管中,4或一2O储存备用.(2)DNA提取:DNA提取采用煮沸法.取血清100I加入等量DNA提取液,混匀后100煮沸10min,离心取上清2I用于荧光定量PCR反应.(3)HBVDNA检测:使用RocheIig
5、htcyclerII型实时荧光定量PCR仪,采用达安公司HBVDNA定量检测试剂盒,具体操作按说明书.(4)YMDD突变检测和HBV基因分型检测:HBVDNA分型试剂盒购自广州达安基因公司,YMDD突变检测试剂盒为深圳匹基生物工程公司产品,具体操作按说明书.(5)肝功能分析:采用美国雅培公司ABBOTTCi8200全自动生化分析仪进行.1.4统计学处理计量资料结果以s表示,计数资料以百分率表示.采用SPSS10.0统计软件进行分析,组间均数比较用方差分析和t检验,率的比较采用Y检验.2结果2.1拉米呋啶治疗过程中YMDD突变发生情况治疗12个月后的YMDD突变发生率与治疗6个月后相比,差异有统
6、计学意义(P<O.O01).说明在用药1年后发生YMDD突变的概率明显增加.2.2拉米夫定治疗效果与病毒基因型,YMDD变异及HBVDNA载量的关系见表2.拉米夫定治疗后,随着时间的延长,治疗有效的患者的HBVDNA逐渐降低,最终转阴,用药1年后共4O例转阴.基因型B的治疗有效率明显高于基因型C,差异有统计学意义(P<O.05).基因型C的YMDD突变率明显高于基因型B,差异有统计学意义(P<0.O1).在2种基因型之间,HBVDNA载量变化差异无统计学意义(P>0.05).表1拉米呋啶治疗患者YMDD突变发生情况表()注:一表示无值.表2HBV感染者临床指标3讨论全世
7、界已有近4亿人为慢性HBV携带者,其中75的感染发生在亚洲,并为慢性肝炎,肝硬化,肝癌的主要原因.拉米夫定作为一种有效抗病毒药物,其长期用药对部分患者可导致HBVP基因区YMDD变异,使P基因区进行逆转录的活性部位中的552位蛋氨酸(M)被缬氨酸(V)或异亮氨酸(I)取代,生成YVDD或YIDD等,产生耐药突变,出现病毒突破(viralbreakthrough),从而导致患者病情反复,甚至病情恶化.因此研究拉米夫定治疗YMDD变异产生的相关因素,找到能早期预测YMDD变异产生的有效指标,意义重大.HBV的基因分型概念在1988年由Okamoto等提出,现在已将HBV分成AH8个基因型.国内外学
8、者已经对HBV分型的地理分布,与基因变异的关系,与临床疾病的关系以及与抗病毒治疗耐药性产牛的关系等多方面进行了大量的研究工作,其与抗病毒耐药变异的关系尤其值得深入研究.国际检验医学杂志2011年3月第32卷第3期IntJLabMed,March2011,Vo1.32,No.3本研究在对YMDD突变发生时间的观察中发现,在连续用药6个月内,无YMDD突变发生;9个月后,已经有1.8的患者发生了YMDD突变,而到了12个月后,则有9.4的患者发生了YMDD突变,差异有统计学意义(P<0.001).说明在用药12个月后发生YMDD突变的概率明显增加.这个结论与国外多项试验的结论相吻合,但突变比
9、例稍低,推测可能与样本量较少有关.试验中发现,B基因型中YMDD突变发生概率低于C基因型,而拉米夫定对基因型B的治疗有效率明显高于基因型C.总之,本研究对HBV基因型,YMDD变异与病毒复制水平的关系进行了初步的研究和探讨.由于HBV感染过程的复杂性,如何利用现代的分子诊断技术,指导和帮助I临床医生制定有效的治疗方案,将是下一步研究的目标.参考文献1OkamotoH,TsudaF,SakugawaH,eta1.TypinghepatitisBvirusbyhomologyinnueleotidesequence:comparisonofsurfaceantigen?经验交流?401?subty
10、pesJ.JGenVirol,1988,69:25752583.2张红,施鑫鹤,杨海珍,等.实时荧光定量PCR监测乙肝抗病毒治疗后部分肝功指标的研究J.国际检验医学杂志,2009,30(10):952954.3王海滨,姜平,马洪滨,等.乙型肝炎病毒YMDD变异与肝功能损伤程度的关系J.中华检验医学杂志,2005,28(9):922924.4胡咏梅.前s1抗原与乙型肝炎诊断,HBVDNA及肝功能的关系J.国际检验医学杂志,2009,30(7):697,699.5陈尚军,金生源,陆金鑫,等.拉米夫定重治疗既往YMDD变异慢性乙型肝炎疗效观察J.实用肝脏病杂志,2010,13(1):57,60.6Y
11、angDH,IiangWF,XieYJ,eta1.PCRrestrictionfragmentlengthpolymorphismindetectionofYMDDvariantsofviralpolymeraseinhepatitisBviruspatientstreatedwithlamivudineJ.HepatobiliaryPancreatDisInt,2002,1(2):232237.7李玲,毛青,黄燕萍,等.慢性乙型肝炎患者HBVDNAYMDD变异的检测及意义口.第三军医大学,2005,27(2):167169.某地区儿童血红蛋白电泳结果分析(收稿日期:20100513)邹团标,
12、姚莉琴,杨发斌,浦剑(1.云南省妇幼保健院检验科,昆明650051;2.西双版纳州妇幼保健院检验科,云南景洪666100)摘要:目的分析西双版纳地区学龄前儿童血红蛋白病的发病情况.方法对该地区3个县的2634例学龄前儿童进行筛查,Hb的测定采用醋酸纤维素膜电泳(pH8.6).结果该地区主要是以地中海贫血和8_地中海贫血检出为主;由于地域和民族的差畀,在不同的县,血红蛋白病检出率存在差异.结论血红蛋白电泳技术应用于该地区儿童血红蛋白病筛查,对控制该病,提高少数民族人口素质有重要意义.关键词:儿童;血红蛋白类;电泳;血红蛋白病DOI:10.3969/j.issn.16734130.2011.O3.
13、059文献标识码:B文章编号:1673-4130(2011)03040102血红蛋白病是一组由于珠蛋白肽链的结构异常而引起血红蛋白功能异常所致的疾病.西双版纳聚居着多种少数民族,调查显示该地区血红蛋白病发病率为13.90A1.为探讨该地区少数民族儿童群体的发病情况,本组于2009年68月对少数民族047岁儿童进行筛查,报道如下.1资料与方法1.1研究对象采用分层多阶段整群随机抽样和典型调查相结合的方法,选取西双版纳州勐腊,勐海和景洪3县少数民族07岁儿童,共2634例.1.2仪器与试剂DY600电泳仪,美国Helena公司配套试剂和扫描分析系统.1.3方法采用醋酸纤维素膜电泳(pH8.6)测定
14、异常Hb,严格按操作说明操作.诊断标准:正常成年男,女HbA2含量为2.53.5,且不出现异常Hb区带;如HbA22.5,或出现异常Hb区带(HbH,HbBart),判为a一地中海贫血表型阳性;轻型地中海贫血,HhA23.58,HbF正常或轻度增加(不超过5);中间型地中海贫血,HbF53O;重型B一地中海贫血,HbF3090.1.4统计学处理采用SPSSI3.0统计软件分析.2结果少数民族07岁儿童血红蛋白病检出情况见表1,主要是以a一地中海贫血和地中海贫血为主.有136例儿童血红蛋白电泳呈现HbA2高值,居868之问,疑属HbE/fl一地中海贫血.表1西双版纳州各县的血红蛋白病检出情况()
15、3讨论因各种Hb的等电点不同,在pH8.6的缓冲液中所带电荷不同,故通过电泳,可以将正常和异常的Hb分开为不同的区带,并能够定量检测HbA,HbF,HbA2,能够同时检测HbH,HbE,HbD等异常Hbj,是研究和分析异常Hb的有效方法,是诊断血红蛋白病不可缺少的手段.本组筛查结果显示,血红蛋白病在西双版纳州儿童中检出率较高,主要以a一地中海贫血和B地中海贫血为主.同时还有136例血红蛋白电泳呈现HbA2高值,由于人类的8基因表达有限,HbA2值一般不超过68,因此,该HbA2值应考虑为HbE的量,进而推测这136例儿童疑属HbE/8_地中海贫血,需进一步做基因分析以确诊.另外还发现4例疑属HbG和1例HbK,其血红蛋白电泳呈现2条异常区带,还有1例为HbA缺失,均是由于珠蛋白基因发生点突变,Hb的性质和功