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1、荞麦水溶性多糖的分离纯化及其相对分子量的测定许文涛 1，张方方 1，黄昆仑，王颖，罗云波* 中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 (100083) E-mail：摘要：本文通过研究了通过热水浸提法从荞麦中提取了一种水溶性多糖,并用离子交换柱 和凝胶过滤柱对荞麦多糖进行分离纯化、测定了其相对分子量。实验结果表明,荞麦多糖粗品用 Savag 法脱蛋白后，采用 DEAESepharose Fast Flow 和 Sephacryl S-400 HR 柱层析纯化，得到荞麦多糖 FEP，经过凝胶柱色谱分析表明，FEP 为均一多糖。用苯酚硫酸法测定 多糖的含量，用 AKTA 快速液相蛋白层析仪的紫外检
2、测器在 280nm 监测蛋白质含量。最后根据用不同分子量的标准葡聚糖的做出的标准曲线，测定出 FEP 分子量(Mw)为 1720442Da。 关键词：荞麦；多糖；分离纯化；分子量测定1引言随着科学技术的发展和人民生活水平的提高，人们对医疗保健品的追求越来越趋向回归 自然。天然药物和天然营养保健品的研究开发已为国内外有关专家所重视1-2。天然多糖是 众多具有重要生物活性物质中的一类，它具有多方面的生物活性和保健功能，多糖因其具有 抗肿瘤3、抗病毒4、降血糖、降血脂5及提高免疫功能6-7等多种药理作用而越来越引起人 们的关注。天然多糖可作为各种药物和保健品的有效成分，对于预防和治疗包括癌症在内的
3、许多种疾病都具有巨大的潜力，所以关于多糖的提取工艺、结构性质和药理作用越来越引起 国内外学者的广泛关注，也取得了巨大的进展8-10。荞麦营养丰富，据分析：其含蛋白质 7.94-17.15%、脂肪 2.00-3.64%、淀粉 67.45-79.15%、 纤维素 1.04-1.33%。荞麦面粉含 18 种氨基酸，氨基酸的组分与豆类作物蛋白质氨基酸的组 分相似。荞麦脂肪含 9 种脂肪酸，其中油酸和亚油酸含量最多，占脂肪酸总量的 75%，还 含有棕榈酸 19%、亚麻酸 4.8%等。此外，还含有柠檬酸、草酸和苹果酸等有机酸。荞麦还 含有微量的钙、磷、铁、铜、锌和微量元素硒、硼、碘、镍、钴等及多种维生素：
4、VB、VB2、 VC、VE、VPP、VP，其中 VP(芦丁)、还有叶绿素是其它谷类作物所不含有的。这些物质在 人体的生理们代谢中起着重要的作用。随着人民生活质量的提高，食物的优质化和多样化越 来越受到人们的重视，荞麦作为一种营养丰富的健康食品倍受人们的青睐。本文从荞麦中提 取了一种水溶性多糖，通过离子交换柱层析和凝胶过滤层析研究了荞麦多糖的分离纯化条件 并测定了荞麦水溶性多糖的相对分子量，为进一步研究荞麦多糖的生物活性，开发荞麦功能 性食品奠定基础。2材料和方法2.1 材料和试剂荞麦：购于北京农贸市场，晒干，磨粉过40目标准筛备用。兰色葡聚糖及标准系列葡聚糖 Dextran (T500、T70
5、、T40、T10)为 Pharmacia 公司产品。DEAESepharose Fast Flow 预装柱、Sephacryl S-400 HR 凝胶填料：Pharmacia 公司。本课题得到科技部（863）项目（2006AA10Z440）,农业部“948”项目（2007-Z8）的资助。1同名第一作者：许文涛和张方方*通讯作者。- 1 -牛血清白蛋白(电泳纯)、 考马斯亮蓝G-250。试验所用葡萄糖，苯酚，硫酸、氯仿、正丁醇乙醇等均为分析纯。2.2 试验仪器RE-52A旋转蒸发器、SHZ-S型水循环真空泵、LGJ-18型冷冻干燥机、电热恒温水浴锅、 UVIKON XL172紫外可见分光光度计、
6、冷冻高速离心机、AKTA快速液相蛋白层析仪、 Frac-900 自动收集器。2.3 多糖粗品的提取制备称取荞麦粗粉，经90乙醇浸泡、回流脱脂，除去色素、小分子糖等物质，残渣晾干。 以1:20 料水比于90水浴浸提2 次，每次3 h ，得到多糖的浸提液，真空浓缩后，加入浓缩 液3倍体积的95% 乙醇，静置过夜 ，收集沉淀，冷冻干燥，得到荞麦水溶性多糖粗品，以 粗品重量相对原料计算多糖得率，约为7.010。2.4 多糖含量测定方法采用苯酚硫酸法测定，以葡萄糖为标准11。标准糖溶液：精密称取葡聚糖标准品20mg，低温烘干，于500 mL容量瓶中加水溶解稀释至刻度，摇匀备用。硫酸-苯酚法：取17支大试
7、管，1 支作空白，其余试管分成两组，分别加入0，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8 mL葡聚糖标准溶液，准确补充水至2 mL，加入6.0%苯酚溶液1.0 mL，混匀后快速加入浓 硫酸5.0 mL迅速摇匀，室温静置30 min，玻璃比色皿，以未加葡聚糖溶液的第一支试管作为 空白对照，于490 nm处测定各管中溶液的吸光度值。以葡萄糖的量为横坐标，吸光度值为纵 坐标，绘制出标准曲线。测定样品中多糖含量时，在试管中加入样品溶液1 mL，按照上述 方法测490 nm处吸光值，以标准曲线计算多糖含量。2.5 蛋白质的去除荞麦浸提液中除了含有大量的多糖外,还含有一定量的蛋白质及
8、其他非糖杂质。目前用 于多糖除蛋白的方法有Savag 法、三氟三氯乙烷法、及三氯乙酸 (TCA) 法12, 其中Savag 法 去蛋白虽然效率不高，但条件温和，不会引起多糖的降解。因此，本实验采用Savag 法反复 除蛋白。2.6蛋白质含量测定方法采用考马斯亮蓝法测定蛋白含量13a.制作标准曲线准确称取干燥的牛血清白蛋白5 mg于50 ml容量瓶中，用蒸馏水溶解后，定容 得100 mg/L的牛血清白蛋白储备液。用上述母液配制浓度分别为0, 10, 20, 30, 40, 50 mg/L的 标准溶液。精密吸取上述各浓度标准溶液0.5 ml于试管中，然后加入考马斯亮蓝G-250溶液5.0 ml,混
9、匀，于595 nm波长处测吸光度值。以牛血清白蛋白浓度为横坐标，以吸光度值为纵 坐标，绘制标准曲线。b.样品含量测定分别配制500 mg/L的荞麦多糖样品水溶液。精密吸取样品液0.5 mL于试管中， 按上述步骤操作，测吸光度值，以标准曲线计算蛋白含量。2.7 荞麦多糖的离子交换柱层析纯化上样量10mg, 上样体积1mL, 上样到已用20 mmoL/L的Tris-HCl（pH 7.8）溶液平衡DEAESepharose Fast Flow 预装柱(1.620cm)上，用0.5 moL/L的NaCl 溶液梯度洗脱, 流速- 5 -为2 mL/min ,用自动分部收集器收集洗脱液, 每管收集2ml，
10、以苯酚-硫酸法跟踪检测。合并主峰部位，透吸，减压浓缩，乙醇沉淀，冷冻干燥。2.8 荞麦多糖的凝胶柱层析纯化上样量10 mg, 上样体积1 mL, 上样到平衡好的Sephacryl S-400 HR 柱(1.050cm)上，用0.5 moL/L的NaCl溶液洗脱, 流速为2ml/min ,用自动分部收集器收集洗脱液, 每管收集2 mL， 以苯酚-硫酸法跟踪检测。合并主峰部位，透吸，减压浓缩，乙醇沉淀，冷冻干燥得到纯化 的荞麦多糖FEP。用上述方法对FEP进行纯度鉴定14。2.9 分子量测定凝胶过滤法Sephacryl S-400 HR 柱(1.050cm)，用0.5mol/L NaCl溶液按2m
11、l/min的恒定流 速平衡 60h。兰色葡聚糖(分子量为200万)和各标准糖的上柱量都为3 mg，先用兰色葡聚糖 洗脱测得外水体积Vo ，再用分子量分别为T-500、T-70、T-40、T-10 的标准品相继上柱。 分部收集流出液(1 mL/ 管)，苯酚硫酸法检测糖峰，分别求得它们的洗脱体积Ve。以分子量 Mw 的对数lg Mw 为纵坐标，Ve/Vo 为横坐标作图，绘制标准曲线。样品按上述条件上柱， 求得它的Ve，根据Ve/Vo 值从标准曲线上求得样品对应的分子量。3结果与讨论3.1 蛋白质的去除采用Sevag 法，即用氯仿：正丁醇=4：1 混合液加至等体积的粗多糖水溶液中，充分 振摇，分去水
12、层与溶剂层交界处的变性蛋白，反复数次，直至溶剂层与水的界面无乳白色沉 淀为止，乙醇沉淀，冷冻干燥。3.2 DEAESepharose Fast Flow 柱层析纯化图1 荞麦粗多糖DEAESepharose Fast Flow 柱层析的洗脱曲线Fig 1 Elution curve of the crude polysaccharides from Fagopyum esculentum by DEAE-SepharoseFast Flow column3.3 Sephacryl S-400 HR 凝胶柱层析纯化图2 荞麦多糖Sephacryl S-400 HR柱层析的洗脱曲线Fig2 Elu
13、tion curve of the purified polysaccharide from Fagopyum esculentum by Sephacryl S-400 HR column.由图1可见,荞麦粗多糖经DEAESepharose Fast Flow 柱层析后，通过梯度洗脱多糖成分 和蛋白质成分较好地分离。由图2可见，Sephacryl S-400 HR 凝胶柱层析后得到一个洗脱峰 且峰形对称，多糖含量高，在280nm 吸光光度值几乎为零，表明其蛋白质含量少。合并洗 脱峰FEP主峰部位，透吸，减压浓缩，乙醇沉淀，冷冻干燥，得到荞麦多糖FEP。通过苯酚 硫酸法测定多糖的含量98.5%
14、, AKTA快速液相蛋白层析仪在280nm处没有检测到有吸收峰， 考马司亮兰法也没有检测到蛋白质，说明分离纯化出的是多糖而不是糖肽。3.4 分子量的测定图 3 多糖分子量测定的标准曲线Fig 3 The calibration curve for determination the weight of FEP using standard dextrans经过Sephacryl S-400 HR层析，测得荞麦多糖FEP的洗脱体积Ve，根据Ve/Vo 值从标准曲线上求得荞麦多糖的相对分子量为1720442Da。4. 总结本文通过对一种水溶性荞麦多糖粗品用 Savag 法脱蛋白后，采用 DEAES
15、epharose Fast Flow 和 Sephacryl S-400 HR 柱层析纯化，经过凝胶柱色谱分析表明，FEP 为均一多糖。用 苯酚硫酸法测定多糖的含量，用 AKTA 快速液相蛋白层析仪的紫外检测器在 280nm 监测蛋 白质含量，结合柱层析能够快速优化分离纯化的条件。实验结果表明,得到纯度较高的荞麦 纯多糖 FEP，蛋白质含量极低。最后根据用不同分子量的标准葡聚糖的做出标准曲线，测定 出 FEP 分子量(Mw)为 1720442Da。参考文献1张志芬.浅谈天然药物的发展与中药研究.中国中药杂志，2005,30(17):1375-1377. 2林翠梧，蒋林斌，赵树凯.天然药物的研究
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21、纯化及其纯度鉴别与分子量测定J.药学通报1984,19(10):46-49.Isolation and Purification of a water-soluble Polysaccharide from Fagopyum esculentum and Determination of its molecular weightXu Wentao1, Zhang Fangfang 1, Huang Kunlun, Wang Ying, Luo Yunbo*College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultura
22、l University, Beijing（100083）AbstractIn this paper, a water-soluble crude polysaccharide, obtained from Fagopyum esculentum byboiling-water extraction and ethanol precipitation, was fractionated by DEAESepharose Fast Flow column chromatography, and purified by Sephacryl S-400 HR column chromatograph
23、y. It was showed only one symmetrical peak from gel-filtration chromatography, indicating that FEP was a homogeneous polysaccharide. The total sugar content of each tube was determined by the phenol-sulfuric acid assay and the protein content was detected by the UV detector at the wavelength of280 nm. The weight-average molecular weight (Mw) of the purified polysaccharide (FEP) was calculated to be 1720442 Da, according to the calibration curve with standard dextrans.Keywords：Fagopyum esculentum; Polysaccharide; Purification; Determination of molecular weights